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编号:11182234
http://www.100md.com 2006年9月28日 周 欣 李燕婷 沈荣明 沈微娟 瞿 涤
    1.2.3 连接至pMD18-T载体(大连宝生物公司)

    ① 连接PCR产物4 μL,pMD18-T Vector 1μL,Ligase Buffer 5 μL,16℃ 8 h。

    ② 转化:取出冻存的DH5α(200 μL/Tube),冰中溶解,取5 μL连接液加入菌液中,轻轻混匀,冰浴30 min,42℃ 1.5 min,冰浴2 min,加入500 μL LB 37℃ 100 rpm 45 min,取200 μL涂布至Amp板(100 μg/mL),37℃倒置培养过夜,至克隆长出。

    ③ 扩增:取单克隆至3 mL Amp/LB中,37℃ 250 rpm,过夜。

    ④ 质粒抽提(V-gene 质粒抽提Kit):质粒量为100 ng/μL。

    1.2.4 测序 由测序结果可知T/A克隆序列正确(BigDye Mix,PE公司产品,测序引物为M13-F)。测序结果如下:

    CTATAGAATNCAAGTTCAANGGCGAACTCTAGA

    GATTatagccaggcagaaggtgagggatgcagaaaaacagtatgaaaaggatc

    cagatgagttgaacaagagaacattaactgaccgagTgggcgttgcagtatctatc

    caggcaaaaattgatgagttaaaaaggcaactggcagataggattgcaAATCG

    TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG

    TTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC

    CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCC

    AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGC

    CCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGC

    GCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGT

    ATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCT

    GCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA