脂多糖致肺血管内巨噬细胞释放炎症因子变化的研究
李胜亮 张淑琴 秦翠平 陈彬 陈正堂 金敬顺 伍伟玲
【摘要】 目的 探讨肺血管内巨噬细胞(PIM)在感染性急性肺损伤(ALI)发病中的作用。方法 按照Morton法分离、培养猪PIM，予10 mg/L脂多糖(LPS)刺激，酶联免疫吸附法(ELISA)测定肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)和IL8的含量。结果LPS刺激后，PIM释放TNFα、IL6和IL8增多，峰值分别出现在刺激后的1、4和6 h，与刺激前相比，差异均有显著性(P均<0.01)。结论 LPS刺激后，PIM分泌多种细胞因子，其中TNFα升高最早，提示其在ALI发病早期起重要作用；而IL6、IL8升高较晚，且后者持续时间较长，可能对ALI的病情进展起重要作用。细胞因子间的相互作用在ALI发病中似乎更为重要。
, 百拇医药 【关键词】肺血管内巨噬细胞；细胞因子；肺损伤，急性
Changes in inflammatory cytokines released by pulmonary intravascular macrophages after stimulation with lipopolysaccharide LI Shengliang, ZHANG Shuqin, QIN Cuiping, CHEN Bin， CHEN Zhengtang， JIN Jingshun, WU Weiling.The 517 th Hospital of PLA, Kelan 036301, Shanxi, China
【Abstract】Objective To investigate the roles of pulmonary intravascular macrophages (PIMs) in the pathogenesis of infective acute lung injury (ALI). Methods Porcine pulmonary blood vessels were flushed by modified Morton′s method, PIMs were isolated with adhesion method and incubated in RPMI 1640 medium. They were stimulated with lipopolysaccharide (LPS, 10 mg/L). The contents of interleukin6 (IL6), IL8 and tumor necrosis factorα (TNFα) in the culture supernatants were respectively measured by enzyme linked immunoadsorbent assay (ELISA). Results The release of TNFα, IL6 and IL8 by PIMs was increased significantly as compared with the levels before stimulation by LPS, peaking at 1, 4, and 6 hours after LPS stimulation, respectively. The differences were significant (all P<001). Conclusion Among the cytokines released by PIMs after LPS challenge, the increase in TNFα content occurs earlier in comparison with that of IL6 and IL8, suggesting that the former may play an important role at the early stage of ALI. On the other hand, the increase in IL6 and IL8 contents is later than that of TNFα and lasts for a longer time, suggesting that they may be associated with the development of ALI. The results also suggest that interaction of these cytokines is more important in the pathogenesis of ALI.
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【Key words】pulmonary intravascular macrophage;cytokine;acute lung injury
