新型压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器的研究
摘要 采用螺旋固定夹具构建一种新型插拔式压电石英晶体传感器，巯基化自组装技术固定抗人甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)的单克隆抗体，并组装成2×5型压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器。研究了压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器的响应特性及其影响因素。该微阵列传感器在AFP、CEA和PSA浓度分别为20~640 μg/L、156~50 μg/L和125~50 μg/L，压电石英晶体振荡频率偏移值对肿瘤标志物浓度呈现良好的响应特性。微阵列传感器用于68例临床血清标本的测定，结果与免疫化学发光法一致；相关系数分别为092、090和091。
关键词 压电免疫传感器，微阵列，肿瘤标志物
1 引言
肿瘤标志物(Tumor marker)是指恶性肿瘤在发生和增殖的过程中，由肿瘤细胞基因表达而合成分泌或是由机体对肿瘤反应而产生和升高，反映肿瘤存在和生长的一类化学物质，包括蛋白质、酶(同工酶)、蛋白类或肽类激素、多胺以及癌基因产物[1,2]。临床实验诊断常用的肿瘤标志物包括甲胎蛋白(alphafetoprotein AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)、前列腺特异抗原(prostate specific antigen PSA)、癌抗原125(cancer antigen CA125)以及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin hCG)等肿瘤相关性抗原或激素[3~6]。肿瘤标志物在肿瘤的早期辅助诊断与鉴别诊断、预后判断、治疗随访、转移与复发监测等方面具有重要意义。目前，肿瘤标志物临床检测的常用方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、免疫化学发光分析法等标记免疫测量技术。这些方法都存在必需标记、操作繁杂，特别是现有方法不能对多个肿瘤标志物同时联合检测。不同的肿瘤标志物采用不同的检测方法，造成标本采集量大,结果可比性差,检测周期长，不利于临床早期诊断与治疗，特别是大规模健康体检的筛查。因此，寻找和建立一种灵敏、特异、简单、快速且可精确定量和实时检测的替代新方法在临床实验诊断中具有重要的实用价值。压电免疫传感器是利用石英晶体作为换能器件，通过检测石英晶体振荡频率的改变反映晶体表面微小的质量变化[7]，把免疫反应的生物学信号转换成易于检测的频率信号。该技术具有亚ng级的质量检测能力，用单克隆抗体作识别分子，提高了传感器的检测特异性，已广泛应用于生物医药、环境监测、食品卫生检验以及军事等领域[ 8~10]。
本研究选取临床常用的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)或等肿瘤标志物为检测对象，利用螺旋固定的新型查拔式压电石英晶体传感器构建压电AFPCEAPSA免疫传感器微阵列，探讨该压电微阵列免疫传感器的起振能力、稳定性、检测影响因素及临床联合检测AFP、CEA、PSA的可行性，为临床肿瘤标志物的联合检测提供一种新方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
石英晶振采用AT切型，130 mm×130 mm的方片，双面镀金电极，基频10 MHz的石英晶体。金膜电极直径为40 mm，晶振电极的接触点引在晶振的同一表面，呈对称分布；PESA Detector3000振荡频率检测仪由中国信息产业部电子第26研究所研制。PESA2.0频率采集分析软件自行编制。自行改装后的5通道PCL836多功能频率计数卡(台湾研华公司)内置于方正奔Ⅲ型计算机(北大方正集团公司)。Acess化学发光免疫分析仪(美国BeckmanCoulter公司)。
抗人AFP(浓度分别为56 g/L)购自美国Biodesign公司；抗人CEA、PSA单克隆抗体(浓度分别为26 g/L、30 g/L)， Sulfosuccinimidyl 6[3′(2pyridyldithio)propionamido]hexanoate(SulfoLCSPDP)均为美国Pierce公司产品；AFP、CEA、PSA标准品采用化学发光免疫检测试剂盒的标准品(美国BeckmanCoulter公司，由西南医院黄君富博士惠赠)。其它试剂均为AR级。
2.2 螺旋固定插拔式石英晶体检测池的制作
