基于Nafion膜修饰的血吸虫抗体压电免疫传感器研究
摘要 将Nafion膜包埋血吸虫抗原固定在石英晶体微天平表面上，构制了用于测定血清中血吸虫抗体的压电免疫传感器。这种生物敏感膜由涂敷在石英晶片表面上的一滴Nafion+血吸虫抗原磷酸盐缓冲液干燥而成，它的构制和再生过程具有良好的重现性。用扫描电镜观察了这种生物敏感膜的形貌，并对传感器的构制参数、测量条件进行了优化，优化的传感器对血吸虫抗体的检测范围为02~60 mg/L。本传感器具有仪器简单、操作方便、灵敏度高、重现性好等优点，可判断血吸虫感染情况。
关键词 Nafion膜，石英晶体微天平，血吸虫抗体，压电免疫传感器
1 引言
免疫传感器是一种将传感技术和免疫反应结合起来检测样品中微量物质的检测技术。设计免疫传感器的关键是免疫试剂在转换器上的固定化[1~5]。一般的固定方法有包埋法、直接吸附法和交联法等。Nafion是经过磺化的氟聚醚——一种阴离子型聚电解质高分子材料。其内部的氟碳骨架是疏水的，而离子化的磺酸基是亲水的。Nafion膜具有良好的生物兼容性，离子选择性，机械及化学稳定性，它已用于构制生物免疫传感器[6~8] 。使用Nafion膜包埋固定日本血吸虫抗原(SjAg)，并修饰在石英晶片表面上制成压电免疫传感器，用于测定日本血吸虫抗体(SjAb)。日本血吸虫病是分布较广的寄生虫病之一。在我国南方江湖区，血吸虫仍然威胁广大人们的身体健康。因此研制一种灵敏、简便、快捷的检测日本血吸虫抗体的方法具有实际意义。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
CN3165型高分辨计数器(石家庄无线电四厂);石英晶体谐振器(北京七○七厂)，AT切型，9 MHz双面镀金电极，晶片直径12 mm，电极直径6 mm，自制TTLIC谐振电路。日本血吸虫抗原(SjAg)、日本血吸虫抗体(SjAb)、日本血吸虫感染兔血清样品均由中南大学湘雅医学院寄生虫教研室提供。5%Nafion溶液(Sigma公司)。不同浓度的抗体溶液是用含有1%(m/m)牛血清蛋白的pH=70的01 mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释而成。测量溶液为01 mol/L磷酸盐缓冲溶液。所用试剂均为分析纯，溶液均为二次蒸馏水配制。
2.2 传感器的制备
石英晶片在使用前用丙酮试液洗净,水洗,干燥备用。Nafion+SjAg溶液用5%Nafion溶液与SjAg磷酸缓冲溶液按1∶5比例配制而成。取5 μL的Nafion+SjAg溶液涂敷在石英晶片表面，在空气中干燥，经含有1%(m/m)牛血清蛋白的蒸馏水洗后放入冰箱中保存备用。
2.3 免疫分析过程
将包被了SjAg抗原的石英晶片安装在盛有30 mL磷酸缓冲液的检测池中,在不断搅拌下进行测定,待石英晶片的振荡频率稳定后,注入一定浓度的待测SjAb抗体,记录其频率响应值。每次测量完成以后，在pH为23的01 mol/L的HCl+KCl+甘氨酸溶液里离解免疫复合物，洗去待测物后即可进行下一次测量。石英晶片上的Nafion修饰膜也可用酒精溶液洗去，然后对石英晶片进行重新修饰处理即得新的免疫传感器。
3 结果与讨论
3.1 Nafion含量的影响
血吸虫抗原通过Nafion膜包埋固定在石英晶片表面上，Nafion膜的结果影响抗原的固定化及其免疫反应。用扫描电镜观察了不同浓度Nafion溶液形成的Nafion膜的形貌，如图1所示。较浓的Nafion溶液形成的Nafion膜结构密实，不利于免疫反应的发生；而浓度较低的Nafion溶液形成的Nafion膜结构松散，不利于抗原的固定化。适中的Nafion溶液形成的Nafion膜有一定的空间,允许免疫反应顺利进行，又能兼顾抗原的固定化。因此，用含1% Nafion 的SjAg溶液来修饰石英晶片。
图1 不同浓度Nafion溶液形成膜的扫描电子显微图(略)
Fig.1 Scanning electron micrographs of Nafion film resulted from varying concentration
a.2%; b.1%; c.0.5%.
