α肾上腺素受体在脊髓损伤大鼠血管高反应性中的作用
邹最 石学银 吕砚 徐振东 时多 王璐 刘刚
【摘要】 目的 研究高位脊髓横切(SCT)慢性期大鼠腹主动脉离体血管环对α肾上腺素受体(αAR)激动剂的反应性及腹主动脉α1AR、α2AR各亚型mRNA的表达量，探讨其与腹主动脉高反应性的关系。方法 取SCT 4周后大鼠的腹主动脉，利用离体血管环张力测定技术，以血管环对梯度浓度去氧肾上腺素(Phe)和可乐定的收缩力，反映血管环对α1AR、α2AR激动剂的反应性；通过实时定量聚合酶链反应(PCR)测定腹主动脉α1AAR、α1BAR、α1DAR、α2AAR、α2BAR和α2CAR的mRNA表达量改变，并与假手术组比较。结果 与假手术组比较，SCT 4周组大鼠腹主动脉对可乐定反应性上升(P<0.05 或 P<0.01)，对Phe反应性无明显改变；SCT组腹主动脉α1AAR和α1DAR的mRNA表达上调(P<0.05或P<0.01)，而α1BAR mRNA表达未见明显改变(P>0.05)，α2AAR、α2BAR和α2CAR的mRNA表达均上调(P<0.05或P<0.01)。结论 在SCT慢性期，腹主动脉高反应性的机制可能为血管对α2AR激动剂敏感性上升，α2AR mRNA表达上调。虽然α1AR mRNA表达上调，但离体血管对Phe收缩力无明显改变，α1AR可能并不是引起SCT慢性期血管高反应性的原因。
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【关键词】 脊髓横切；自主神经反射异常；α肾上腺素受体；血管反应性
Role of alphaadrenergic receptors in vascular hyperreactivity in rats with high level spinal injury ZOU Zui, SHI Xueyin, LU Yan, XU Zhendong, SHI Duo, WANG Lu, LIU Gang.Department of Anaesthesiology, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Corresponding author: SHI Xueyin (Email: shixueyin1128 @yahoo.com.cn)：：：
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【Abstract】 Objective To explore the vascular reactivity of abdominal aorta to agonists of αadrenergic receptors in rat with high level transection of the spimal cord ,and to quantify the expression of αAR mRNA subtypes, in order to investigate relationship between αAR and hyperreactivity of abdominal aorta. Methods Four weeks after transection of the spinal cord at the level of 4th thoracic vertebra, the rats were sacrificed, and abdominal aorta rings were adopted to assay sensitivity to phenylephrine and clonidine with isolated organ perfusion system. α1AAR, α1BAR, α1DAR, α2AAR, α2BAR,α2CAR mRNA expressions were quantified by real time polymerase chain reaction (PCR). Results Compared with abdominal aorta, of rat with sham operation, reactivity of aorta of rat after transection of spinal cord to clonidine was significantly higher(P<0.05 or P<0.01), but difference of vascular reactivity to phenylephrine between them was not significant (P>0.05). Expressions of α1AAR mRNA, α1DAR mRNA, α2AAR mRNA， α2BAR mRNA， α2CAR mRNA were significantly higher(P<0.05 or P<0.01), while the expression of α1BAR mRNA did not vary significantly. Conclusion Vascular hyperreactivity to agonist of α2AR may be the mechanism of hyperreactivity of abdominal aorta in rat after transection of spinal cord. Although α1AR mRNA expression is higher in aorta of rat with spinal cord injury, vascular hyperreactivity is not the result of upregulation of α1AR sensitivity.
