高效液相色谱法测定热必宁口服液中黄芩苷的含量
【摘要】 目的 建立HPLC法测定热必宁口服液中黄芩苷的含量。方法 采用Waters600高效液相色谱仪，ODS C18 分析柱，固定相十八烷基硅胶，流动相为甲醇：水：磷酸(50：30：0.5)，流速1.0ml/min，检测波长278nm，常温。结果 黄芩苷的进样量在0.218～2.180μg范围内线性关系良好，r=0.9998；黄芩苷的平均回收率为98.02%，RSD为0.96%(n=5)。结论 该方法测定热必宁口服液中黄芩苷的含量准确、敏感、重复性好。
【关键词】 热必宁口服液；高效液相；黄芩苷；质量标准
Determines of flavonoid content in oralrebining fluid by HPLC
DONG Xiao-yu，LIAO Wei-yun，ZHANG Yue-jun，et al.Department of Pharmacy，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hubei Province，Wuhan，Hubei 430061，China
【Abstract】 Objective The assay for baicaliu in rebining fluid was explored in order to control the quality of the preparation.Methods The RP-HPLC method was employed taking ODS C18 as chromatocolumn and methanol-water-phosphoric acid (50：30：0.5) as fluid phase，velocity of flow was 1.0ml/min；detection wave length was 278nm.Results The linear concentration range of baicalin was 0.218～2.18μg，correlation coefficient r=0.9998，average recovery was 98.02%(RSD was 0.96%，n=5). Conclusion This method is highly sensitive，accurate，selective and suitable for quality control of rebining fluid.
【Key words】 baicalin；oralrebining fluid；HPLC；quality standard
热必宁口服液是湖北省中医院自行研制的复方制剂，由柴胡、大黄、板蓝根、知母、黄芩等九味中药组成，具有清热解毒的功效，特别对由病毒、细菌引起的高热疗效显著。为了控制该制剂的质量，保证临床用药的安全有效，我们对热必宁口服液的质量进行了研究，黄芩为该方的君药，其主要有效成分为黄芩苷，为了有效控制内在质量，本文采用高效液相色谱法对其中主药黄芩的有效成分黄芩苷进行了含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters600高效液相色谱仪；Waters2996二极管阵列检测器；AS-10200型超声波发声器；DZF型真空干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)；Explorer万分之一电子分析天平。
1.2 样品与试剂 热必宁口服液(湖北省中医院制剂室，批号 060316，060319，060321，060328，060405)，黄芩苷(中国药品生物制品检定所 110715-200514)甲醇(色谱纯)；磷酸(色谱纯)。
1.3 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—水—磷酸(50：30：0.5)为流动相[0.2%的磷酸：甲醇(35：65)]；流速1.0ml/min，进样量10μl，常温，检测波长278nm。
2 方法与结果
2.1 对照品的制备 精密称取在60℃减压干燥4h的黄芩苷对照品2.18mg，置10ml容量瓶中，加甲醇定容制成每1ml含(0.218mg/ml)的溶液即得。
2.2 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10μl进样。以对照品溶液浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行回归分析，得到线性方程：y=-60566+3663196x，r=0.9998，表明黄芩苷在进样量0.218～2.18μg范围内线性关系良好。见图1、图2。
图1 黄芩苷标
准品HPLC图 图2 黄芩苷供
试品HPLC图2.3 供试品的制备 取热必宁口服液适量，过滤，取滤液0.1ml加甲醇15ml摇匀，定容，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液放于冰箱内备用。
2.4 空白溶液的配制 除药材黄芩外，按照处方比例，称取药材混匀加水适量浸泡30min开始煎煮，药液沸腾1h后，将煎液滤出，药渣加水继续再煎1.5h，合并滤液，将滤液浓缩至约400ml，加入95%的乙醇，使乙醇含量达到60%静置过夜，取上清液过滤，滤液加热挥发乙醇至无醇味，加水至1000ml，分装，灌封，灭菌，即得。
2.5 空白干扰实验 按照上述色谱条件，吸取对照品溶液，供试品溶液，空白溶液10μl分别进样测定，在相同的色谱条件下供试品色谱峰，与对照品色谱峰在相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，而空白溶液在此保留时间无峰干扰。
2.6 精密度实验 精密吸取黄芩苷对照品溶液5μl(0.218mg/ml)，重复进样5次，根据对黄芩苷峰面积的积分计算。
2.7 稳定性测试 精密吸取同一供试品溶液5μl，分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h后进样，得黄芩苷的峰面积分别为262128、274202、268022、266357、265741、263579，且峰面积基本不变(平均峰面积为266672)，RSD%=1.59。则样品溶液至少在20h内稳定性良好。
2.8 加样回收率实验 取已知含量的样品1ml，5份，分别加入到1、2、3、4、5ml的对照品溶液中，平均回收率为98.02%，RSD%=0.957，见表1、表2。表1 加样回收率试验结果表2 加样回收率实验
2.9 重复性实验 取同一批样品5份，依法测定含量，平均含量为0.159mg/ml，RSD为1.3%。
2.10 样品测定 按照含量测定方法共测定5批样品，含量结果如表3。表3 黄芩苷含量样品测定
3 讨论
中药复方制剂以黄芩苷为质量控制指标的文献报道较多[1～4]，只是样品大都经过回流提取步骤，而本文根据黄芩苷的性质及我院制剂制备工艺—水提醇沉，经过滤甲醇定容后直接测定，结果在本实验条件下得到了较好的分离，此方法简便，准确，重复性好，空白无干扰，可作为热必宁口服液中黄芩苷含量测定的定量方法，为医院制剂热必宁口服液的质量标准提供了快速准确的测定方法。
【参考文献】
1 褚克丹，邱水生，叶建春.复方黄芩液质量标准研究.中国现代应用药学，2003，20(2)：143-145.