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是多种原因引起的严重急性肺损伤(ALI),其发病机制多被认为是机体在致病因子作用下发生的过度炎症反应,导致肺血管内皮和肺泡上皮广泛破坏的结果。这种过度的炎症反应涉及多种细胞及其介质,其中单核/巨噬细胞及其释放的众多细胞因子,以及炎症细胞和介质形成的级联反应在目前更受重视。肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophage，PIM)是肺巨噬细胞的亚群之一，其吞噬、分泌功能非常活跃，且由于它所处的特殊部位，在ALI中的作用尤为引人注目〔1〕。本实验拟在成功分离、培养猪PIM的基础上，观察脂多糖(LPS)刺激前后PIM培养液上清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)以及IL8的含量变化，旨在探讨这些炎症细胞因子在ALI中的作用。
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1 材料与方法1.1 PIM分离、培养及鉴定：按改良的Morton法分离和培养猪PIM〔2〕，用贴壁法获得黏附的PIM。苔盼蓝染色计数判断活力；瑞氏染色、非特异性脂酶染色及氟化钠抑制试验鉴定PIM并计算纯度。加LPS(Sigma，10 mg/L)于培养基中，取刺激前及刺激后5和30 min以及1、2、4、6和8 h的培养液上清，测定TNFα、IL6 和IL8的含量。
1.2 TNFα、IL6和IL8含量的测定：采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNFα、IL6和IL8含量，试剂盒均购自第四军医大学免疫学教研室。
1.3 统计学分析：实验数据以均数±标准差(x±s)表示，用单因素方差分析程序处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
LPS刺激前后PIM释放TNFα、IL6和IL8的变化见表1。LPS刺激后TNFα含量逐渐升高，1 h达峰值(P<0.01)；LPS刺激后4 h IL6含量升至刺激前的3倍(P<0.01)；刺激后4～8 h IL8持续升高，6 h达峰值(P<0.05或P<0.01)。
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3 讨论
3.1 TNFα在ALI中的作用：目前认为TNFα是介导ALI的主要细胞因子，给动物注射TNFα可诱发ALI，其病理改变酷似ARDS〔3〕。本实验结果显示，LPS刺激后1 h PIM分泌TNFα即显著升高，表明TNFα是ALI时最早诱生的细胞因子，在ALI发病早期起重要作用，故称之为前炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)。TNFα可作用于多形核白细胞(PMN)，使之脱颗粒，产生氧自由基及蛋白水解酶等炎症介质；还可上调内皮细胞白细胞黏附分子1及细胞间黏附分子1〔4〕,从而促进PMN与内皮细胞黏附，进而向肺内浸润，释放炎症介质，导致肺损伤。
3.2 IL6在ALI中的作用：研究表明，IL6对机体的作用有双重性：一方面，IL6促进PMN 氧化爆发和脱颗粒，亦可刺激肝细胞产生急性期蛋白，从而在ALI等急性炎症反应中起重要作用〔5〕；另一方面,IL6有抗炎效应〔6〕,如诱导皮质类固醇的合成，抑制T细胞活化，在体内外尚能抑制ILβ和TNFα的合成，预先用IL6抗体能增加实验动物的死亡率〔7〕。IL6的抗炎作用对于ALI过度炎症反应的控制无疑是十分重要的。但ALI时IL6在体内究竟是以抗炎作用为主还是以促炎作用为主，尚不清楚。IL6具有“双刃剑”作用，如何扬长避短，发挥IL6的有利作用，设法抑制其不利的作用，亦有待深入研究。
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3.3 IL8在ALI中的作用：IL8在PIM受LPS刺激后4～8 h持续升高，虽较TNFα晚，但持续时间长。IL8虽亦为PMN趋化剂和活化剂，但不似C5a等能被血清灭活，却可在肺局部积聚，对PMN发挥持续趋化和激活效应，且作用强于C5a。IL8还可增加L选择素白细胞黏附分子1时表达，促进整合素介导的PMN与内皮细胞黏附及PMN跨内皮向肺内浸润，导致ALI〔7〕。故IL8可能在ALI病情进展及预后转归上起更重要的作用。
3.4 3种细胞因子间相互作用及其在ALI发病中的意义：本实验结果表明，PIM受LPS刺激后分泌的3种细胞因子升高时间有先后，最早是TNFα,其次是IL6，最晚是IL8。这种先后顺序，一方面可能取决于PIM释放细胞因子的特性；另一方面可能与细胞因子间的相互作用有关。有资料表明，TNFα可刺激IL6和IL8的释放〔8〕，TNFα的致炎作用在一定程度上是由IL8介导的〔9〕。进一步分析上述细胞因子之间的关系时还发现，当由IL6升高达峰值时，TNFα却从峰值急剧下降，提示IL6对TNFα的释放有抑制作用〔10〕。这是否与前述的IL6抗炎作用有关，值得进一步探讨。
, 百拇医药
细胞因子间极为复杂的相互作用，形成细胞因子网络，相互诱生，相互制约，一旦平衡被打破，可发生细胞因子失控性释放，形成全身炎症反应综合征(SIRS)，在肺部则为ARDS或ALI。
由于革兰阴性(G-)菌是ARDS首要原发疾患或诱发因素，加之PIM在肺血管内的特殊部位，提示在G-菌脓毒症时，LPS首先激活PIM，使之释放TNFα、IL6和IL8等细胞因子,通过这些细胞因子直接和相互作用，在ALI或ARDS发病中可能有重要始动作用。
参考文献：
1 李胜亮,陈正堂,毛宝龄.肺血管内巨噬细胞与急性肺损伤〔J〕.国外医学呼吸系统分册，1996，16：197199.
