关注细节 改进工艺——严防注射用生物制剂内毒素污染
生物制剂包括细胞团子、重组蛋白质药物、抗体、疫苗和寡核苷酸药物等，其剂型多为注射剂，因此对其进行热原控制非常关键。在生产过程中，表达系统、原辅材料、生产环境以及个人操作等诸多因素都可能造成产品内毒素污染。对于生物技术药物内毒素污染的预防与去除Υ恿礁霾忝婵悸牵阂皇窃谏讨校?br>严格按GMP要求进行生产，并将目标蛋白的纯化与内毒素的去除结合起来；一旦产品出现内毒素污染，则要针对具体情况选择不同措施来去除内毒素。
■注重生产各环节 防止内毒素污染
在注射用生物制剂的生产过程中防止内毒素污染，涉及生产设备、过滤介质、生产器具、厂房等诸多因素。如在精制纯化中，生产车间必须是符合GMP要求的洁净厂房，各种不同的操作要在不同的洁净区内分别进行。发酵和粗纯应该在十万级洁净区进行，精纯在万级洁净区域内进行，制剂、分装须在百级间或层流罩下进行。对于任何非封闭系统的操作，均应采取无菌操作方式，如果系统自动化程度较高，可遥控操作或较少手工操作。对于任何直接接触制品的溶液、容器、生产用具、管路、生产系统等，必须进行严格、有效的处理，以去除热原。另外，用蒸馏法或反渗透法制备的新鲜注射用水或灭菌注射用水必须是无热原的，这是清洗器具及配制溶液的基础。
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对于玻璃器皿、不锈钢制品等生产器具，可将其置于180℃下、3～4小时或250℃下、1～2小时干烤，以除去热原。对于橡胶、塑料制品(如胶塞、胶管等用品)，可采用0.1摩尔/升的盐酸煮沸30分钟，或用0.1摩尔/升的氢氧化钠浸泡4小时以上，急用时可煮沸30分钟，然后用新鲜用水冲洗净，再进行高压灭菌。另外，对于注射型生物制剂的某些关键生产步骤，可采用无菌、无热原的一次性器具，这样既可以减少工作步骤，又可防止清洗不净带来污染。
溶液的配制要使用无热原的新鲜注射用水，整个过程必须于3小时内完成，并及时进行高压灭菌。对于一些不能进行高压灭菌的溶液，可通过超滤法除热原。如磷酸盐缓冲液在高压灭菌时会产生具有紫外吸收的焦磷酸，这样在使用磷酸盐缓冲液进行柱层析时，就会对层析图谱造成干扰，在干扰素的生产与检定中就曾经出现过这样的情况，对此采用超滤膜可有效地去除溶液中的热原。
在注射用生物制剂的生产中，对于系统、管路的清洗涉及原位清洗/原位杀菌(CIP/SIP)，即主要针对泵、管道、阀门、滤器、柱、各种罐等进行定期清洗杀菌，常规要求在不拆卸任何组件的情况下原位进行。例如对于生物制剂生产中最普遍使用的单元操作——层析，原位清洗/原位杀菌十分重要。有效的原位清洗可以减少产品污染、维持柱效和提高介质寿命。由于新一代的凝胶具有较高的物理化学稳定性，可以使用较高浓度的氢氧化钠进行原位清洗。对于离子交换或疏水层析介质(如CM-SepharoseFF)，可使用1摩尔/升的氢氧化钠反向清洗一个柱床体积，如果每使用3次介质清洗1次，可使介质使用寿命达1000次；对于凝胶过滤介质(如Sephacry1等)，可使用0.5摩尔/升的氢氧化钠清洗半个柱床体积，接触1～2小时，如果每使用5次介质对其清洗1次，可使介质使用寿命达到800次。在白蛋白的纯化流程中，对SephadexG-25C的原位清洗可采用0.5摩尔/升的氢氧化钠清洗0.2个柱床体积，每使用4次清洗1次，介质使用寿命可达7200次。
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■设计纯化工艺去除内毒素
生物制剂的纯化手段主要有各种柱层析技术，如疏水层析、离子交换、亲和层析、分子筛等，这些技术在纯化目标产品的同时还可以有效去除内毒素。如由于内毒素的脂肪A部分有很强的疏水性，但在高盐下会凝集，无法挂上疏水层析柱，因此可选择能结合目标蛋白的疏水层析介质来去除内毒素。
离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。由于内毒素在pH值>2时带负电荷，与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合，因此可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或氢氧化钠去除，这是离子交换法去除内毒素的基础。目前美国Pharmacia公司开发出利用离子交换层析法从白蛋白中去除内毒素的工艺，其主要采用DEAE Sep-harose Fast Flow介质，将被内毒素污染的白蛋白上柱，白蛋白和大部分内毒素结合于介质上后，先清洗掉不结合的内毒素，然后选择性洗脱白蛋白，而90%的内毒素仍结合在柱上，最后用氢氧化钠将柱清洗干净。此种方法每批可以处理20千克内毒素含量达20纳克/毫升的白蛋白。
