金消方对小鼠Lewis肺癌增殖及凋亡作用的实验研究
【摘 要】 目的 观察金消方对小鼠Lewis肺癌增殖及凋亡的影响。方法 50只小鼠复制Lewis肺癌小鼠模型,随机分为5组：空白对照组、单纯化疗组、金消方高剂量组、金消方低剂量组和金消方化疗组各10只。空白对照组给予生理盐水腹腔注射；单纯化疗组给予顺铂1 mg/kg腹腔注射；金消方高、低剂量组分别给予金消方25 g/kg和12.5 g/kg灌胃；金消方化疗组给予金消方25 g/kg灌胃+顺铂1 mg/kg隔日腹腔注射。15天后采用免疫组化及流式细胞检测方法，对抑瘤率、增殖细胞核抗原(PCNA)指数及凋亡率进行检测。结果 金消方化疗组抑瘤率及凋亡率明显高于单纯化疗组和金消方高、低剂量组，PCNA明显降低(P<0.05)。金消方高、低剂量组与单纯化疗组比较，抑瘤率、凋亡率及PCNA均较低(P<0.05)。结论 诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖可能是金消方治疗肺癌的分子机制之一，与化疗药合用有协同增效作用。
【关键词】 Lewis肺癌；金消方；增殖细胞核抗原；细胞凋亡；小鼠
Experimental study on effect of Jinxiaofang on proliferation and apoptosis in mice with Lewis lung cancer LIU Jingxuan，FAN Huanfang，YANG Liyun,et al.Department of Oncology, TCM Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011，China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Jinxiaofang on proliferation and apoptosis in mice with Lewis lung cancer.Methods The Lewis lung cancer models were made in 50 mice and were randomly divided into five groups: normal group, control group, highdose Jinxiaofang group,lowdose Jinxiaofang group and treatment group.The normal group were given saline by intraperitoneal injection,the control group were given cisplatin 1 mg/kg by intraperitoneal injection,the highdose Jinxiaofang group and lowdose Jinxiaofang group were given Jinxiaofang 25 g/kg and 12.5 g/kg by gavage respectively,the treatment group were given Jinxiaofang 25 g/kg and cisplatin 1 mg/kg by intraperitoneal injection every other day.After 15day's treatment.The inhibitory tumor rate,proliferating cell nuclear antigen (PCNA) index and apoptotic rate were detected by immunohistochemistry and flow cytometry.Results The inhibitory tumor rate and apoptotic rate in treatment group were significantly higher than those of control group, highdose Jinxiaofang group and lowdose Jinxiaofang group (P<0.05),however, PCNA index in treatment group was significantly lower(P<0.05).Compared with control group,the inhibitory tumor rate,apopototic rate and PCNA index in highdose Jinxiaofang group and lowdose Jinxiaofang group were lower (P<0.05).Conclusion Jinxiaofang can significantly induce cell apoptosis,inhibit the proliferation of tumor cells, which may be one of the antineoplastic mechanisms.Jinxiaofang combined with chemotherapeutic drugs may increase therapeutic effect.