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【Key words】 spinal cord transection;autonomic dysreflexia;alpha adrenergic receptor;vascular reactivity
T6以上平面的脊髓损伤(SCI)患者进入慢性期后，受到膀胱胀满、肠道堵塞等不良刺激时常发生自主神经反射异常(AD)。AD发作时，血管广泛收缩，出现恶性高血压，收缩压和舒张压可分别高达250～300 mm Hg(1 mm Hg=0133 kPa)和200～220 mm Hg，严重时可导致肺水肿、颅内出血甚至死亡，是SCI后最为严重的并发症之一〔1〕。AD的发生可能与损伤节段以下脊髓失去上位神经中枢的抑制作用，失去神经支配后脊髓交感神经中枢产生异常突触连接〔2，3〕，血管α肾上腺素受体(αAR)反应性增高有关〔1〕。但究竟何种αAR亚型的敏感性发生变化，其相应基因表达是否改变，目前尚无相关报道。为进一步明确高位SCI后AD的血管机制，我们采用离体血管环张力测定技术，研究腹主动脉血管环对梯度浓度α1AR激动剂去氧肾上腺素(Phe)、α2AR激动剂可乐定的反应性，通过实时定量聚合酶链反应(real time PCR)法测定腹主动脉α1AR和α2AR 各亚型mRNA的表达量，探讨高位脊髓横切(SCT)慢性期大鼠血管高反应性的机制。
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1 材料与方法1.1 实验材料:Trizol(Sangon公司)，逆转录(RT)试剂盒(BBI公司)，real time PCR试剂盒和DNAⅠ(Takara 公司)，DNA Marker BL2000(BioLight Technology公司)，real time PCR 仪(ABI PRISM 7000)，TGL台式高速离心机(HITACHI公司)，微型电泳仪(上海西巴斯生物技术开发有限公司)，紫外分光光度计(UV2401PC)，MPA2000多通道生理记录仪(奥尔科特生物科技有限公司)，离体组织灌流浴槽(西班牙Panlab公司)。
1.2 实验分组和模型建立：健康雄性Wistar 大鼠32只(购自中科院上海动物中心)，雌雄各半，体重260~300 g，按照随机数字表法分为两组。SCT组腹腔注射50 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg地西泮注射液，咬除T4椎板，暴露脊髓，使用自制超薄刀片横切T4脊髓；假手术组只暴露脊髓，不进行横切。术后连续3 d给予青霉素400 kU/d，同时用质量分数为5%的葡萄糖10 ml腹腔补液，术后1周挤压膀胱人工排尿。术后4周股动脉插管接换能器和多通道生理记录仪，3 h后大鼠血压平稳时，用导管刺激直肠，观察升压反应。选取SCT组平均动脉压(MAP)比基础值升高超过15 mm Hg的大鼠活杀，取腹主动脉，清除周围结缔组织，每只大鼠取5 mm长的腹主动脉行离体血管环张力实验，剩余腹主动脉进行mRNA定量实验。
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1.3 离体血管环张力实验〔4〕：将腹主动脉环悬挂于注有KrebsHenseleit液〔KH液，组成：NaCl 118.0 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L,MgSO4•7H2O 0.45 mmol/L,NaHCO3 25 mmol/L,KH2PO4 1.03 mmol/L,CaCl2 25 mmol/L,葡萄糖(glucose)11.1 mmol/L,pH 74〕的离体器官灌流槽中，持续充入体积分数为95%的O2和5%的CO2混合气体，给预初张力2.0 g,25 ℃恒温孵育1 h，30 min换1次灌流液，待张力曲线平稳后，测定血管环对去甲肾上腺素(NE)、Phe和可乐定的敏感性。按照浓度累计法向浴槽内依次加入试剂，Phe的终浓度分别为3×10-9、1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6、3×10-6和1×10-5 mol/L；可乐定终浓度分别为3×10-9、1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6和3×10-6 mol/L。记录不同浓度下各血管环产生的最大收缩力(Emax)，以血管收缩张力(g)为量化标准，制作量效曲线，曲线拟合法求半数有效浓度(EC50)，用lg 〔EC50(pD2)〕和Emax及量效曲线评价血管反应性〔5，6〕。