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亲和层析技术特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用，以目标蛋白作为抗原，将通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体偶联于介质上，以此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性，理论上仅有目标蛋白吸附于介质上，内毒素全部穿透，洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。但实际上，由于介质本身存在非特异性吸附，仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附，而内毒素含量是极低的。在干扰素的生产中，洗脱物内毒素含量一般为0.25单位/毫升。
分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。一般重组产品分子量为几万道尔顿，而内毒素分子量为几十万至上百万道尔顿，常是多聚体，因此利用分子筛可以有效去除内毒素。但其处理量小，处理时间较长。
■采用亲和层析处理内毒素污染
即使在生产中采取了有效的工艺和严格的预防措施，原液仍有可能被污染。如何处理已被污染的原液是比较棘手的问题。因为原液中通常已加入保护剂，重新纯化是非常困难的。如果原液及保护剂的分子量与内毒素分子量差别较大，理论上可选用适当的超滤膜来去除内毒素，但由于膜吸附过程中有产热及系统残留等问题，产品活性损失较大。
目前被认为较为有效的处理方法是采用亲和层析技术，将内毒素底物LAL或多糖菌素B(PMB)偶联于CNBr-Sepharose或NHS-Sepharose上，以此为介质特异性吸附内毒素，而让蛋白通过。国内一些企业曾使用美国Sterogene生物分离公司的ACTICLEANETOX凝胶。该产品最大内毒素结合量为血清中2000单位/毫升胶，水中2000单位/毫升胶。一些企业使用此凝胶处理被污染的含白蛋白的干扰素，吸附量达1700单位/毫升胶，去除内毒素效果较好，但产品活性有一定损失。该产品的另一优点是化学稳定性高，可用1摩尔/升的氢氧化钠清洗2～14小时，但其寿命仅1年左右。
□蔡慧丽, 百拇医药
■注重生产各环节 防止内毒素污染
在注射用生物制剂的生产过程中防止内毒素污染，涉及生产设备、过滤介质、生产器具、厂房等诸多因素。如在精制纯化中，生产车间必须是符合GMP要求的洁净厂房，各种不同的操作要在不同的洁净区内分别进行。发酵和粗纯应该在十万级洁净区进行，精纯在万级洁净区域内进行，制剂、分装须在百级间或层流罩下进行。对于任何非封闭系统的操作，均应采取无菌操作方式，如果系统自动化程度较高，可遥控操作或较少手工操作。对于任何直接接触制品的溶液、容器、生产用具、管路、生产系统等，必须进行严格、有效的处理，以去除热原。另外，用蒸馏法或反渗透法制备的新鲜注射用水或灭菌注射用水必须是无热原的，这是清洗器具及配制溶液的基础。
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对于玻璃器皿、不锈钢制品等生产器具，可将其置于180℃下、3～4小时或250℃下、1～2小时干烤，以除去热原。对于橡胶、塑料制品(如胶塞、胶管等用品)，可采用0.1摩尔/升的盐酸煮沸30分钟，或用0.1摩尔/升的氢氧化钠浸泡4小时以上，急用时可煮沸30分钟，然后用新鲜用水冲洗净，再进行高压灭菌。另外，对于注射型生物制剂的某些关键生产步骤，可采用无菌、无热原的一次性器具，这样既可以减少工作步骤，又可防止清洗不净带来污染。
溶液的配制要使用无热原的新鲜注射用水，整个过程必须于3小时内完成，并及时进行高压灭菌。对于一些不能进行高压灭菌的溶液，可通过超滤法除热原。如磷酸盐缓冲液在高压灭菌时会产生具有紫外吸收的焦磷酸，这样在使用磷酸盐缓冲液进行柱层析时，就会对层析图谱造成干扰，在干扰素的生产与检定中就曾经出现过这样的情况，对此采用超滤膜可有效地去除溶液中的热原。