【Key word】 Lewis lung cancer；Jinxiaofang；Proliferating cell nuclear antigen；Apoptosis；Mouse
肿瘤的发生发展与细胞的增殖、分化和凋亡失衡有关。增殖细胞核抗原(PCNA)反映了细胞增殖活性,可用于肿瘤良恶性的鉴别、肿瘤恶化程度及预后评估；细胞凋亡是在多种基因调控下发生的细胞主动死亡过程。金消方是我们多年来临床治疗肺癌的有效方剂,为进一步探讨其作用机理,我们复制小鼠Lewis肺癌模型,采用免疫组化及流式细胞检测方法,通过对抑瘤率、PCNA指数、凋亡率的检测,观察中药金消方对肺癌小鼠的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠50只,体重18～22 g,由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 实验用药 金消方(主要由黄芪、沙参、苦参、龙葵、石上柏、丹参、生牡蛎、灵芝等组成),由河北省中医院提供,并经河北医科大学中医学院中药系鉴定,符合国家药典标准,上述药物以一定比例混合后,按汤剂的要求水煎后浓缩，每ml含生药2.5 g。
1.3 主要试剂和仪器 免疫组化PCNA单克隆抗体(购自丹麦DAKO公司)；福尔马林、DAB显示剂(购自中山公司)；Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株(购自中国医学科学院药物研究所)；HPIAS1000图像分析仪(武汉清平影像技术有限责任公司产品)；SE型Facsvantage 流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司产品)。
1.4 动物模型复制与分组处理 Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株从冻存的液氮内取出，复苏后分别接种于5只C57BL小鼠左后肢皮下,待瘤体长至直径1～1.5 cm时，处死小鼠，选择生长良好的瘤组织，剪成瘤组织小块，用200目不锈钢筛网摩擦，过滤制成单细胞悬液，活瘤细胞计数为2×106个/ml，接种于50只昆明种小鼠右腋皮下，每只0.2ml。接种次日将小鼠随机分为5组：空白对照组、单纯化疗组、金消方高剂量组、金消方低剂量组以及金消方化疗组,每组10只。3天后用药, 单纯化疗组及金消方化疗组隔日腹腔注射化疗药顺铂(DDP)1 mg/kg(稀释为每ml含药0.1 mg)至处死日,空白对照组隔日腹腔注射等体积的生理盐水。金消方高剂量组及金消方化疗组每日灌胃金消方25 g/kg(稀释为每ml含生药2.5 g,相当于成人剂量的20倍)；金消方低剂量组每日灌胃金消方12.5 g/kg(每ml含生药1.25 g,相当于成人剂量的10倍)，连续15天。停药次日处死小鼠,剥离肿瘤,称瘤重量,计算肿瘤抑制率[1]。
1.5 PCNA免疫组化染色 留取各组小鼠肿瘤标本用福尔马林固定,常规脱水包埋,厚4 μm连续切片,酶标链霉亲合素—生物素技术进行免疫组化染色。显微镜下观察,细胞核呈棕色者为阳性；细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在镜下选择均匀的视野,循序在1 000个细胞中计数阳性细胞的个数，计算PCNA指数：PCNA指数=100%×PCNA阳性细胞数/肿瘤细胞数。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组小鼠的瘤组织用匀浆法制成单细胞悬液,细胞数为106～107个/ml；PBS洗3次,离心10 min,去上清;加75%的酒精固定,放入冰盒中送检。检测瘤细胞凋亡率。
1.7 统计学处理 使用SPSS 11.5统计软件，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著意义。
2 结 果
2.1 不同治疗对肿瘤细胞的抑制作用 金消方化疗组及金消方高剂量组接种后移植瘤出现较空白对照组晚5天。金消方高、低剂量组及单纯化疗组及金消方化疗组移植瘤体积和瘤重与空白对照组相比均明显降低,差异有显著意义(P<0.05)；金消方化疗组及金消方高、低剂量组与单纯化疗组相比，差异有显著意义(P<0.05)；金消方化疗组移植瘤体积和瘤重低于金消方高、低剂量组。金消方化疗组抑瘤率明显高于单纯化疗组和金消方高、低剂量组(P<0.05)。见表1。 表1 不同治疗对肿瘤细胞的抑制作用P<0.05；与单纯化疗组比较，△P<0.05；与金消方高、低剂量组比较，＃P<0.05