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1.4 real time PCR法检测α1AR和α2AR各亚型mRNA表达量：以RNA纯化试剂盒提取腹主动脉总RNA，以DNAⅠ对所得RNA进行处理；每份RNA分别取5 μl总RNA进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶变性电泳，验证RNA完整性。测定260 nm处吸光度值(A260)，计算mRNA浓度。
取RNA 2 μg在20 μl体系中按标准程序进行RT，RT时不加反转录酶处理，作为阴性对照，进一步排除基因组DNA污染。引物通过Primer 50设计，完成后行BLAST比对分析，引物序列见表1。real time PCR：SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 125 μl，PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各05 μl,ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.5 μl,cDNA模板2.0 μl，灭菌蒸馏水9.0 μl，总体积为25 μl。
反转录产物cDNA以10倍稀释，成为各条基因标准品，每个标准曲线取4个点，分别设为100、10、1和0.1 ng。各产物浓度根据标准曲线求得。
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为控制样本误差，先根据βactin标准曲线算出各样本的相对βactin mRNA浓度，然后将6条被测基因的浓度与βactin浓度比对，得出各份样品标准化处理以后的相对mRNA浓度。所有PCR产物均经过溶解曲线分析(PCR产物溶解温度设置为65~95 ℃)和1%的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物割胶回收、测序，与目的片断比对，验证PCR产物。
1.5 统计学处理：计量资料以均数±标准差(x±s)表示，t检验， P<005为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血管环对Phe、可乐定的敏感性
2.1.1 腹主动脉对Phe的敏感性(图1)：与假手术组比较，SCT组在相同浓度Phe刺激下，腹主动脉收缩力无明显改变，量效曲线无明显右移或左移。SCT组Emax为(5948±0244)g，假手术组Emax为(5.712±0.112)g，差异无显著性(P>0.05)；SCT组pD2为7741±0287，假手术组pD2为7.782±0.391，差异无显著性(P>0.05)。
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2.1.2腹主动脉对可乐定的敏感性(图2)：与假手术组比较，SCT组的量效曲线明显左移，在可乐定终浓度为3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6患者3×10-6 mol/L时差异均有显著性(P<0.05或P<0.01);在可乐定终浓度为3×10-6 mol/L时，Emax由假手术组的(4.170±0.372)g上升至(5.108±0.326)g(P<0.01)；pD2由假手术组的7.102±0.212上升至7.402±0.301(P<0.05)。
2.2 腹主动脉αAR mRNA的表达(图3)：real time PCR的溶解曲线分析只显示单峰，表明PCR非特意性扩增产物较少，测序分析PCR产物，7条基因均为目的产物。SCT 4周以后，腹主动脉总α1AR和α2AR的mRNA表达量均上调。与假手术组比较，SCT组α1AAR mRNA(t＝2.386，P<0.05)、α1DAR mRNA(t＝2.572，P<0.01)、α2AAR mRNA(t＝10.235，P<0.01)、α2BAR mRNA(t＝18.452，P<0.01)及α2CAR mRNA(t＝2.483，P<0.05)表达均上调，α1BAR mRNA表达量则未见明显改变。