2 李胜亮，陈正堂，金敬顺.肺血管内巨噬细胞的分离、培养及鉴定〔J〕.中华病理学杂志，1998，27：6667.
, 百拇医药
3 张青，徐剑铖，毛宝龄，等.内毒素致伤大鼠肺组织TNFα、IL6的mRNA表达及TNFIL6活化研究〔J〕.中国危重病急救医学，2001，13：523526.
4 孙中吉，卢青，李银平.急性呼吸窘迫综合征发病中的细胞因子和炎性介质〔J〕.中国危重病急救医学，2003，15：186189.
5 邱海波，周韶霞，陈德昌.白介素10对肺泡巨噬细胞致炎效应的调节作用〔J〕.中国危重病急救医学，2000，12：353355.
6 Barton B E,Shortall J,Jackson J V.Interleukin6 and 11 protect mice from mortality in a staphylococcal entertoxininduced toxic shock model〔J〕.Infect Immun,1996,64:714718.
, 百拇医药
7 Barton B E,Jackson J V.The protective role of IL6 in a septic shock model〔J〕.Infect Immun,1993,61:14961499.
8 黎檀实，尹明，吴旭辉，等.生长激素对酸吸入性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的作用〔J〕.中国危重病急救医学，2002，14：728731.
9 李胜亮，陈正堂.IL8与急性呼吸窘迫综合征〔J〕.国外医学呼吸系统分册，1997，17：8593.
10 Conroy D M,Francischi J N,Sirois P.Effect of tumor necrosis factor receptor binding protein on cell infiltration induced by lipopolysaccharide and sephadex beads in guinea pig lung〔J〕.Inflammation,1995,19:233243
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800064)
作者单位：036301山西岢岚，解放军第五一七医院内科(李胜亮，张淑琴，秦翠平，陈彬)；400037重庆，第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所(陈正堂，金敬顺，伍伟玲)
作者简介：李胜亮，男，主任医师，全军呼吸内科专业委员会委员，总装备部内科专业委员会副主任委员，主要研究方向为急性呼吸窘迫综合征。, http://www.100md.com
【摘要】 目的 探讨肺血管内巨噬细胞(PIM)在感染性急性肺损伤(ALI)发病中的作用。方法 按照Morton法分离、培养猪PIM，予10 mg/L脂多糖(LPS)刺激，酶联免疫吸附法(ELISA)测定肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)和IL8的含量。结果LPS刺激后，PIM释放TNFα、IL6和IL8增多，峰值分别出现在刺激后的1、4和6 h，与刺激前相比，差异均有显著性(P均<0.01)。结论 LPS刺激后，PIM分泌多种细胞因子，其中TNFα升高最早，提示其在ALI发病早期起重要作用；而IL6、IL8升高较晚，且后者持续时间较长，可能对ALI的病情进展起重要作用。细胞因子间的相互作用在ALI发病中似乎更为重要。
, 百拇医药 【关键词】肺血管内巨噬细胞；细胞因子；肺损伤，急性
Changes in inflammatory cytokines released by pulmonary intravascular macrophages after stimulation with lipopolysaccharide LI Shengliang, ZHANG Shuqin, QIN Cuiping, CHEN Bin， CHEN Zhengtang， JIN Jingshun, WU Weiling.The 517 th Hospital of PLA, Kelan 036301, Shanxi, China
【Abstract】Objective To investigate the roles of pulmonary intravascular macrophages (PIMs) in the pathogenesis of infective acute lung injury (ALI). Methods Porcine pulmonary blood vessels were flushed by modified Morton′s method, PIMs were isolated with adhesion method and incubated in RPMI 1640 medium. They were stimulated with lipopolysaccharide (LPS, 10 mg/L). The contents of interleukin6 (IL6), IL8 and tumor necrosis factorα (TNFα) in the culture supernatants were respectively measured by enzyme linked immunoadsorbent assay (ELISA). Results The release of TNFα, IL6 and IL8 by PIMs was increased significantly as compared with the levels before stimulation by LPS, peaking at 1, 4, and 6 hours after LPS stimulation, respectively. The differences were significant (all P<001). Conclusion Among the cytokines released by PIMs after LPS challenge, the increase in TNFα content occurs earlier in comparison with that of IL6 and IL8, suggesting that the former may play an important role at the early stage of ALI. On the other hand, the increase in IL6 and IL8 contents is later than that of TNFα and lasts for a longer time, suggesting that they may be associated with the development of ALI. The results also suggest that interaction of these cytokines is more important in the pathogenesis of ALI.