2.2 不同治疗对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响 金消方高、低剂量组及单纯化疗组、金消方化疗组肿瘤细胞PCNA指数及凋亡率与空白对照组相比差异有显著意义(P<0.05)，金消方化疗组及金消方高、低剂量组与单纯化疗组相比，差异有显著意义(P<0.05)。金消方化疗组优于金消方高、低剂量组(P<0.05)。见表2。表2 不同治疗方法对肿瘤细胞PCNA指数及 凋亡率的影响注：与空白对照组比较，P<0.05；与单纯化疗组比较，△P<0.05；与金消方高、低剂量组比较，＃P<0.05
3 讨 论
肺癌是临床常见恶性肿瘤之一,属于中医学中的“肺积”、“息贲”等范畴。其发生多因正气虚损,阴阳失调,六淫之邪乘虚而入,导致肺脏功能失调,宣降失司,气机不畅,导致血行受阻,津液失于输布,津聚为痰,痰凝气滞,淤阻脉络,痰气瘀毒胶结日久形成肺肿块。因此,肺癌是一种全身属虚、局部属实的疾病，治疗原则当扶正祛邪。我们采用具有益气养阴、解毒祛瘀作用的金消方为研究对象。方中黄芪、沙参益气养阴,苦参、龙葵、石上柏清热解毒。现代医学研究证明，益气活血类中药具有抑瘤作用[2]。苦参的主要成分苦参碱具有广泛的生物学特性和药理作用,其中包括可诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖、影响细胞周期、诱导凋亡等[3]作用。
PCNA是一种在细胞周期S期广泛表达的细胞核内蛋白,是DNA多聚酶δ的辅助因子。PCNA表达阳性级别越高, DNA含量及多倍体分布亦越高[4]，其含量和表达程度反映了细胞的增殖活性,因此可以作为评价细胞增殖状态的一项指标[5，6]。细胞凋亡是在多种基因调控下发生的细胞主动死亡过程,是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一[7]。近年来的研究表明诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的新靶点。
本实验复制Lewis肺癌小鼠模型,随机进行分组,采用免疫组化及流式细胞检测方法,观察金消方对抑瘤率、PCNA指数及凋亡率的影响。结果表明金消方能明显提高小鼠抑瘤率及凋亡率,降低PCNA指数。提示金消方抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长的可能机制是通过抑制PCNA蛋白的表达,从而降低DNA聚合酶δ的活性,干扰肿瘤细胞DNA的合成,从而抑制肿瘤细胞的增殖。
本实验单纯化疗组采用了顺铂,顺铂是治疗恶性肿瘤的主要化疗药物之一,其作用机制通常认为是通过与癌细丙的DNA结合形成交联,从而破坏DNA的功能,阻止DNA的复制[8]。有报道认为,顺铂还有诱导癌细胞凋亡等作用[9～11]。本研究结果显示,单纯化疗组对PCNA表达的抑制作用不如金消方化疗组显著,提示金消方化疗组对肿瘤有较强的抑制作用，金消方与化疗药合用有协同增效作用。
参考文献
1 徐叔云,卞如濂,陈修，主编.药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社,2003.1 7571 784.
2 刘春英,董明,蔡硕，等.益气、活血、益气活血类中药复方对S180荷瘤小鼠免疫抑瘤作用的比较研究[J].中国中医基础医学杂志,2003,9(7):4850.
3 Ko WG,Kang TH,Kim NY,et al.Lavandululflavonoids:a new class of in vitro apoptogenic agents from sophora flavescens[J].Toxicol In Vitro,2000,14(5):429433.
4 Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cellcycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J].Nature,1993,366(6 456):704707.
5 Lukad J,Bartkova J,Rohde M,et al.Cyclin Dl is dispensable for Gl control in retinoblastoma genedeficient cells independently of cdk4 activity[J].Molecular Cellular Biol,1995,15(5):2 6002 611.
6 唐元升，李吉发，朱兴雷，等.实验家兔血管球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和迁移及通心络对其影响[J].疑难病杂志，2004，3(2)：6972.
7 Ferber D.Cancer research.A new way to combat therapy side effects[J].Science,1999,285(5 434):268272.
8 陆晓和，主编.实用临床用药监护[M].北京:人民卫生出版社,2003.520.