2.2.1 螺旋固定式石英晶体检测池夹具的结构 螺旋式固定夹具由螺栓和螺帽两部分组成。螺栓底部密封形成石英晶体基片固定槽，并分布有2个弧形外接电极接触膜，外接电极通过底部绝缘孔经针式电极导出。螺母有通孔与外部相通，形成检测池金属外壁。检测池内壁为下部直径10 mm，上部直径6 mm的圆柱体乳胶套桶。检测池固定凹槽呈120度分布于检测池外壁(图1)。
图1 螺旋固定插拔式石英晶体传感器结构示意图(略)
Fig.1 Schematic diagram of insertplug model of piezoelectric sensor immobilized by screw clamping apparatus
A.螺母(nut)； B.螺栓(bolt)； C.乳胶套桶(latex bucket)； D.检测池固定底座(detection cell batholith)； 1.电路连接针(circuit connection needle)； 2.电极接触膜(electrode membrane joint)； 3.石英晶体金膜(quartz crystal golden membrane)； 4.螺栓(bolt)； 5.检测池固定凹槽(detection cell fixation groove)； 6.检测池固定凸线(detection cell fixation bolection)； 7.外电极导出套管(outer electrode cannula)。
2.2.2 插拔式石英晶体检测池组装传感器微阵列 石英晶体有两个电极接触点的一面向下置于螺栓底部的晶体固定槽并与外接电极膜接触。乳胶套桶置于螺栓腔体中与石英晶体表面紧密接触，缓慢旋紧螺母，组装成单面触液的石英晶体检测池。传感器固定底座设计为2×5型微阵列，单个检测池借助其自身重量以及固定凹槽和凸线固定于传感器基座，排列为2×5型微阵列。微阵列排布为Y1、Y2两行，X1、X2、X3、X4、X5共5列。Y1和Y2行分别设计为AFPCEAPSA的一个联合检测组合，X1列为AFP，X2列为CEA，X3列为PSA，X4列为样品空白检测池(不加检测样品)，X5列设置为Y1和Y2行的参比检测池，晶体不固定抗体分子，用牛血清白蛋白(BSA)包被。
2.3 石英晶体免疫传感器的制备
首先用网络分析仪测定石英晶体的Q值、阻抗、频率，以决定该晶体是否可以使用;按文献[11]的方法对石英晶体进行预处理。用N2气吹干后备用;抗体固定按文献[8]的方法稍加改进，固定抗体后的石英晶体N2气吹干，参比检测晶体用1%的BSA溶液封闭，4℃保存备用。
2.4 检测方法
2.4.1 压电石英晶体肿瘤标志物微阵列免疫传感器检测系统的构建 压电石英晶体肿瘤标志物微阵列免疫传感器与石英晶体振荡检测平台连接，观察在气相中阵列各晶振单元的振荡情况，调节或剔除频率不稳定的石英晶体振荡器。
2.4.2 压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器检测标准曲线 每个传感器检测池加入100 μL检测缓冲液(PBS液pH 72)，37℃平衡片刻，2×5路多通道实时检测各传感器单元的液相基频f1；然后分别加入10 μL不同浓度的AFP、CEA、PSA标准溶液，参比检测池加入相应的标准溶液，样品空白检测池加入同体积的检测缓冲液，继续检测至晶体振荡频率达到稳定平台，记录频率f2，频率偏移值Δf= f1-f2。标准曲线每个浓度点重复3次。本研究实验数据采用SPSS10.0统计分析软件进行线性回归分析、x2检验和配对资料t检验。68例临床检测标本中，包括肝癌12例、大肠癌14例、胃癌10例、宫颈癌9例、睾丸畸胎瘤3例，健康体检者20例，采集静脉血3 mL，分离血清备用，按相同方法进行检测。
2.5 压电免疫传感器阵列的再生
检测使用过的压电石英晶体免疫传感器，加入80 mol/L的尿素溶液100 μL，再生反应15 min后，分别用双蒸水和PBS缓冲液(015 mol/L，pH 72)洗涤5次。再生后的传感器重复用于下一次检测。
3 结果与讨论
3.1 螺旋固定插拔式压电石英晶体传感器的振荡特性
构建的螺旋固定插拔式压电石英晶体传感器，用乳胶套桶和螺旋固定方式替代粘胶等其它连接方法，可调节乳胶套桶与石英晶体的接触位置和受压力大小，使石英晶体表面各部位所受压力大小一致，应力分布均匀，绝对应力为0。克服了传统石英晶体检测池制作过程中，因应力不均所致的不易起振和振荡不稳等问题。本实验构建的插拔式石英晶体传感器与前文[8]报道的压电石英晶体微阵列传感器相比，一是检测池固定方式，采用了螺旋固定结构；二是阵列传感器组装方式，采用了单个插拔式石英晶体传感器构建微阵列。这种金属检测池壁有效地屏蔽了外界电磁场的干扰。因此，螺旋固定插拔式石英晶体传感器起振能力强，振荡频率稳定，频率稳定度气相为±1 Hz，液相±2 Hz(如图2所示)。新型螺旋固定查拔式石英晶体传感器方便了传感器微阵列的排布与组装，在实验诊断过程中，可根据检测需要，随时调整传感器微阵列的排布，其实用性、可操作性更强。