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【Key words】pulmonary intravascular macrophage;cytokine;acute lung injury
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是多种原因引起的严重急性肺损伤(ALI),其发病机制多被认为是机体在致病因子作用下发生的过度炎症反应,导致肺血管内皮和肺泡上皮广泛破坏的结果。这种过度的炎症反应涉及多种细胞及其介质,其中单核/巨噬细胞及其释放的众多细胞因子,以及炎症细胞和介质形成的级联反应在目前更受重视。肺血管内巨噬细胞(pulmonary intravascular macrophage，PIM)是肺巨噬细胞的亚群之一，其吞噬、分泌功能非常活跃，且由于它所处的特殊部位，在ALI中的作用尤为引人注目〔1〕。本实验拟在成功分离、培养猪PIM的基础上，观察脂多糖(LPS)刺激前后PIM培养液上清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素6(IL6)以及IL8的含量变化，旨在探讨这些炎症细胞因子在ALI中的作用。
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1 材料与方法1.1 PIM分离、培养及鉴定：按改良的Morton法分离和培养猪PIM〔2〕，用贴壁法获得黏附的PIM。苔盼蓝染色计数判断活力；瑞氏染色、非特异性脂酶染色及氟化钠抑制试验鉴定PIM并计算纯度。加LPS(Sigma，10 mg/L)于培养基中，取刺激前及刺激后5和30 min以及1、2、4、6和8 h的培养液上清，测定TNFα、IL6 和IL8的含量。
1.2 TNFα、IL6和IL8含量的测定：采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNFα、IL6和IL8含量，试剂盒均购自第四军医大学免疫学教研室。
1.3 统计学分析：实验数据以均数±标准差(x±s)表示，用单因素方差分析程序处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
LPS刺激前后PIM释放TNFα、IL6和IL8的变化见表1。LPS刺激后TNFα含量逐渐升高，1 h达峰值(P<0.01)；LPS刺激后4 h IL6含量升至刺激前的3倍(P<0.01)；刺激后4～8 h IL8持续升高，6 h达峰值(P<0.05或P<0.01)。
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3 讨论
3.1 TNFα在ALI中的作用：目前认为TNFα是介导ALI的主要细胞因子，给动物注射TNFα可诱发ALI，其病理改变酷似ARDS〔3〕。本实验结果显示，LPS刺激后1 h PIM分泌TNFα即显著升高，表明TNFα是ALI时最早诱生的细胞因子，在ALI发病早期起重要作用，故称之为前炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)。TNFα可作用于多形核白细胞(PMN)，使之脱颗粒，产生氧自由基及蛋白水解酶等炎症介质；还可上调内皮细胞白细胞黏附分子1及细胞间黏附分子1〔4〕,从而促进PMN与内皮细胞黏附，进而向肺内浸润，释放炎症介质，导致肺损伤。
3.2 IL6在ALI中的作用：研究表明，IL6对机体的作用有双重性：一方面，IL6促进PMN 氧化爆发和脱颗粒，亦可刺激肝细胞产生急性期蛋白，从而在ALI等急性炎症反应中起重要作用〔5〕；另一方面,IL6有抗炎效应〔6〕,如诱导皮质类固醇的合成，抑制T细胞活化，在体内外尚能抑制ILβ和TNFα的合成，预先用IL6抗体能增加实验动物的死亡率〔7〕。IL6的抗炎作用对于ALI过度炎症反应的控制无疑是十分重要的。但ALI时IL6在体内究竟是以抗炎作用为主还是以促炎作用为主，尚不清楚。IL6具有“双刃剑”作用，如何扬长避短，发挥IL6的有利作用，设法抑制其不利的作用，亦有待深入研究。
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3.3 IL8在ALI中的作用：IL8在PIM受LPS刺激后4～8 h持续升高，虽较TNFα晚，但持续时间长。IL8虽亦为PMN趋化剂和活化剂，但不似C5a等能被血清灭活，却可在肺局部积聚，对PMN发挥持续趋化和激活效应，且作用强于C5a。IL8还可增加L选择素白细胞黏附分子1时表达，促进整合素介导的PMN与内皮细胞黏附及PMN跨内皮向肺内浸润，导致ALI〔7〕。故IL8可能在ALI病情进展及预后转归上起更重要的作用。