9 庞荣清,刘春生,潘兴华，等.顺铂对人肺腺癌细胞SLC89细胞周期、p21及cmyc表达的影响[J].肿瘤防治研究,2003,30(4):280284.
10 邹丽娟,董志,陈亚敏.顺铂对肝癌细胞凋亡及其细胞周期的影响[J].临床肿瘤学杂志,2002,7(4):267269.
11 荆新建，任中海，杜敏.金喜善联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌56例近期疗效观察[J].中国全科医学，2004，7(20)：1 504.
作者单位： 050011 石家庄 河北医科大学中医院肿瘤内科(刘经选，范焕芳，胡冬菊，孙春霞，牛黎明，王艳君)； 050017 石家庄 河北医科大学研究生学院(杨丽芸), http://www.100md.com(刘经选 范焕芳 杨丽芸 胡冬菊 孙春霞 牛黎明 王)
【关键词】 Lewis肺癌；金消方；增殖细胞核抗原；细胞凋亡；小鼠
Experimental study on effect of Jinxiaofang on proliferation and apoptosis in mice with Lewis lung cancer LIU Jingxuan，FAN Huanfang，YANG Liyun,et al.Department of Oncology, TCM Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011，China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Jinxiaofang on proliferation and apoptosis in mice with Lewis lung cancer.Methods The Lewis lung cancer models were made in 50 mice and were randomly divided into five groups: normal group, control group, highdose Jinxiaofang group,lowdose Jinxiaofang group and treatment group.The normal group were given saline by intraperitoneal injection,the control group were given cisplatin 1 mg/kg by intraperitoneal injection,the highdose Jinxiaofang group and lowdose Jinxiaofang group were given Jinxiaofang 25 g/kg and 12.5 g/kg by gavage respectively,the treatment group were given Jinxiaofang 25 g/kg and cisplatin 1 mg/kg by intraperitoneal injection every other day.After 15day's treatment.The inhibitory tumor rate,proliferating cell nuclear antigen (PCNA) index and apoptotic rate were detected by immunohistochemistry and flow cytometry.Results The inhibitory tumor rate and apoptotic rate in treatment group were significantly higher than those of control group, highdose Jinxiaofang group and lowdose Jinxiaofang group (P<0.05),however, PCNA index in treatment group was significantly lower(P<0.05).Compared with control group,the inhibitory tumor rate,apopototic rate and PCNA index in highdose Jinxiaofang group and lowdose Jinxiaofang group were lower (P<0.05).Conclusion Jinxiaofang can significantly induce cell apoptosis,inhibit the proliferation of tumor cells, which may be one of the antineoplastic mechanisms.Jinxiaofang combined with chemotherapeutic drugs may increase therapeutic effect.