3.2 SjAg量的影响
用血吸虫抗原含量不同的Nafion溶液构成石英晶片传感器。在pH=70磷酸盐缓冲溶液中，测量其对48 mg/L的SjAb 抗体的响应。如图2所示，随着Nafion膜包埋的血吸虫抗原量的增加，传感器频率响应增大，但Nafion膜包埋的血吸虫抗原量超过75 μg，响应值有所下降，这可能是其固定化和反应空间不理想所致。因此选择用包埋75 μg SjAg的Nafion膜构制压电免疫传感器。
图2 Nafion固定的血吸虫抗原的量对传感器频率响应的影响(略)
Fig.2 Effect of schistosoma japonicum antigen(SjAg) amount loading in Nafion film on frequency response of immunosensor
传感器在浓度为4.8 mg/L的血吸虫抗体培育液中培育40 min(immunosensor was incubated with 4.8 mg/L SjAb for 40 min)。
3.3 免疫反应时间的影响
培育溶液中抗体到达敏感石英晶片表面与固定的抗原发生免疫反应，形成免疫复合物需要一定的时间。将Nafion包埋SjAg抗原修饰的石英晶片浸入28 mg/L的SjAb抗体标准溶液里，测量传感器的频率响应与免疫反应时间的关系，如图3所示。刚开始一段时间里，免疫反应使响应频率降低得很快，随后逐渐变慢。抗原抗体反应40 min后，频率没有明显下降，表明免疫反应已基本完成。因此，实验选用40 min作为样品的检测时间。
图3 培育时间对传感器频率响应的影响(略)
Fig.3 Relationship between frequency change of immunosensor and the incubation time of SjAb
传感器在浓度为2.8 mg/L的血吸虫抗体培育液中培育(immunosensor was incubated with 2.8 mg/L SjAb for different incubation period)。
图4 培育溶液pH值对传感器频率响应的影响(略)
Fig.4 Effect of the pH of incubating phosphate buffer(PBS) solution on frequency response of immunosensor
传感器在浓度为4.8 mg/L的血吸虫抗体培育液中培育40 min(The immunosensor was incubated with 4.8 mg/L SjAb for 40 min)。
3.4 测量溶液pH值影响
蛋白质的抗原和抗体都是两性电解质，其荷电状况与溶液的pH 值密切相关。实验考察了不同pH值的石英晶体传感器在48 mg/L的SjAb培育溶液中的频率响应。如图4所示，在pH=70时，传感器的响应值最大，因此，测量在pH=70磷酸盐缓冲溶液中进行。
3.5 构制传感器的重现性
在传感器进行一系列测量后，石英晶片上的Nafion修饰膜也可用酒精溶解，经重新修饰生物敏感膜后，得到新的传感器。用传感器测量18 mg/L SjAg标准溶液6次，测量相对标准偏差小于8%，说明所构制的传感器具有良好的重现性。每一个传感器在进行一次测量后，经再生液处理即可进行下一次测量，其测量相对标准偏差在6%以内，符合生化检测要求。
3.6 工作曲线及样品测量
图5 传感器响应频率与血吸虫抗体浓度关系(略)
Fig.5 Relationship between the frequency change of immunosensor and SjAb concentration
每个响应值是4次测量值的平均值，其相对标准偏差≤6%(each point represents the mean of four determinations and RSD was below 6%)。
在优化的实验条件下，应用传感器测定了一系列不同SjAb浓度下的传感器的频率响应，得到其标准曲线,如图5所示。在02~60 mg/L的SjAb浓度范围内，传感器的频率改变值与待测物浓度成线性相关。用传感器对血吸虫抗体进行了回归分析，如表1所示。
表1 传感器对血吸虫抗体的回收检测实验(略)
Table 1 Recovery of SjAb assay by using the proposed immunosensor
使用传感器测量了一些感染血吸虫程度不同的兔血清，感染血吸虫程度是指实验兔子感染血吸虫的天数。如表2所示，感染血吸虫时间越长的血清样品，传感器对其响应的频率改变值越大。因此,传感器可以用于判断血吸虫感染程度。
表2 传感器对感染血吸虫程度的判断(略)
Table 2 Determination result of schistosoma japonicum Infection degree
感染血吸虫程度是指实验兔子感染血吸虫的天数(the infection degree is designed to the number of day in immunizing rabbits experiments)。
References
1 Babacan S, Pivarnik P, Letcher S, Rand A G. Biosensors and Bioelectronics, 2000, 15： 615~621
2 Li J H, He X X, Wu Z Y, Wang K M, Shen G L, Yu R Q. Anal. Chim. Acta, 2003, 481： 191~198