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3 讨论 AD是SCI后最严重的并发症之一，在T6或T6以上节段受损患者中较常见，表现为血压骤升，心动过缓，抨击样头痛，损伤平面以上区域大量出汗，损伤平面以下区域皮肤冰冷、苍白等。引起AD的原因很多，以大小便潴留最为常见。正常情况下，所有内脏血管反射均在脊髓上水平进行整合，维持血压相对稳定。SCI后，损伤平面以下的刺激经腹下神经(交感)和盆神经(副交感)，从脊髓背外侧向上传入，但在SCI处被阻断，兴奋中间神经元，继之与交感神经节前神经元发生突触联系，引起交感神经传出纤维反射性兴奋，激发损伤平面以下的内脏和肢体血管收缩，导致血压上升。因此，SCI的平面将直接影响交感神经兴奋的范围和程度。
目前对AD发生机制的研究主要集中在脊髓神经通路改变和血管对激动剂反应性改变两个方面。SCI慢性期，脊髓交感环路发生明显的可塑性变化，包括传入、传出和中间神经元的改变〔1,2〕；AD的发生率与脊髓背角传入神经元面积增大有关，抑制初级神经纤维的生长可减少AD的发生。痛觉传入纤维与AD的关系并不密切〔7〕,膀胱辣椒素敏感性传入神经元参与了AD的发生过程。传出神经纤维中，肾上腺交感节前神经元增生，可能介导了AD的发生过程〔8〕。我们的研究也表明，交感神经节前神经元在1周后萎缩，2周时再生，再生过程与AD的发生过程一致〔2〕。
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AD患者血管反应性升高。SCI慢性期患者静脉注射NE升压反应较正常人明显；局部注射NE，四肢瘫患者足静脉收缩性明显增强；肾脏血管收缩，肾脏对氨基马尿酸(PAH)清除率降低，而动脉压力感受性反射保持不变〔9〕。尾动脉离体血管收缩功能研究也表明，SCT引起血管平滑肌对血管收缩剂反应性上升，可能是引发AD的原因〔10〕。本研究中发现，与假手术组比较，SCT 4周大鼠腹主动脉对可乐定反应性上升，而对Phe反应性无明显改变。表明SCT慢性期血管对α2AR激动剂的反应性上升可能为腹主动脉高反应性的机制之一。
发生AD时血浆NE浓度为其安静时的150~432倍〔9,11〕，但仍低于正常水平；而血浆NE浓度升高5倍时才能产生明显的生物学效应〔12〕。如果给正常人输入NE，使NE浓度为正常人的21倍时，可引起与AD同样的血压变化〔13〕。SCI患者AD时血浆NE浓度尚不足以引起患者血压明显升高，推测可能是血管高反应性导致的血压升高。离体血管研究表明，血管对α2AR激动剂反应性升高。
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αAR是一种儿茶酚胺细胞膜表面受体，其内源性配基是NE与肾上腺素。αAR在介导心血管收缩反应中起重要作用。α1AR通过Gq/11磷脂酶C(PLC)信号转导通路引起血管收缩，可分为α1AAR、α1BAR、α1DAR 3种；α2AR通过G抑制蛋白(Gi)腺苷酸环化酶(ACcAMP)通路引起血管收缩，可分为α2AAR、α2BAR、α2CAR 3种。大鼠的功能性α1AR在腹主动脉主要为α1D亚型，α2BAR在血管平滑肌表达十分广泛，参与调节血流动力学。本研究中通过Real time PCR法测定腹主动脉6种αAR亚型mRNA表达量，发现SCT组腹主动脉α1AAR、α1DAR、α2AAR、α2BAR和α2CAR的mRNA表达均上调，而α1BAR mRNA表达量未见明显改变。
腹主动脉α2AR mRNA表达上调可能是腹主动脉对可乐定反应性上升的原因。α1AR mRNA表达上调，但离体血管对Phe收缩力未见明显改变，α1AR mRNA表达上调可能并不是引起SCT慢性期血管高反应性的原因。两者不一致的原因可能是α1AR蛋白表达差异，也可能是受体亲和力、受体后通道改变等原因，具体机制尚待深入研究。
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综上所述，腹主动脉α2AR mRNA表达上调，腹主动脉对α2AR激动剂的反应性上升，可能是高位SCT慢性期大鼠血管反应性升高、发生AD的原因之一；α1 AR可能未参与SCT大鼠腹主动脉血管反应性升高的过程。
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12 周国昌，田汨，唐和虎，等.自主神经过度反射血浆NE的改变〔J〕.中华创伤杂志,1995,11:2830.
13 Mathias C J,Christensen N J,Corbett J L,et al.Plasma catecholamines during paroxysmal neurogenic hypertension in quadriplegic man〔J〕.Circ Res,1976,39:204208
基金项目：上海市科委基金资助项目(054119522)；上海市卫生局科技发展基金资助项目(024097)
作者单位：200003上海，第二军医大学附属长征医院麻醉科(邹最，石学银，吕砚，刘刚)；200040上海，复旦大学附属华山医院麻醉科(徐振东)；200433上海，第二军医大学生物化学与分子生物学教研室(时多，王璐)
通讯作者：石学银，博士研究生导师，主任医师
作者简介：邹最，男，湖南宁乡人，硕士研究生。, http://www.100md.com
【摘要】 目的 研究高位脊髓横切(SCT)慢性期大鼠腹主动脉离体血管环对α肾上腺素受体(αAR)激动剂的反应性及腹主动脉α1AR、α2AR各亚型mRNA的表达量，探讨其与腹主动脉高反应性的关系。方法 取SCT 4周后大鼠的腹主动脉，利用离体血管环张力测定技术，以血管环对梯度浓度去氧肾上腺素(Phe)和可乐定的收缩力，反映血管环对α1AR、α2AR激动剂的反应性；通过实时定量聚合酶链反应(PCR)测定腹主动脉α1AAR、α1BAR、α1DAR、α2AAR、α2BAR和α2CAR的mRNA表达量改变，并与假手术组比较。结果 与假手术组比较，SCT 4周组大鼠腹主动脉对可乐定反应性上升(P<0.05 或 P<0.01)，对Phe反应性无明显改变；SCT组腹主动脉α1AAR和α1DAR的mRNA表达上调(P<0.05或P<0.01)，而α1BAR mRNA表达未见明显改变(P>0.05)，α2AAR、α2BAR和α2CAR的mRNA表达均上调(P<0.05或P<0.01)。结论 在SCT慢性期，腹主动脉高反应性的机制可能为血管对α2AR激动剂敏感性上升，α2AR mRNA表达上调。虽然α1AR mRNA表达上调，但离体血管对Phe收缩力无明显改变，α1AR可能并不是引起SCT慢性期血管高反应性的原因。
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【关键词】 脊髓横切；自主神经反射异常；α肾上腺素受体；血管反应性
Role of alphaadrenergic receptors in vascular hyperreactivity in rats with high level spinal injury ZOU Zui, SHI Xueyin, LU Yan, XU Zhendong, SHI Duo, WANG Lu, LIU Gang.Department of Anaesthesiology, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Corresponding author: SHI Xueyin (Email: shixueyin1128 @yahoo.com.cn)：：：
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【Abstract】 Objective To explore the vascular reactivity of abdominal aorta to agonists of αadrenergic receptors in rat with high level transection of the spimal cord ,and to quantify the expression of αAR mRNA subtypes, in order to investigate relationship between αAR and hyperreactivity of abdominal aorta. Methods Four weeks after transection of the spinal cord at the level of 4th thoracic vertebra, the rats were sacrificed, and abdominal aorta rings were adopted to assay sensitivity to phenylephrine and clonidine with isolated organ perfusion system. α1AAR, α1BAR, α1DAR, α2AAR, α2BAR,α2CAR mRNA expressions were quantified by real time polymerase chain reaction (PCR). Results Compared with abdominal aorta, of rat with sham operation, reactivity of aorta of rat after transection of spinal cord to clonidine was significantly higher(P<0.05 or P<0.01), but difference of vascular reactivity to phenylephrine between them was not significant (P>0.05). Expressions of α1AAR mRNA, α1DAR mRNA, α2AAR mRNA， α2BAR mRNA， α2CAR mRNA were significantly higher(P<0.05 or P<0.01), while the expression of α1BAR mRNA did not vary significantly. Conclusion Vascular hyperreactivity to agonist of α2AR may be the mechanism of hyperreactivity of abdominal aorta in rat after transection of spinal cord. Although α1AR mRNA expression is higher in aorta of rat with spinal cord injury, vascular hyperreactivity is not the result of upregulation of α1AR sensitivity.
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【Key words】 spinal cord transection;autonomic dysreflexia;alpha adrenergic receptor;vascular reactivity
T6以上平面的脊髓损伤(SCI)患者进入慢性期后，受到膀胱胀满、肠道堵塞等不良刺激时常发生自主神经反射异常(AD)。AD发作时，血管广泛收缩，出现恶性高血压，收缩压和舒张压可分别高达250～300 mm Hg(1 mm Hg=0133 kPa)和200～220 mm Hg，严重时可导致肺水肿、颅内出血甚至死亡，是SCI后最为严重的并发症之一〔1〕。AD的发生可能与损伤节段以下脊髓失去上位神经中枢的抑制作用，失去神经支配后脊髓交感神经中枢产生异常突触连接〔2，3〕，血管α肾上腺素受体(αAR)反应性增高有关〔1〕。但究竟何种αAR亚型的敏感性发生变化，其相应基因表达是否改变，目前尚无相关报道。为进一步明确高位SCI后AD的血管机制，我们采用离体血管环张力测定技术，研究腹主动脉血管环对梯度浓度α1AR激动剂去氧肾上腺素(Phe)、α2AR激动剂可乐定的反应性，通过实时定量聚合酶链反应(real time PCR)法测定腹主动脉α1AR和α2AR 各亚型mRNA的表达量，探讨高位脊髓横切(SCT)慢性期大鼠血管高反应性的机制。
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1 材料与方法1.1 实验材料:Trizol(Sangon公司)，逆转录(RT)试剂盒(BBI公司)，real time PCR试剂盒和DNAⅠ(Takara 公司)，DNA Marker BL2000(BioLight Technology公司)，real time PCR 仪(ABI PRISM 7000)，TGL台式高速离心机(HITACHI公司)，微型电泳仪(上海西巴斯生物技术开发有限公司)，紫外分光光度计(UV2401PC)，MPA2000多通道生理记录仪(奥尔科特生物科技有限公司)，离体组织灌流浴槽(西班牙Panlab公司)。
1.2 实验分组和模型建立：健康雄性Wistar 大鼠32只(购自中科院上海动物中心)，雌雄各半，体重260~300 g，按照随机数字表法分为两组。SCT组腹腔注射50 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg地西泮注射液，咬除T4椎板，暴露脊髓，使用自制超薄刀片横切T4脊髓；假手术组只暴露脊髓，不进行横切。术后连续3 d给予青霉素400 kU/d，同时用质量分数为5%的葡萄糖10 ml腹腔补液，术后1周挤压膀胱人工排尿。术后4周股动脉插管接换能器和多通道生理记录仪，3 h后大鼠血压平稳时，用导管刺激直肠，观察升压反应。选取SCT组平均动脉压(MAP)比基础值升高超过15 mm Hg的大鼠活杀，取腹主动脉，清除周围结缔组织，每只大鼠取5 mm长的腹主动脉行离体血管环张力实验，剩余腹主动脉进行mRNA定量实验。
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1.3 离体血管环张力实验〔4〕：将腹主动脉环悬挂于注有KrebsHenseleit液〔KH液，组成：NaCl 118.0 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L,MgSO4•7H2O 0.45 mmol/L,NaHCO3 25 mmol/L,KH2PO4 1.03 mmol/L,CaCl2 25 mmol/L,葡萄糖(glucose)11.1 mmol/L,pH 74〕的离体器官灌流槽中，持续充入体积分数为95%的O2和5%的CO2混合气体，给预初张力2.0 g,25 ℃恒温孵育1 h，30 min换1次灌流液，待张力曲线平稳后，测定血管环对去甲肾上腺素(NE)、Phe和可乐定的敏感性。按照浓度累计法向浴槽内依次加入试剂，Phe的终浓度分别为3×10-9、1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6、3×10-6和1×10-5 mol/L；可乐定终浓度分别为3×10-9、1×10-8、3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6和3×10-6 mol/L。记录不同浓度下各血管环产生的最大收缩力(Emax)，以血管收缩张力(g)为量化标准，制作量效曲线，曲线拟合法求半数有效浓度(EC50)，用lg 〔EC50(pD2)〕和Emax及量效曲线评价血管反应性〔5，6〕。