【Key word】 Lewis lung cancer；Jinxiaofang；Proliferating cell nuclear antigen；Apoptosis；Mouse
肿瘤的发生发展与细胞的增殖、分化和凋亡失衡有关。增殖细胞核抗原(PCNA)反映了细胞增殖活性,可用于肿瘤良恶性的鉴别、肿瘤恶化程度及预后评估；细胞凋亡是在多种基因调控下发生的细胞主动死亡过程。金消方是我们多年来临床治疗肺癌的有效方剂,为进一步探讨其作用机理,我们复制小鼠Lewis肺癌模型,采用免疫组化及流式细胞检测方法,通过对抑瘤率、PCNA指数、凋亡率的检测,观察中药金消方对肺癌小鼠的干预作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠50只,体重18～22 g,由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 实验用药 金消方(主要由黄芪、沙参、苦参、龙葵、石上柏、丹参、生牡蛎、灵芝等组成),由河北省中医院提供,并经河北医科大学中医学院中药系鉴定,符合国家药典标准,上述药物以一定比例混合后,按汤剂的要求水煎后浓缩，每ml含生药2.5 g。
1.3 主要试剂和仪器 免疫组化PCNA单克隆抗体(购自丹麦DAKO公司)；福尔马林、DAB显示剂(购自中山公司)；Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株(购自中国医学科学院药物研究所)；HPIAS1000图像分析仪(武汉清平影像技术有限责任公司产品)；SE型Facsvantage 流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司产品)。
1.4 动物模型复制与分组处理 Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株从冻存的液氮内取出，复苏后分别接种于5只C57BL小鼠左后肢皮下,待瘤体长至直径1～1.5 cm时，处死小鼠，选择生长良好的瘤组织，剪成瘤组织小块，用200目不锈钢筛网摩擦，过滤制成单细胞悬液，活瘤细胞计数为2×106个/ml，接种于50只昆明种小鼠右腋皮下，每只0.2ml。接种次日将小鼠随机分为5组：空白对照组、单纯化疗组、金消方高剂量组、金消方低剂量组以及金消方化疗组,每组10只。3天后用药, 单纯化疗组及金消方化疗组隔日腹腔注射化疗药顺铂(DDP)1 mg/kg(稀释为每ml含药0.1 mg)至处死日,空白对照组隔日腹腔注射等体积的生理盐水。金消方高剂量组及金消方化疗组每日灌胃金消方25 g/kg(稀释为每ml含生药2.5 g,相当于成人剂量的20倍)；金消方低剂量组每日灌胃金消方12.5 g/kg(每ml含生药1.25 g,相当于成人剂量的10倍)，连续15天。停药次日处死小鼠,剥离肿瘤,称瘤重量,计算肿瘤抑制率[1]。
1.5 PCNA免疫组化染色 留取各组小鼠肿瘤标本用福尔马林固定,常规脱水包埋,厚4 μm连续切片,酶标链霉亲合素—生物素技术进行免疫组化染色。显微镜下观察,细胞核呈棕色者为阳性；细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在镜下选择均匀的视野,循序在1 000个细胞中计数阳性细胞的个数，计算PCNA指数：PCNA指数=100%×PCNA阳性细胞数/肿瘤细胞数。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组小鼠的瘤组织用匀浆法制成单细胞悬液,细胞数为106～107个/ml；PBS洗3次,离心10 min,去上清;加75%的酒精固定,放入冰盒中送检。检测瘤细胞凋亡率。
1.7 统计学处理 使用SPSS 11.5统计软件，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著意义。
2 结 果
2.1 不同治疗对肿瘤细胞的抑制作用 金消方化疗组及金消方高剂量组接种后移植瘤出现较空白对照组晚5天。金消方高、低剂量组及单纯化疗组及金消方化疗组移植瘤体积和瘤重与空白对照组相比均明显降低,差异有显著意义(P<0.05)；金消方化疗组及金消方高、低剂量组与单纯化疗组相比，差异有显著意义(P<0.05)；金消方化疗组移植瘤体积和瘤重低于金消方高、低剂量组。金消方化疗组抑瘤率明显高于单纯化疗组和金消方高、低剂量组(P<0.05)。见表1。 表1 不同治疗对肿瘤细胞的抑制作用P<0.05；与单纯化疗组比较，△P<0.05；与金消方高、低剂量组比较，＃P<0.05