3 Duman M, Saber R, Erhan P K. Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18：1355~1363
4 Wang H, Li J H, Ding Y J, Lei C X, Shen G L, Yu R Q. Anal. Chim. Acta, 2004, 501： 37~43
5 Deng T, Wang H, Li J S, Hu S Q, Shen G L, Yu R Q. Sensors and Actuators B, 2004, 99： 123~ 129
6 Tang D P, Yuan R, Chai Y Q, Zhang L Y, Zhong X, Dai J Y, Liu Y. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2004, 61： 299~311
7 Zhou Y M, Wu Z Y, Shen G L, Yu R Q. Sensors and Actuators B, 2003, 89： 292~298
8 Deng T, Li J S, Wang H, Shen G L, Yu R Q. Journal of Immunological Methods, 2005, 299： 1~8
本文系国家自然科学基金(No.20375008)资助项目、广东省教育厅自然科学研究项目(No.Z03093)和东莞市科技局项目(No.ZC060401,No.ZC051209)
(东莞理工学院化学生物工程系，东莞 523106)
(湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室, 长沙 410082), 百拇医药(周亚民 王永东 王桦 吴朝阳 沈国励)
关键词 Nafion膜，石英晶体微天平，血吸虫抗体，压电免疫传感器
1 引言
免疫传感器是一种将传感技术和免疫反应结合起来检测样品中微量物质的检测技术。设计免疫传感器的关键是免疫试剂在转换器上的固定化[1~5]。一般的固定方法有包埋法、直接吸附法和交联法等。Nafion是经过磺化的氟聚醚——一种阴离子型聚电解质高分子材料。其内部的氟碳骨架是疏水的，而离子化的磺酸基是亲水的。Nafion膜具有良好的生物兼容性，离子选择性，机械及化学稳定性，它已用于构制生物免疫传感器[6~8] 。使用Nafion膜包埋固定日本血吸虫抗原(SjAg)，并修饰在石英晶片表面上制成压电免疫传感器，用于测定日本血吸虫抗体(SjAb)。日本血吸虫病是分布较广的寄生虫病之一。在我国南方江湖区，血吸虫仍然威胁广大人们的身体健康。因此研制一种灵敏、简便、快捷的检测日本血吸虫抗体的方法具有实际意义。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
CN3165型高分辨计数器(石家庄无线电四厂);石英晶体谐振器(北京七○七厂)，AT切型，9 MHz双面镀金电极，晶片直径12 mm，电极直径6 mm，自制TTLIC谐振电路。日本血吸虫抗原(SjAg)、日本血吸虫抗体(SjAb)、日本血吸虫感染兔血清样品均由中南大学湘雅医学院寄生虫教研室提供。5%Nafion溶液(Sigma公司)。不同浓度的抗体溶液是用含有1%(m/m)牛血清蛋白的pH=70的01 mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释而成。测量溶液为01 mol/L磷酸盐缓冲溶液。所用试剂均为分析纯，溶液均为二次蒸馏水配制。
2.2 传感器的制备
石英晶片在使用前用丙酮试液洗净,水洗,干燥备用。Nafion+SjAg溶液用5%Nafion溶液与SjAg磷酸缓冲溶液按1∶5比例配制而成。取5 μL的Nafion+SjAg溶液涂敷在石英晶片表面，在空气中干燥，经含有1%(m/m)牛血清蛋白的蒸馏水洗后放入冰箱中保存备用。
2.3 免疫分析过程
将包被了SjAg抗原的石英晶片安装在盛有30 mL磷酸缓冲液的检测池中,在不断搅拌下进行测定,待石英晶片的振荡频率稳定后,注入一定浓度的待测SjAb抗体,记录其频率响应值。每次测量完成以后，在pH为23的01 mol/L的HCl+KCl+甘氨酸溶液里离解免疫复合物，洗去待测物后即可进行下一次测量。石英晶片上的Nafion修饰膜也可用酒精溶液洗去，然后对石英晶片进行重新修饰处理即得新的免疫传感器。
3 结果与讨论
3.1 Nafion含量的影响
血吸虫抗原通过Nafion膜包埋固定在石英晶片表面上，Nafion膜的结果影响抗原的固定化及其免疫反应。用扫描电镜观察了不同浓度Nafion溶液形成的Nafion膜的形貌，如图1所示。较浓的Nafion溶液形成的Nafion膜结构密实，不利于免疫反应的发生；而浓度较低的Nafion溶液形成的Nafion膜结构松散，不利于抗原的固定化。适中的Nafion溶液形成的Nafion膜有一定的空间,允许免疫反应顺利进行，又能兼顾抗原的固定化。因此，用含1% Nafion 的SjAg溶液来修饰石英晶片。
图1 不同浓度Nafion溶液形成膜的扫描电子显微图(略)
Fig.1 Scanning electron micrographs of Nafion film resulted from varying concentration
a.2%; b.1%; c.0.5%.