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1.4 real time PCR法检测α1AR和α2AR各亚型mRNA表达量：以RNA纯化试剂盒提取腹主动脉总RNA，以DNAⅠ对所得RNA进行处理；每份RNA分别取5 μl总RNA进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶变性电泳，验证RNA完整性。测定260 nm处吸光度值(A260)，计算mRNA浓度。
取RNA 2 μg在20 μl体系中按标准程序进行RT，RT时不加反转录酶处理，作为阴性对照，进一步排除基因组DNA污染。引物通过Primer 50设计，完成后行BLAST比对分析，引物序列见表1。real time PCR：SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 125 μl，PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各05 μl,ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.5 μl,cDNA模板2.0 μl，灭菌蒸馏水9.0 μl，总体积为25 μl。
反转录产物cDNA以10倍稀释，成为各条基因标准品，每个标准曲线取4个点，分别设为100、10、1和0.1 ng。各产物浓度根据标准曲线求得。
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为控制样本误差，先根据βactin标准曲线算出各样本的相对βactin mRNA浓度，然后将6条被测基因的浓度与βactin浓度比对，得出各份样品标准化处理以后的相对mRNA浓度。所有PCR产物均经过溶解曲线分析(PCR产物溶解温度设置为65~95 ℃)和1%的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物割胶回收、测序，与目的片断比对，验证PCR产物。
1.5 统计学处理：计量资料以均数±标准差(x±s)表示，t检验， P<005为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血管环对Phe、可乐定的敏感性
2.1.1 腹主动脉对Phe的敏感性(图1)：与假手术组比较，SCT组在相同浓度Phe刺激下，腹主动脉收缩力无明显改变，量效曲线无明显右移或左移。SCT组Emax为(5948±0244)g，假手术组Emax为(5.712±0.112)g，差异无显著性(P>0.05)；SCT组pD2为7741±0287，假手术组pD2为7.782±0.391，差异无显著性(P>0.05)。
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2.1.2腹主动脉对可乐定的敏感性(图2)：与假手术组比较，SCT组的量效曲线明显左移，在可乐定终浓度为3×10-8、1×10-7、3×10-7、1×10-6患者3×10-6 mol/L时差异均有显著性(P<0.05或P<0.01);在可乐定终浓度为3×10-6 mol/L时，Emax由假手术组的(4.170±0.372)g上升至(5.108±0.326)g(P<0.01)；pD2由假手术组的7.102±0.212上升至7.402±0.301(P<0.05)。
2.2 腹主动脉αAR mRNA的表达(图3)：real time PCR的溶解曲线分析只显示单峰，表明PCR非特意性扩增产物较少，测序分析PCR产物，7条基因均为目的产物。SCT 4周以后，腹主动脉总α1AR和α2AR的mRNA表达量均上调。与假手术组比较，SCT组α1AAR mRNA(t＝2.386，P<0.05)、α1DAR mRNA(t＝2.572，P<0.01)、α2AAR mRNA(t＝10.235，P<0.01)、α2BAR mRNA(t＝18.452，P<0.01)及α2CAR mRNA(t＝2.483，P<0.05)表达均上调，α1BAR mRNA表达量则未见明显改变。