图2 螺旋固定查拔式压电石英晶体传感器的振荡频率变化趋势图(略)
Fig. Typical resonant frequency curve of 2×5 insertplug model of piezoelectric quartzmicroarray by screw clamp method
A.气相(gas phase)； B.液相(liquid phase)。
图3 压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测频率随时间的变化趋势图(略)
Fig.3 Tendency of frequency change with time of piezoelectric quartz crystal αtetoprotein(AFP)carcinoembryonic antigen(CEA)prostate specificantigen(PSA) microarray immunosensor
a.PSA(100 μg/L ); b.AFP(8 μg/L); c.参比检测(reference well ); d.CEA(5 μg/L)。
3.2 微阵列免疫传感器的响应特性
3.2.1 温度对阵列传感器的影响 实验结果与文献[11]报道一致。在10~30℃之间，石英晶体振荡频率随温度变化较小，表明免疫反应进展缓慢。随温度升高，频率变化迅速增大。温度在35~37℃之间，频率响应最大，表现为晶体频率下降趋势图斜率加大，反应速度加快。当温度再继续升高时，会使已结合的抗原和抗体再解离，甚至使抗体变性或失活，压电传感器响应频率反而迅速减小。
3.2.2 阵列传感器检测时间的确定 图3分别为压电石英晶体微阵列传感器检测AFP、CEA、PSA的频率变化趋势图。从图中可以看到加入目的检测物后，随着抗原抗体反应的启动和持续进行，石英晶体表面的免疫复合物逐渐增加，晶体表面质量负载加大，其振荡频率逐渐下降，当抗原与抗体反应40 min后，频率基本达到稳定平台。继续检测10 min，频率降低已不显著。表明抗原抗体反应已达到平衡，免疫反应基本完成。因此，确定50 min作为压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器的检测时间。
3.2.3 阵列免疫传感器检测的特异性 检测特异性是传感器的重要参数。对免疫传感器而言，其检测特异性决定于抗体的种类。本实验利用单克隆抗体作为抗体识别分子，对其相应的肿瘤标志物抗原决定簇的识别具有很高的特异性。用微阵列免疫传感器分别交叉检测除目的待测物质以外的肿瘤标志物标准品溶液，石英晶体振荡频率的非特异响应值如表1所示。非特异结合所致的频率变化与传感器的空白噪声信号无显著性差异。结果表明，构建的微阵列免疫传感器检测目的肿瘤标志物基本无交叉反应，不相互干扰。因此，压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器具有较好的选择性和特异性，能满足肿瘤标志物临床组合检测的需要。
表1 压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器的非特异响应特性(略)
Table 1 Nonspecific response of piezoelectric quartz crystal AFPCEAPSA microarray immunosensor
甲胎蛋白(alphafetoprotein AFP):320 μg/L; 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA):25 μg/L; 前列腺抗原(prostate specific antigen PSA):10 μg/L; P>0.05 vs blank。
图4 压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测标准曲线(略)
Fig.4 Standard response curve of piezoelectric quartz crystal microarray immunosensor to AFP、CEA and PSA concentrations
a. CEA: 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 μg/L); b. PSA: 1.25, 2.5, 5, 10, 25, 50 and 100 μg/L); c. AFP: 20, 40, 80, 160, 320, 640 and 1000 μg/L. The background value has been subtracted.
