新型纤维素衍生物手性固定相的制备及其对几种对映异构体的高效液相色谱分离
摘要 合成了一种经环十二烷修饰的纤维素酯，将其涂敷于小粒径的氨丙基化硅胶(APS)上，制备出高效液相色谱手性固定相，以正己烷、异丙醇为流动相拆分了2对氯苯基丙腈、1对氟苯基乙醇、1对叔丁基苯氧基2丙醇、2对氯苯基辛腈及三唑醇等5种外消旋对映体，并考察了流动相中异丙醇含量对分离效果的影响。
关键词 纤维素衍生物，手性固定相，高效液相色谱
1 引言
近十几年来，手性固定相高效液相色谱法直接拆分对映异构体备受重视，发展迅速。纤维素衍生物手性固定相(CSP)在高效液相色谱法(HPLC)拆分对映异构体中应用广泛[1]。其中涂敷型的CSP在医药、生化、农药和有机合成中间体等的手性分离与分析中都表现出了极好的手性识别能力[2]。然而,所有类型的手性化合物不可能在同一手性色谱柱上实现分离。为了满足不同领域研究的需要，制备各种新型手性固定相就显得尤为重要。本实验利用自制的新型纤维素衍生物手性固定相，拆分了5种外消旋对映体，并考察了流动相中异丙醇含量对分离的影响。
2 实验部分
2.1 仪器及试剂
IR435红外光谱仪(日本岛津公司)；核磁共振仪(Bruker dpx300 MHz)；HP5000高效液相色谱仪(美国Varian公司)；液相色谱装柱机(北京福思源机械加工部)。环十二酮(北京百灵威)；微晶纤维素(上海试剂二厂)；γ氨丙基硅胶(5 μm，北京金欧亚)；其余试剂均为国产分析纯；分析样品(中国农业大学)。
2.2 固定相的合成
2.2.1 环十二烷基丁二酸单酰胺的合成[3] 环十二胺的合成参照文献[4]。在配有回流冷凝管的250 mL三颈瓶中加入915 g(005 mol)环十二胺，50 mL四氢呋喃，05 g(005 mol)丁二酸酐，电磁搅拌，缓慢加热到回流。TLC检测，反应4 h后，原料点消失，加入适量无水乙醚，立即析出大量白色沉淀，过滤，得白色固体125 g，产率890%[5]。
1H NMR(CDCl3)：125~129(m,20H),147~154(m,2H),224~229(m,2H),237~242(m,2H),384~385(d,1H),757~759(d,1H),1202(s,1H)。
2.2.2 环十二烷氨基羰基丙酰基、苯甲酰基纤维素酯的合成[5,6] 在配有回流冷凝管的50 mL三颈瓶中加入45 g(0016 mol)上述已制得的环十二烷基丁二酸单酰胺，20 mL无水二氯甲烷，氮气保护，室温下搅拌，用注射器加15 mL(0021 mol)二氯亚砜，室温下反应20 min，常压蒸除溶剂，把得到的酰氯产物在氮气保护下加入到已在吡啶中回流15 h的05 g微晶纤维素反应瓶中，100 ℃下回流28 h，冷却后过滤，滤液减压蒸除溶剂，得黑色粘稠液体，50 ℃真空干燥12 h，得纤维素一次衍生物。把纤维素一次衍生物加入到150 mL三口瓶中，加40 mL干燥吡啶，加热回流8 h，然后降到室温，注入2 mL苯甲酰氯，90 ℃反应20 h，冷却后过滤，减压蒸除溶剂得黑色粘稠液体，50 ℃真空干燥8 h，得到目标产物[10,11]。
2.3 固定相的涂敷与装柱[10]
取06 g纤维素衍生物溶于30 mL四氢呋喃，取10 mL加入到已装有3 g γ氨丙基硅胶的50 mL烧杯中，缓慢蒸发除去溶剂。重复两次，得到固定相。该固定相在正己烷异丙醇(95∶5，V/V)中分散均匀，以正己烷异丙醇(98∶2，V/V)为匀浆液，在40 MPa压力下装入不锈钢柱(250 mm×46 mm i.d.)中。
3 结果与讨论
3.1 目标物的合成
在目标物的合成过程中，考虑到环十二烷基丁二酸单酰胺分子体积较大，对纤维素分子中羟基的覆盖可能不完全，所以选用苯甲酰氯对纤维素上残余羟基进行二次酯化。红外光谱证实，衍生化以后，微晶纤维素在3 340 cm-1处原本很强的羟基吸收峰变的很弱，1 726 cm-1处出现了很强的酯羰基吸收峰，700 cm-1处出现苯环的单取代吸收峰，表明纤维素基本衍生完全。