3.4 3种细胞因子间相互作用及其在ALI发病中的意义：本实验结果表明，PIM受LPS刺激后分泌的3种细胞因子升高时间有先后，最早是TNFα,其次是IL6，最晚是IL8。这种先后顺序，一方面可能取决于PIM释放细胞因子的特性；另一方面可能与细胞因子间的相互作用有关。有资料表明，TNFα可刺激IL6和IL8的释放〔8〕，TNFα的致炎作用在一定程度上是由IL8介导的〔9〕。进一步分析上述细胞因子之间的关系时还发现，当由IL6升高达峰值时，TNFα却从峰值急剧下降，提示IL6对TNFα的释放有抑制作用〔10〕。这是否与前述的IL6抗炎作用有关，值得进一步探讨。
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细胞因子间极为复杂的相互作用，形成细胞因子网络，相互诱生，相互制约，一旦平衡被打破，可发生细胞因子失控性释放，形成全身炎症反应综合征(SIRS)，在肺部则为ARDS或ALI。
由于革兰阴性(G-)菌是ARDS首要原发疾患或诱发因素，加之PIM在肺血管内的特殊部位，提示在G-菌脓毒症时，LPS首先激活PIM，使之释放TNFα、IL6和IL8等细胞因子,通过这些细胞因子直接和相互作用，在ALI或ARDS发病中可能有重要始动作用。
参考文献：
1 李胜亮,陈正堂,毛宝龄.肺血管内巨噬细胞与急性肺损伤〔J〕.国外医学呼吸系统分册，1996，16：197199.
2 李胜亮，陈正堂，金敬顺.肺血管内巨噬细胞的分离、培养及鉴定〔J〕.中华病理学杂志，1998，27：6667.
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3 张青，徐剑铖，毛宝龄，等.内毒素致伤大鼠肺组织TNFα、IL6的mRNA表达及TNFIL6活化研究〔J〕.中国危重病急救医学，2001，13：523526.
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6 Barton B E,Shortall J,Jackson J V.Interleukin6 and 11 protect mice from mortality in a staphylococcal entertoxininduced toxic shock model〔J〕.Infect Immun,1996,64:714718.
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7 Barton B E,Jackson J V.The protective role of IL6 in a septic shock model〔J〕.Infect Immun,1993,61:14961499.
8 黎檀实，尹明，吴旭辉，等.生长激素对酸吸入性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡的作用〔J〕.中国危重病急救医学，2002，14：728731.
9 李胜亮，陈正堂.IL8与急性呼吸窘迫综合征〔J〕.国外医学呼吸系统分册，1997，17：8593.
10 Conroy D M,Francischi J N,Sirois P.Effect of tumor necrosis factor receptor binding protein on cell infiltration induced by lipopolysaccharide and sephadex beads in guinea pig lung〔J〕.Inflammation,1995,19:233243
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800064)
作者单位：036301山西岢岚，解放军第五一七医院内科(李胜亮，张淑琴，秦翠平，陈彬)；400037重庆，第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所(陈正堂，金敬顺，伍伟玲)
作者简介：李胜亮，男，主任医师，全军呼吸内科专业委员会委员，总装备部内科专业委员会副主任委员，主要研究方向为急性呼吸窘迫综合征。, http://www.100md.com