在注射用生物制剂的生产中，对于系统、管路的清洗涉及原位清洗/原位杀菌(CIP/SIP)，即主要针对泵、管道、阀门、滤器、柱、各种罐等进行定期清洗杀菌，常规要求在不拆卸任何组件的情况下原位进行。例如对于生物制剂生产中最普遍使用的单元操作——层析，原位清洗/原位杀菌十分重要。有效的原位清洗可以减少产品污染、维持柱效和提高介质寿命。由于新一代的凝胶具有较高的物理化学稳定性，可以使用较高浓度的氢氧化钠进行原位清洗。对于离子交换或疏水层析介质(如CM-SepharoseFF)，可使用1摩尔/升的氢氧化钠反向清洗一个柱床体积，如果每使用3次介质清洗1次，可使介质使用寿命达1000次；对于凝胶过滤介质(如Sephacry1等)，可使用0.5摩尔/升的氢氧化钠清洗半个柱床体积，接触1～2小时，如果每使用5次介质对其清洗1次，可使介质使用寿命达到800次。在白蛋白的纯化流程中，对SephadexG-25C的原位清洗可采用0.5摩尔/升的氢氧化钠清洗0.2个柱床体积，每使用4次清洗1次，介质使用寿命可达7200次。
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■设计纯化工艺去除内毒素
生物制剂的纯化手段主要有各种柱层析技术，如疏水层析、离子交换、亲和层析、分子筛等，这些技术在纯化目标产品的同时还可以有效去除内毒素。如由于内毒素的脂肪A部分有很强的疏水性，但在高盐下会凝集，无法挂上疏水层析柱，因此可选择能结合目标蛋白的疏水层析介质来去除内毒素。
离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。由于内毒素在pH值>2时带负电荷，与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合，因此可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或氢氧化钠去除，这是离子交换法去除内毒素的基础。目前美国Pharmacia公司开发出利用离子交换层析法从白蛋白中去除内毒素的工艺，其主要采用DEAE Sep-harose Fast Flow介质，将被内毒素污染的白蛋白上柱，白蛋白和大部分内毒素结合于介质上后，先清洗掉不结合的内毒素，然后选择性洗脱白蛋白，而90%的内毒素仍结合在柱上，最后用氢氧化钠将柱清洗干净。此种方法每批可以处理20千克内毒素含量达20纳克/毫升的白蛋白。
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亲和层析技术特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用，以目标蛋白作为抗原，将通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体偶联于介质上，以此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性，理论上仅有目标蛋白吸附于介质上，内毒素全部穿透，洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。但实际上，由于介质本身存在非特异性吸附，仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附，而内毒素含量是极低的。在干扰素的生产中，洗脱物内毒素含量一般为0.25单位/毫升。
分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。一般重组产品分子量为几万道尔顿，而内毒素分子量为几十万至上百万道尔顿，常是多聚体，因此利用分子筛可以有效去除内毒素。但其处理量小，处理时间较长。
■采用亲和层析处理内毒素污染
即使在生产中采取了有效的工艺和严格的预防措施，原液仍有可能被污染。如何处理已被污染的原液是比较棘手的问题。因为原液中通常已加入保护剂，重新纯化是非常困难的。如果原液及保护剂的分子量与内毒素分子量差别较大，理论上可选用适当的超滤膜来去除内毒素，但由于膜吸附过程中有产热及系统残留等问题，产品活性损失较大。
目前被认为较为有效的处理方法是采用亲和层析技术，将内毒素底物LAL或多糖菌素B(PMB)偶联于CNBr-Sepharose或NHS-Sepharose上，以此为介质特异性吸附内毒素，而让蛋白通过。国内一些企业曾使用美国Sterogene生物分离公司的ACTICLEANETOX凝胶。该产品最大内毒素结合量为血清中2000单位/毫升胶，水中2000单位/毫升胶。一些企业使用此凝胶处理被污染的含白蛋白的干扰素，吸附量达1700单位/毫升胶，去除内毒素效果较好，但产品活性有一定损失。该产品的另一优点是化学稳定性高，可用1摩尔/升的氢氧化钠清洗2～14小时，但其寿命仅1年左右。
□蔡慧丽, 百拇医药