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3 讨论 AD是SCI后最严重的并发症之一，在T6或T6以上节段受损患者中较常见，表现为血压骤升，心动过缓，抨击样头痛，损伤平面以上区域大量出汗，损伤平面以下区域皮肤冰冷、苍白等。引起AD的原因很多，以大小便潴留最为常见。正常情况下，所有内脏血管反射均在脊髓上水平进行整合，维持血压相对稳定。SCI后，损伤平面以下的刺激经腹下神经(交感)和盆神经(副交感)，从脊髓背外侧向上传入，但在SCI处被阻断，兴奋中间神经元，继之与交感神经节前神经元发生突触联系，引起交感神经传出纤维反射性兴奋，激发损伤平面以下的内脏和肢体血管收缩，导致血压上升。因此，SCI的平面将直接影响交感神经兴奋的范围和程度。
目前对AD发生机制的研究主要集中在脊髓神经通路改变和血管对激动剂反应性改变两个方面。SCI慢性期，脊髓交感环路发生明显的可塑性变化，包括传入、传出和中间神经元的改变〔1,2〕；AD的发生率与脊髓背角传入神经元面积增大有关，抑制初级神经纤维的生长可减少AD的发生。痛觉传入纤维与AD的关系并不密切〔7〕,膀胱辣椒素敏感性传入神经元参与了AD的发生过程。传出神经纤维中，肾上腺交感节前神经元增生，可能介导了AD的发生过程〔8〕。我们的研究也表明，交感神经节前神经元在1周后萎缩，2周时再生，再生过程与AD的发生过程一致〔2〕。
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AD患者血管反应性升高。SCI慢性期患者静脉注射NE升压反应较正常人明显；局部注射NE，四肢瘫患者足静脉收缩性明显增强；肾脏血管收缩，肾脏对氨基马尿酸(PAH)清除率降低，而动脉压力感受性反射保持不变〔9〕。尾动脉离体血管收缩功能研究也表明，SCT引起血管平滑肌对血管收缩剂反应性上升，可能是引发AD的原因〔10〕。本研究中发现，与假手术组比较，SCT 4周大鼠腹主动脉对可乐定反应性上升，而对Phe反应性无明显改变。表明SCT慢性期血管对α2AR激动剂的反应性上升可能为腹主动脉高反应性的机制之一。
发生AD时血浆NE浓度为其安静时的150~432倍〔9,11〕，但仍低于正常水平；而血浆NE浓度升高5倍时才能产生明显的生物学效应〔12〕。如果给正常人输入NE，使NE浓度为正常人的21倍时，可引起与AD同样的血压变化〔13〕。SCI患者AD时血浆NE浓度尚不足以引起患者血压明显升高，推测可能是血管高反应性导致的血压升高。离体血管研究表明，血管对α2AR激动剂反应性升高。
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αAR是一种儿茶酚胺细胞膜表面受体，其内源性配基是NE与肾上腺素。αAR在介导心血管收缩反应中起重要作用。α1AR通过Gq/11磷脂酶C(PLC)信号转导通路引起血管收缩，可分为α1AAR、α1BAR、α1DAR 3种；α2AR通过G抑制蛋白(Gi)腺苷酸环化酶(ACcAMP)通路引起血管收缩，可分为α2AAR、α2BAR、α2CAR 3种。大鼠的功能性α1AR在腹主动脉主要为α1D亚型，α2BAR在血管平滑肌表达十分广泛，参与调节血流动力学。本研究中通过Real time PCR法测定腹主动脉6种αAR亚型mRNA表达量，发现SCT组腹主动脉α1AAR、α1DAR、α2AAR、α2BAR和α2CAR的mRNA表达均上调，而α1BAR mRNA表达量未见明显改变。
腹主动脉α2AR mRNA表达上调可能是腹主动脉对可乐定反应性上升的原因。α1AR mRNA表达上调，但离体血管对Phe收缩力未见明显改变，α1AR mRNA表达上调可能并不是引起SCT慢性期血管高反应性的原因。两者不一致的原因可能是α1AR蛋白表达差异，也可能是受体亲和力、受体后通道改变等原因，具体机制尚待深入研究。
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综上所述，腹主动脉α2AR mRNA表达上调，腹主动脉对α2AR激动剂的反应性上升，可能是高位SCT慢性期大鼠血管反应性升高、发生AD的原因之一；α1 AR可能未参与SCT大鼠腹主动脉血管反应性升高的过程。
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基金项目：上海市科委基金资助项目(054119522)；上海市卫生局科技发展基金资助项目(024097)
作者单位：200003上海，第二军医大学附属长征医院麻醉科(邹最，石学银，吕砚，刘刚)；200040上海，复旦大学附属华山医院麻醉科(徐振东)；200433上海，第二军医大学生物化学与分子生物学教研室(时多，王璐)
通讯作者：石学银，博士研究生导师，主任医师
作者简介：邹最，男，湖南宁乡人，硕士研究生。, http://www.100md.com