2.2 不同治疗对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响 金消方高、低剂量组及单纯化疗组、金消方化疗组肿瘤细胞PCNA指数及凋亡率与空白对照组相比差异有显著意义(P<0.05)，金消方化疗组及金消方高、低剂量组与单纯化疗组相比，差异有显著意义(P<0.05)。金消方化疗组优于金消方高、低剂量组(P<0.05)。见表2。表2 不同治疗方法对肿瘤细胞PCNA指数及 凋亡率的影响注：与空白对照组比较，P<0.05；与单纯化疗组比较，△P<0.05；与金消方高、低剂量组比较，＃P<0.05
3 讨 论
肺癌是临床常见恶性肿瘤之一,属于中医学中的“肺积”、“息贲”等范畴。其发生多因正气虚损,阴阳失调,六淫之邪乘虚而入,导致肺脏功能失调,宣降失司,气机不畅,导致血行受阻,津液失于输布,津聚为痰,痰凝气滞,淤阻脉络,痰气瘀毒胶结日久形成肺肿块。因此,肺癌是一种全身属虚、局部属实的疾病，治疗原则当扶正祛邪。我们采用具有益气养阴、解毒祛瘀作用的金消方为研究对象。方中黄芪、沙参益气养阴,苦参、龙葵、石上柏清热解毒。现代医学研究证明，益气活血类中药具有抑瘤作用[2]。苦参的主要成分苦参碱具有广泛的生物学特性和药理作用,其中包括可诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖、影响细胞周期、诱导凋亡等[3]作用。
PCNA是一种在细胞周期S期广泛表达的细胞核内蛋白,是DNA多聚酶δ的辅助因子。PCNA表达阳性级别越高, DNA含量及多倍体分布亦越高[4]，其含量和表达程度反映了细胞的增殖活性,因此可以作为评价细胞增殖状态的一项指标[5，6]。细胞凋亡是在多种基因调控下发生的细胞主动死亡过程,是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一[7]。近年来的研究表明诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的新靶点。
本实验复制Lewis肺癌小鼠模型,随机进行分组,采用免疫组化及流式细胞检测方法,观察金消方对抑瘤率、PCNA指数及凋亡率的影响。结果表明金消方能明显提高小鼠抑瘤率及凋亡率,降低PCNA指数。提示金消方抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤生长的可能机制是通过抑制PCNA蛋白的表达,从而降低DNA聚合酶δ的活性,干扰肿瘤细胞DNA的合成,从而抑制肿瘤细胞的增殖。
本实验单纯化疗组采用了顺铂,顺铂是治疗恶性肿瘤的主要化疗药物之一,其作用机制通常认为是通过与癌细丙的DNA结合形成交联,从而破坏DNA的功能,阻止DNA的复制[8]。有报道认为,顺铂还有诱导癌细胞凋亡等作用[9～11]。本研究结果显示,单纯化疗组对PCNA表达的抑制作用不如金消方化疗组显著,提示金消方化疗组对肿瘤有较强的抑制作用，金消方与化疗药合用有协同增效作用。
参考文献
1 徐叔云,卞如濂,陈修，主编.药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社,2003.1 7571 784.
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5 Lukad J,Bartkova J,Rohde M,et al.Cyclin Dl is dispensable for Gl control in retinoblastoma genedeficient cells independently of cdk4 activity[J].Molecular Cellular Biol,1995,15(5):2 6002 611.
6 唐元升，李吉发，朱兴雷，等.实验家兔血管球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和迁移及通心络对其影响[J].疑难病杂志，2004，3(2)：6972.
7 Ferber D.Cancer research.A new way to combat therapy side effects[J].Science,1999,285(5 434):268272.
8 陆晓和，主编.实用临床用药监护[M].北京:人民卫生出版社,2003.520.
9 庞荣清,刘春生,潘兴华，等.顺铂对人肺腺癌细胞SLC89细胞周期、p21及cmyc表达的影响[J].肿瘤防治研究,2003,30(4):280284.
10 邹丽娟,董志,陈亚敏.顺铂对肝癌细胞凋亡及其细胞周期的影响[J].临床肿瘤学杂志,2002,7(4):267269.
11 荆新建，任中海，杜敏.金喜善联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌56例近期疗效观察[J].中国全科医学，2004，7(20)：1 504.
作者单位： 050011 石家庄 河北医科大学中医院肿瘤内科(刘经选，范焕芳，胡冬菊，孙春霞，牛黎明，王艳君)； 050017 石家庄 河北医科大学研究生学院(杨丽芸), http://www.100md.com(刘经选 范焕芳 杨丽芸 胡冬菊 孙春霞 牛黎明 王)