3.2 SjAg量的影响
用血吸虫抗原含量不同的Nafion溶液构成石英晶片传感器。在pH=70磷酸盐缓冲溶液中，测量其对48 mg/L的SjAb 抗体的响应。如图2所示，随着Nafion膜包埋的血吸虫抗原量的增加，传感器频率响应增大，但Nafion膜包埋的血吸虫抗原量超过75 μg，响应值有所下降，这可能是其固定化和反应空间不理想所致。因此选择用包埋75 μg SjAg的Nafion膜构制压电免疫传感器。
图2 Nafion固定的血吸虫抗原的量对传感器频率响应的影响(略)
Fig.2 Effect of schistosoma japonicum antigen(SjAg) amount loading in Nafion film on frequency response of immunosensor
传感器在浓度为4.8 mg/L的血吸虫抗体培育液中培育40 min(immunosensor was incubated with 4.8 mg/L SjAb for 40 min)。
3.3 免疫反应时间的影响
培育溶液中抗体到达敏感石英晶片表面与固定的抗原发生免疫反应，形成免疫复合物需要一定的时间。将Nafion包埋SjAg抗原修饰的石英晶片浸入28 mg/L的SjAb抗体标准溶液里，测量传感器的频率响应与免疫反应时间的关系，如图3所示。刚开始一段时间里，免疫反应使响应频率降低得很快，随后逐渐变慢。抗原抗体反应40 min后，频率没有明显下降，表明免疫反应已基本完成。因此，实验选用40 min作为样品的检测时间。
图3 培育时间对传感器频率响应的影响(略)
Fig.3 Relationship between frequency change of immunosensor and the incubation time of SjAb
传感器在浓度为2.8 mg/L的血吸虫抗体培育液中培育(immunosensor was incubated with 2.8 mg/L SjAb for different incubation period)。
图4 培育溶液pH值对传感器频率响应的影响(略)
Fig.4 Effect of the pH of incubating phosphate buffer(PBS) solution on frequency response of immunosensor
传感器在浓度为4.8 mg/L的血吸虫抗体培育液中培育40 min(The immunosensor was incubated with 4.8 mg/L SjAb for 40 min)。
3.4 测量溶液pH值影响
蛋白质的抗原和抗体都是两性电解质，其荷电状况与溶液的pH 值密切相关。实验考察了不同pH值的石英晶体传感器在48 mg/L的SjAb培育溶液中的频率响应。如图4所示，在pH=70时，传感器的响应值最大，因此，测量在pH=70磷酸盐缓冲溶液中进行。
3.5 构制传感器的重现性
在传感器进行一系列测量后，石英晶片上的Nafion修饰膜也可用酒精溶解，经重新修饰生物敏感膜后，得到新的传感器。用传感器测量18 mg/L SjAg标准溶液6次，测量相对标准偏差小于8%，说明所构制的传感器具有良好的重现性。每一个传感器在进行一次测量后，经再生液处理即可进行下一次测量，其测量相对标准偏差在6%以内，符合生化检测要求。
3.6 工作曲线及样品测量
图5 传感器响应频率与血吸虫抗体浓度关系(略)
Fig.5 Relationship between the frequency change of immunosensor and SjAb concentration
每个响应值是4次测量值的平均值，其相对标准偏差≤6%(each point represents the mean of four determinations and RSD was below 6%)。
在优化的实验条件下，应用传感器测定了一系列不同SjAb浓度下的传感器的频率响应，得到其标准曲线,如图5所示。在02~60 mg/L的SjAb浓度范围内，传感器的频率改变值与待测物浓度成线性相关。用传感器对血吸虫抗体进行了回归分析，如表1所示。
表1 传感器对血吸虫抗体的回收检测实验(略)
Table 1 Recovery of SjAb assay by using the proposed immunosensor
使用传感器测量了一些感染血吸虫程度不同的兔血清，感染血吸虫程度是指实验兔子感染血吸虫的天数。如表2所示，感染血吸虫时间越长的血清样品，传感器对其响应的频率改变值越大。因此,传感器可以用于判断血吸虫感染程度。
表2 传感器对感染血吸虫程度的判断(略)
Table 2 Determination result of schistosoma japonicum Infection degree
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