采用核磁共振波谱对产物进行了分析。通常采用NMR分析聚合物的效果不好。但微晶纤维素经衍生化后产物可溶于CDCl3中，可用NMR分析。根据苯环上氢(δ 733~818)和环十二烷基上的氢(δ 113~225)的化学位移和积分数可算出纤维素衍生物十二员环和苯环的摩尔比约为4∶1(计算方法为:(环十二烷基氢积分值/23)∶(苯基氢积分值/5))，即纤维素衍生物中四个环十二烷基对应一个苯基。
3.2 色谱拆分对映体
以正己烷/异丙醇为流动相，对5种手性化合物进行了拆分。手性分离的结果见表1，色谱分离图见图1所示。
表1 一些手性物质的分离结果(略)
Table 1 Determination results of some chiral materials
分离结果显示，1对氟苯基乙醇，2对氯苯基丙腈获得了很好地分离效果， 1对叔丁基苯氧基2丙醇、三唑醇、2对氯苯基辛腈获得一定程度的分离。其中，2对氯苯基丙腈和2对氯苯基辛腈的分子结构的差别在于腈的炭链长度。但二者获得分离的程度差别很大，有可能是因为烷基的大小不同，造成了它们与固定相之间形成的分子之间相互作用的差异，从而产生不同的分离效果。5种对映异构体结构中都含有苯环，可与固定相上的苯环形成分子间pp电荷相互作用。另外，不同对映体结构中含有的氰基、羟基可与固定相上的羰基、氨基分别形成分子间氢键相互作用。研究认为,固定相环十二烷氨基羰基丙酰基、苯甲酰基纤维素酯本身结构所形成的手性空腔是其达到手性识别目的的重要因素。不同结构的外消旋对映体在这种固定相上获得分离的情况之所以不同，与其能否进入纤维素衍生物手性空腔内，形成有效的“三点相互作用”密切相关[8]。
图1 2对氯苯基丙腈(a)和1对叔丁基苯氧基2丙醇(b)对映体的色谱分离图(略)
Fig.1 Chromatograms of enantiomeric separation of CH3CH(pClC6H4)CN(a) and CH3CHOHCH2[p(CH3)3CC6H4](b)
表2 异丙醇含量对容量因子(k′)和选择性因子(α)的影响(略)
Table 2 Effect of isopropanol concentration in mobile phase on separation
3.3 流动相中异丙醇含量对分离结果的影响
实验以2对氯苯基丙腈的分离为例，考察了流动相中异丙醇含量对分离效果的影响，结果如表2所示。从分离结果可以看出，随着异丙醇体积分数逐渐减小，保留因子和选择性因子都在逐渐增大。优化分离条件为异丙醇含量为20%，分离因子可达1240。流动相中的极性成分异丙醇和样品分子竞争与固定相的作用，加快洗脱，所以增加异丙醇的含量可减小保留时间，同时立体选择作用也随之减小。
References
1 Franco P, Senso A, Oliveros L, Minguillon C. J. Chromatogr. A, 2001, 906: 155~167
2 Shao Baohai(邵保海)， Xu Xiuzhu(徐秀珠)， Lü Jiande(吕建德)， Fu Xiaoyun(傅小芸). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学)， 2003, 31(2): 239~244
3 Hu Zhiqiang(胡志强)， Guo Yujing(郭玉晶)， Xu Liangzhong(许良忠). Chinese Journal of Qingdao Institute of Chemical Technology(青岛化工学院学报)， 2001， 22(4): 350~351
4 Liang Xiaomei(梁晓梅)， Xu Yanli(徐燕莉)， Huang Haoping(黄少平)， Chen Jinghong(陈敬红)， Wang Daoquan(王道全). Chinese Journal of Chemical Reagents(化学试剂)， 1999， 21(2): 109~110
5 Gao Lijuan(高丽娟)， Zhang Lihua(张丽华)， Lin Bingchang(林丙昌). Chinese Journal of Chemical World(化学世界), 1999， 11： 589~592
6 Wei Jianguo(韦建国)， Ma Xiangdong(马向东)， Shen Yantao(沈艳涛). Chinese Journal of Applied Chemical Industry(应用化工)， 2002， 31(5): 20~21
7 Huang Xiaodi(黄晓笛)， Shao Peng(绍 朋). Chinese Journal Chemical Engineer(化学工程师)， 1996， 54(3): 51~53
8 Wu Y S, Lee H K, Li S F Y. J. Chromatogr. A, 2001, 912(1): 171~179
(中国农业大学应用化学系，北京 100094), 百拇医药(孙艳伟 梁晓梅 周志强 吴景平 王道全)
关键词 纤维素衍生物，手性固定相，高效液相色谱
1 引言
近十几年来，手性固定相高效液相色谱法直接拆分对映异构体备受重视，发展迅速。纤维素衍生物手性固定相(CSP)在高效液相色谱法(HPLC)拆分对映异构体中应用广泛[1]。其中涂敷型的CSP在医药、生化、农药和有机合成中间体等的手性分离与分析中都表现出了极好的手性识别能力[2]。然而,所有类型的手性化合物不可能在同一手性色谱柱上实现分离。为了满足不同领域研究的需要，制备各种新型手性固定相就显得尤为重要。本实验利用自制的新型纤维素衍生物手性固定相，拆分了5种外消旋对映体，并考察了流动相中异丙醇含量对分离的影响。
2 实验部分
2.1 仪器及试剂
IR435红外光谱仪(日本岛津公司)；核磁共振仪(Bruker dpx300 MHz)；HP5000高效液相色谱仪(美国Varian公司)；液相色谱装柱机(北京福思源机械加工部)。环十二酮(北京百灵威)；微晶纤维素(上海试剂二厂)；γ氨丙基硅胶(5 μm，北京金欧亚)；其余试剂均为国产分析纯；分析样品(中国农业大学)。
2.2 固定相的合成
2.2.1 环十二烷基丁二酸单酰胺的合成[3] 环十二胺的合成参照文献[4]。在配有回流冷凝管的250 mL三颈瓶中加入915 g(005 mol)环十二胺，50 mL四氢呋喃，05 g(005 mol)丁二酸酐，电磁搅拌，缓慢加热到回流。TLC检测，反应4 h后，原料点消失，加入适量无水乙醚，立即析出大量白色沉淀，过滤，得白色固体125 g，产率890%[5]。
1H NMR(CDCl3)：125~129(m,20H),147~154(m,2H),224~229(m,2H),237~242(m,2H),384~385(d,1H),757~759(d,1H),1202(s,1H)。
2.2.2 环十二烷氨基羰基丙酰基、苯甲酰基纤维素酯的合成[5,6] 在配有回流冷凝管的50 mL三颈瓶中加入45 g(0016 mol)上述已制得的环十二烷基丁二酸单酰胺，20 mL无水二氯甲烷，氮气保护，室温下搅拌，用注射器加15 mL(0021 mol)二氯亚砜，室温下反应20 min，常压蒸除溶剂，把得到的酰氯产物在氮气保护下加入到已在吡啶中回流15 h的05 g微晶纤维素反应瓶中，100 ℃下回流28 h，冷却后过滤，滤液减压蒸除溶剂，得黑色粘稠液体，50 ℃真空干燥12 h，得纤维素一次衍生物。把纤维素一次衍生物加入到150 mL三口瓶中，加40 mL干燥吡啶，加热回流8 h，然后降到室温，注入2 mL苯甲酰氯，90 ℃反应20 h，冷却后过滤，减压蒸除溶剂得黑色粘稠液体，50 ℃真空干燥8 h，得到目标产物[10,11]。
2.3 固定相的涂敷与装柱[10]
取06 g纤维素衍生物溶于30 mL四氢呋喃，取10 mL加入到已装有3 g γ氨丙基硅胶的50 mL烧杯中，缓慢蒸发除去溶剂。重复两次，得到固定相。该固定相在正己烷异丙醇(95∶5，V/V)中分散均匀，以正己烷异丙醇(98∶2，V/V)为匀浆液，在40 MPa压力下装入不锈钢柱(250 mm×46 mm i.d.)中。
3 结果与讨论
3.1 目标物的合成
在目标物的合成过程中，考虑到环十二烷基丁二酸单酰胺分子体积较大，对纤维素分子中羟基的覆盖可能不完全，所以选用苯甲酰氯对纤维素上残余羟基进行二次酯化。红外光谱证实，衍生化以后，微晶纤维素在3 340 cm-1处原本很强的羟基吸收峰变的很弱，1 726 cm-1处出现了很强的酯羰基吸收峰，700 cm-1处出现苯环的单取代吸收峰，表明纤维素基本衍生完全。
采用核磁共振波谱对产物进行了分析。通常采用NMR分析聚合物的效果不好。但微晶纤维素经衍生化后产物可溶于CDCl3中，可用NMR分析。根据苯环上氢(δ 733~818)和环十二烷基上的氢(δ 113~225)的化学位移和积分数可算出纤维素衍生物十二员环和苯环的摩尔比约为4∶1(计算方法为:(环十二烷基氢积分值/23)∶(苯基氢积分值/5))，即纤维素衍生物中四个环十二烷基对应一个苯基。
3.2 色谱拆分对映体
以正己烷/异丙醇为流动相，对5种手性化合物进行了拆分。手性分离的结果见表1，色谱分离图见图1所示。
表1 一些手性物质的分离结果(略)
Table 1 Determination results of some chiral materials
分离结果显示，1对氟苯基乙醇，2对氯苯基丙腈获得了很好地分离效果， 1对叔丁基苯氧基2丙醇、三唑醇、2对氯苯基辛腈获得一定程度的分离。其中，2对氯苯基丙腈和2对氯苯基辛腈的分子结构的差别在于腈的炭链长度。但二者获得分离的程度差别很大，有可能是因为烷基的大小不同，造成了它们与固定相之间形成的分子之间相互作用的差异，从而产生不同的分离效果。5种对映异构体结构中都含有苯环，可与固定相上的苯环形成分子间pp电荷相互作用。另外，不同对映体结构中含有的氰基、羟基可与固定相上的羰基、氨基分别形成分子间氢键相互作用。研究认为,固定相环十二烷氨基羰基丙酰基、苯甲酰基纤维素酯本身结构所形成的手性空腔是其达到手性识别目的的重要因素。不同结构的外消旋对映体在这种固定相上获得分离的情况之所以不同，与其能否进入纤维素衍生物手性空腔内，形成有效的“三点相互作用”密切相关[8]。
图1 2对氯苯基丙腈(a)和1对叔丁基苯氧基2丙醇(b)对映体的色谱分离图(略)
Fig.1 Chromatograms of enantiomeric separation of CH3CH(pClC6H4)CN(a) and CH3CHOHCH2[p(CH3)3CC6H4](b)
表2 异丙醇含量对容量因子(k′)和选择性因子(α)的影响(略)
Table 2 Effect of isopropanol concentration in mobile phase on separation
3.3 流动相中异丙醇含量对分离结果的影响
实验以2对氯苯基丙腈的分离为例，考察了流动相中异丙醇含量对分离效果的影响，结果如表2所示。从分离结果可以看出，随着异丙醇体积分数逐渐减小，保留因子和选择性因子都在逐渐增大。优化分离条件为异丙醇含量为20%，分离因子可达1240。流动相中的极性成分异丙醇和样品分子竞争与固定相的作用，加快洗脱，所以增加异丙醇的含量可减小保留时间，同时立体选择作用也随之减小。
References
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3 Hu Zhiqiang(胡志强)， Guo Yujing(郭玉晶)， Xu Liangzhong(许良忠). Chinese Journal of Qingdao Institute of Chemical Technology(青岛化工学院学报)， 2001， 22(4): 350~351
4 Liang Xiaomei(梁晓梅)， Xu Yanli(徐燕莉)， Huang Haoping(黄少平)， Chen Jinghong(陈敬红)， Wang Daoquan(王道全). Chinese Journal of Chemical Reagents(化学试剂)， 1999， 21(2): 109~110
5 Gao Lijuan(高丽娟)， Zhang Lihua(张丽华)， Lin Bingchang(林丙昌). Chinese Journal of Chemical World(化学世界), 1999， 11： 589~592
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