图5 压电微阵列免疫传感器结合活性与再生次数的关系(略)
Fig.5 Relationship of binding activity changes of piezoelectric quartz crystal microarray immunosensor and regeneration times
3.2.4 阵列免疫传感器检测的重复性 压电石英晶体免疫传感器检测的重复性与石英晶体传感器表面抗体分子固定的一致性密切相关。为了评价其检测重复性，用同一份血清标本，重复检测20次，计算检测结果的CV。结果表明压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测的重复性:批内CV<5%;批间<10%，说明该方法的检测重复性良好。
3.2.5 阵列免疫传感器检测标准曲线制作 微阵列免疫传感器对每个浓度点的频率响应值(Δf=f0-f1)用参考检测值和样品空白值进行校正后，以标准溶液浓度为横坐标，频率变化的绝对值Δf为纵坐标作图。压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器检测的标准曲线如图4所示。从图4可以看出，AFP、CEA、PSA的浓度分别在20~640 μg/L、156~50 μg/L、125~50 μg/L范围内，阵列传感器响应频率变化与其相应浓度之间呈现良好的响应特性。AFP浓度低于20 μg/L、156 μg/L、125 μg/L和25 IU/L时，传感器频率的特异性响应信号易被噪声信号淹没。因此，压电肿瘤标志物免疫传感器阵列检测AFP、CEA、PSA的最低检出限分别为20 μg/L、156 μg/L和125 μg/L。其检测灵敏度高，与放免分析法的检测灵敏度相当，能满足肿瘤标志物的临床定量检测。
3.3 阵列免疫传感器检测临床标本
68例临床标本检测结果与化学发光免疫法检测结果作线性相关分析，压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器与免疫化学发光分析法的相关系数r见表2。结果显示，压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测法与传统标记免疫分析技术结果符合(P>005)。
表2 两种检测方法的相关性分析(r.相关系数)(略)
Table 2 Relativity analysis of piezoelectric microarray immunosensor and chemiluminescence immunoassay methods(r.correlation coefficients)
*:免疫化学发光分析法(chemiluminescence immunoassay method)。
3.4 阵列免疫传感器的再生
免疫传感器能否重复使用直接影响它的实用性。使用过的微阵列免疫传感器用80 mol/L的尿素可使AuAb键解离。再生后，重新用于检测。结果如图5所示。压电石英晶体免疫传感器再生后，传感器仍有良好的响应特性，但其响应能力呈逐渐下降趋势。前3次再生，传感器响应能力下降不明显;再生5次,传感器仍保留70%的响应能力;再生5次以后，传感器响应能力下降加速。
References
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本文系国家自然科学基金(No.20405016)、国家“863”计划(No.2002AARZ2023)和国家科技部九五科学仪器攻关项目(No.96A230404)
(第三军医大学西南医院检验科，重庆 400038)
(中国嘉陵集团生物工程办公室，重庆400032)
(信息产业部电子第26研究所，重庆 400060), 百拇医药(张波 府伟灵 张雪 陈庆海 徐世军 唐代华)
关键词 压电免疫传感器，微阵列，肿瘤标志物
1 引言
肿瘤标志物(Tumor marker)是指恶性肿瘤在发生和增殖的过程中，由肿瘤细胞基因表达而合成分泌或是由机体对肿瘤反应而产生和升高，反映肿瘤存在和生长的一类化学物质，包括蛋白质、酶(同工酶)、蛋白类或肽类激素、多胺以及癌基因产物[1,2]。临床实验诊断常用的肿瘤标志物包括甲胎蛋白(alphafetoprotein AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA)、前列腺特异抗原(prostate specific antigen PSA)、癌抗原125(cancer antigen CA125)以及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin hCG)等肿瘤相关性抗原或激素[3~6]。肿瘤标志物在肿瘤的早期辅助诊断与鉴别诊断、预后判断、治疗随访、转移与复发监测等方面具有重要意义。目前，肿瘤标志物临床检测的常用方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、免疫化学发光分析法等标记免疫测量技术。这些方法都存在必需标记、操作繁杂，特别是现有方法不能对多个肿瘤标志物同时联合检测。不同的肿瘤标志物采用不同的检测方法，造成标本采集量大,结果可比性差,检测周期长，不利于临床早期诊断与治疗，特别是大规模健康体检的筛查。因此，寻找和建立一种灵敏、特异、简单、快速且可精确定量和实时检测的替代新方法在临床实验诊断中具有重要的实用价值。压电免疫传感器是利用石英晶体作为换能器件，通过检测石英晶体振荡频率的改变反映晶体表面微小的质量变化[7]，把免疫反应的生物学信号转换成易于检测的频率信号。该技术具有亚ng级的质量检测能力，用单克隆抗体作识别分子，提高了传感器的检测特异性，已广泛应用于生物医药、环境监测、食品卫生检验以及军事等领域[ 8~10]。
本研究选取临床常用的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)或等肿瘤标志物为检测对象，利用螺旋固定的新型查拔式压电石英晶体传感器构建压电AFPCEAPSA免疫传感器微阵列，探讨该压电微阵列免疫传感器的起振能力、稳定性、检测影响因素及临床联合检测AFP、CEA、PSA的可行性，为临床肿瘤标志物的联合检测提供一种新方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
石英晶振采用AT切型，130 mm×130 mm的方片，双面镀金电极，基频10 MHz的石英晶体。金膜电极直径为40 mm，晶振电极的接触点引在晶振的同一表面，呈对称分布；PESA Detector3000振荡频率检测仪由中国信息产业部电子第26研究所研制。PESA2.0频率采集分析软件自行编制。自行改装后的5通道PCL836多功能频率计数卡(台湾研华公司)内置于方正奔Ⅲ型计算机(北大方正集团公司)。Acess化学发光免疫分析仪(美国BeckmanCoulter公司)。
抗人AFP(浓度分别为56 g/L)购自美国Biodesign公司；抗人CEA、PSA单克隆抗体(浓度分别为26 g/L、30 g/L)， Sulfosuccinimidyl 6[3′(2pyridyldithio)propionamido]hexanoate(SulfoLCSPDP)均为美国Pierce公司产品；AFP、CEA、PSA标准品采用化学发光免疫检测试剂盒的标准品(美国BeckmanCoulter公司，由西南医院黄君富博士惠赠)。其它试剂均为AR级。
2.2 螺旋固定插拔式石英晶体检测池的制作
2.2.1 螺旋固定式石英晶体检测池夹具的结构 螺旋式固定夹具由螺栓和螺帽两部分组成。螺栓底部密封形成石英晶体基片固定槽，并分布有2个弧形外接电极接触膜，外接电极通过底部绝缘孔经针式电极导出。螺母有通孔与外部相通，形成检测池金属外壁。检测池内壁为下部直径10 mm，上部直径6 mm的圆柱体乳胶套桶。检测池固定凹槽呈120度分布于检测池外壁(图1)。
图1 螺旋固定插拔式石英晶体传感器结构示意图(略)
Fig.1 Schematic diagram of insertplug model of piezoelectric sensor immobilized by screw clamping apparatus
A.螺母(nut)； B.螺栓(bolt)； C.乳胶套桶(latex bucket)； D.检测池固定底座(detection cell batholith)； 1.电路连接针(circuit connection needle)； 2.电极接触膜(electrode membrane joint)； 3.石英晶体金膜(quartz crystal golden membrane)； 4.螺栓(bolt)； 5.检测池固定凹槽(detection cell fixation groove)； 6.检测池固定凸线(detection cell fixation bolection)； 7.外电极导出套管(outer electrode cannula)。
2.2.2 插拔式石英晶体检测池组装传感器微阵列 石英晶体有两个电极接触点的一面向下置于螺栓底部的晶体固定槽并与外接电极膜接触。乳胶套桶置于螺栓腔体中与石英晶体表面紧密接触，缓慢旋紧螺母，组装成单面触液的石英晶体检测池。传感器固定底座设计为2×5型微阵列，单个检测池借助其自身重量以及固定凹槽和凸线固定于传感器基座，排列为2×5型微阵列。微阵列排布为Y1、Y2两行，X1、X2、X3、X4、X5共5列。Y1和Y2行分别设计为AFPCEAPSA的一个联合检测组合，X1列为AFP，X2列为CEA，X3列为PSA，X4列为样品空白检测池(不加检测样品)，X5列设置为Y1和Y2行的参比检测池，晶体不固定抗体分子，用牛血清白蛋白(BSA)包被。
2.3 石英晶体免疫传感器的制备
首先用网络分析仪测定石英晶体的Q值、阻抗、频率，以决定该晶体是否可以使用;按文献[11]的方法对石英晶体进行预处理。用N2气吹干后备用;抗体固定按文献[8]的方法稍加改进，固定抗体后的石英晶体N2气吹干，参比检测晶体用1%的BSA溶液封闭，4℃保存备用。
2.4 检测方法
2.4.1 压电石英晶体肿瘤标志物微阵列免疫传感器检测系统的构建 压电石英晶体肿瘤标志物微阵列免疫传感器与石英晶体振荡检测平台连接，观察在气相中阵列各晶振单元的振荡情况，调节或剔除频率不稳定的石英晶体振荡器。
2.4.2 压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器检测标准曲线 每个传感器检测池加入100 μL检测缓冲液(PBS液pH 72)，37℃平衡片刻，2×5路多通道实时检测各传感器单元的液相基频f1；然后分别加入10 μL不同浓度的AFP、CEA、PSA标准溶液，参比检测池加入相应的标准溶液，样品空白检测池加入同体积的检测缓冲液，继续检测至晶体振荡频率达到稳定平台，记录频率f2，频率偏移值Δf= f1-f2。标准曲线每个浓度点重复3次。本研究实验数据采用SPSS10.0统计分析软件进行线性回归分析、x2检验和配对资料t检验。68例临床检测标本中，包括肝癌12例、大肠癌14例、胃癌10例、宫颈癌9例、睾丸畸胎瘤3例，健康体检者20例，采集静脉血3 mL，分离血清备用，按相同方法进行检测。
2.5 压电免疫传感器阵列的再生
检测使用过的压电石英晶体免疫传感器，加入80 mol/L的尿素溶液100 μL，再生反应15 min后，分别用双蒸水和PBS缓冲液(015 mol/L，pH 72)洗涤5次。再生后的传感器重复用于下一次检测。
3 结果与讨论
3.1 螺旋固定插拔式压电石英晶体传感器的振荡特性
构建的螺旋固定插拔式压电石英晶体传感器，用乳胶套桶和螺旋固定方式替代粘胶等其它连接方法，可调节乳胶套桶与石英晶体的接触位置和受压力大小，使石英晶体表面各部位所受压力大小一致，应力分布均匀，绝对应力为0。克服了传统石英晶体检测池制作过程中，因应力不均所致的不易起振和振荡不稳等问题。本实验构建的插拔式石英晶体传感器与前文[8]报道的压电石英晶体微阵列传感器相比，一是检测池固定方式，采用了螺旋固定结构；二是阵列传感器组装方式，采用了单个插拔式石英晶体传感器构建微阵列。这种金属检测池壁有效地屏蔽了外界电磁场的干扰。因此，螺旋固定插拔式石英晶体传感器起振能力强，振荡频率稳定，频率稳定度气相为±1 Hz，液相±2 Hz(如图2所示)。新型螺旋固定查拔式石英晶体传感器方便了传感器微阵列的排布与组装，在实验诊断过程中，可根据检测需要，随时调整传感器微阵列的排布，其实用性、可操作性更强。
图2 螺旋固定查拔式压电石英晶体传感器的振荡频率变化趋势图(略)
Fig. Typical resonant frequency curve of 2×5 insertplug model of piezoelectric quartzmicroarray by screw clamp method
A.气相(gas phase)； B.液相(liquid phase)。
图3 压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测频率随时间的变化趋势图(略)
Fig.3 Tendency of frequency change with time of piezoelectric quartz crystal αtetoprotein(AFP)carcinoembryonic antigen(CEA)prostate specificantigen(PSA) microarray immunosensor
a.PSA(100 μg/L ); b.AFP(8 μg/L); c.参比检测(reference well ); d.CEA(5 μg/L)。
3.2 微阵列免疫传感器的响应特性
3.2.1 温度对阵列传感器的影响 实验结果与文献[11]报道一致。在10~30℃之间，石英晶体振荡频率随温度变化较小，表明免疫反应进展缓慢。随温度升高，频率变化迅速增大。温度在35~37℃之间，频率响应最大，表现为晶体频率下降趋势图斜率加大，反应速度加快。当温度再继续升高时，会使已结合的抗原和抗体再解离，甚至使抗体变性或失活，压电传感器响应频率反而迅速减小。
3.2.2 阵列传感器检测时间的确定 图3分别为压电石英晶体微阵列传感器检测AFP、CEA、PSA的频率变化趋势图。从图中可以看到加入目的检测物后，随着抗原抗体反应的启动和持续进行，石英晶体表面的免疫复合物逐渐增加，晶体表面质量负载加大，其振荡频率逐渐下降，当抗原与抗体反应40 min后，频率基本达到稳定平台。继续检测10 min，频率降低已不显著。表明抗原抗体反应已达到平衡，免疫反应基本完成。因此，确定50 min作为压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器的检测时间。
3.2.3 阵列免疫传感器检测的特异性 检测特异性是传感器的重要参数。对免疫传感器而言，其检测特异性决定于抗体的种类。本实验利用单克隆抗体作为抗体识别分子，对其相应的肿瘤标志物抗原决定簇的识别具有很高的特异性。用微阵列免疫传感器分别交叉检测除目的待测物质以外的肿瘤标志物标准品溶液，石英晶体振荡频率的非特异响应值如表1所示。非特异结合所致的频率变化与传感器的空白噪声信号无显著性差异。结果表明，构建的微阵列免疫传感器检测目的肿瘤标志物基本无交叉反应，不相互干扰。因此，压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器具有较好的选择性和特异性，能满足肿瘤标志物临床组合检测的需要。
表1 压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器的非特异响应特性(略)
Table 1 Nonspecific response of piezoelectric quartz crystal AFPCEAPSA microarray immunosensor
甲胎蛋白(alphafetoprotein AFP):320 μg/L; 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA):25 μg/L; 前列腺抗原(prostate specific antigen PSA):10 μg/L; P>0.05 vs blank。
图4 压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测标准曲线(略)
Fig.4 Standard response curve of piezoelectric quartz crystal microarray immunosensor to AFP、CEA and PSA concentrations
a. CEA: 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 μg/L); b. PSA: 1.25, 2.5, 5, 10, 25, 50 and 100 μg/L); c. AFP: 20, 40, 80, 160, 320, 640 and 1000 μg/L. The background value has been subtracted.
图5 压电微阵列免疫传感器结合活性与再生次数的关系(略)
Fig.5 Relationship of binding activity changes of piezoelectric quartz crystal microarray immunosensor and regeneration times
3.2.4 阵列免疫传感器检测的重复性 压电石英晶体免疫传感器检测的重复性与石英晶体传感器表面抗体分子固定的一致性密切相关。为了评价其检测重复性，用同一份血清标本，重复检测20次，计算检测结果的CV。结果表明压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测的重复性:批内CV<5%;批间<10%，说明该方法的检测重复性良好。
3.2.5 阵列免疫传感器检测标准曲线制作 微阵列免疫传感器对每个浓度点的频率响应值(Δf=f0-f1)用参考检测值和样品空白值进行校正后，以标准溶液浓度为横坐标，频率变化的绝对值Δf为纵坐标作图。压电肿瘤标志物微阵列免疫传感器检测的标准曲线如图4所示。从图4可以看出，AFP、CEA、PSA的浓度分别在20~640 μg/L、156~50 μg/L、125~50 μg/L范围内，阵列传感器响应频率变化与其相应浓度之间呈现良好的响应特性。AFP浓度低于20 μg/L、156 μg/L、125 μg/L和25 IU/L时，传感器频率的特异性响应信号易被噪声信号淹没。因此，压电肿瘤标志物免疫传感器阵列检测AFP、CEA、PSA的最低检出限分别为20 μg/L、156 μg/L和125 μg/L。其检测灵敏度高，与放免分析法的检测灵敏度相当，能满足肿瘤标志物的临床定量检测。
3.3 阵列免疫传感器检测临床标本
68例临床标本检测结果与化学发光免疫法检测结果作线性相关分析，压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器与免疫化学发光分析法的相关系数r见表2。结果显示，压电石英晶体AFPCEAPSA微阵列免疫传感器检测法与传统标记免疫分析技术结果符合(P>005)。
表2 两种检测方法的相关性分析(r.相关系数)(略)
Table 2 Relativity analysis of piezoelectric microarray immunosensor and chemiluminescence immunoassay methods(r.correlation coefficients)
*:免疫化学发光分析法(chemiluminescence immunoassay method)。
3.4 阵列免疫传感器的再生
免疫传感器能否重复使用直接影响它的实用性。使用过的微阵列免疫传感器用80 mol/L的尿素可使AuAb键解离。再生后，重新用于检测。结果如图5所示。压电石英晶体免疫传感器再生后，传感器仍有良好的响应特性，但其响应能力呈逐渐下降趋势。前3次再生，传感器响应能力下降不明显;再生5次,传感器仍保留70%的响应能力;再生5次以后，传感器响应能力下降加速。
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本文系国家自然科学基金(No.20405016)、国家“863”计划(No.2002AARZ2023)和国家科技部九五科学仪器攻关项目(No.96A230404)
(第三军医大学西南医院检验科，重庆 400038)
(中国嘉陵集团生物工程办公室，重庆400032)
(信息产业部电子第26研究所，重庆 400060), 百拇医药(张波 府伟灵 张雪 陈庆海 徐世军 唐代华)