2 张玲莉，彭燕.高效液相色谱法测定黄芩口服液中黄芩苷的含量.中国药师，2005，8(5)：388-389.
3 刘晓玲，赵娟，张裕民.HPLC法测定抗癌口服液中野黄芩苷的含量.中医药导报，2005，11(9)：454.
4 马涵涛，张翠英.HPLC法测定热毒清口服液中黄芩苷的含量.中华实用中西医杂志，2004，4(3)：56-57.
作者单位： 1 430061 湖北武汉，湖北省中医院
2 湖北武汉，湖北中医学院(2006届药学系毕业生)
(编辑：悦 铭), 百拇医药(董晓昱，廖蔚云，张跃军，冯汉鸽，柳俊杰，胡芳，张琳)
【关键词】 热必宁口服液；高效液相；黄芩苷；质量标准
Determines of flavonoid content in oralrebining fluid by HPLC
DONG Xiao-yu，LIAO Wei-yun，ZHANG Yue-jun，et al.Department of Pharmacy，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hubei Province，Wuhan，Hubei 430061，China
【Abstract】 Objective The assay for baicaliu in rebining fluid was explored in order to control the quality of the preparation.Methods The RP-HPLC method was employed taking ODS C18 as chromatocolumn and methanol-water-phosphoric acid (50：30：0.5) as fluid phase，velocity of flow was 1.0ml/min；detection wave length was 278nm.Results The linear concentration range of baicalin was 0.218～2.18μg，correlation coefficient r=0.9998，average recovery was 98.02%(RSD was 0.96%，n=5). Conclusion This method is highly sensitive，accurate，selective and suitable for quality control of rebining fluid.
【Key words】 baicalin；oralrebining fluid；HPLC；quality standard
热必宁口服液是湖北省中医院自行研制的复方制剂，由柴胡、大黄、板蓝根、知母、黄芩等九味中药组成，具有清热解毒的功效，特别对由病毒、细菌引起的高热疗效显著。为了控制该制剂的质量，保证临床用药的安全有效，我们对热必宁口服液的质量进行了研究，黄芩为该方的君药，其主要有效成分为黄芩苷，为了有效控制内在质量，本文采用高效液相色谱法对其中主药黄芩的有效成分黄芩苷进行了含量测定。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters600高效液相色谱仪；Waters2996二极管阵列检测器；AS-10200型超声波发声器；DZF型真空干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)；Explorer万分之一电子分析天平。
1.2 样品与试剂 热必宁口服液(湖北省中医院制剂室，批号 060316，060319，060321，060328，060405)，黄芩苷(中国药品生物制品检定所 110715-200514)甲醇(色谱纯)；磷酸(色谱纯)。
1.3 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—水—磷酸(50：30：0.5)为流动相[0.2%的磷酸：甲醇(35：65)]；流速1.0ml/min，进样量10μl，常温，检测波长278nm。
2 方法与结果
2.1 对照品的制备 精密称取在60℃减压干燥4h的黄芩苷对照品2.18mg，置10ml容量瓶中，加甲醇定容制成每1ml含(0.218mg/ml)的溶液即得。
2.2 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10μl进样。以对照品溶液浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行回归分析，得到线性方程：y=-60566+3663196x，r=0.9998，表明黄芩苷在进样量0.218～2.18μg范围内线性关系良好。见图1、图2。
图1 黄芩苷标
准品HPLC图 图2 黄芩苷供
试品HPLC图2.3 供试品的制备 取热必宁口服液适量，过滤，取滤液0.1ml加甲醇15ml摇匀，定容，再用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液放于冰箱内备用。
2.4 空白溶液的配制 除药材黄芩外，按照处方比例，称取药材混匀加水适量浸泡30min开始煎煮，药液沸腾1h后，将煎液滤出，药渣加水继续再煎1.5h，合并滤液，将滤液浓缩至约400ml，加入95%的乙醇，使乙醇含量达到60%静置过夜，取上清液过滤，滤液加热挥发乙醇至无醇味，加水至1000ml，分装，灌封，灭菌，即得。
2.5 空白干扰实验 按照上述色谱条件，吸取对照品溶液，供试品溶液，空白溶液10μl分别进样测定，在相同的色谱条件下供试品色谱峰，与对照品色谱峰在相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，而空白溶液在此保留时间无峰干扰。
2.6 精密度实验 精密吸取黄芩苷对照品溶液5μl(0.218mg/ml)，重复进样5次，根据对黄芩苷峰面积的积分计算。
2.7 稳定性测试 精密吸取同一供试品溶液5μl，分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h后进样，得黄芩苷的峰面积分别为262128、274202、268022、266357、265741、263579，且峰面积基本不变(平均峰面积为266672)，RSD%=1.59。则样品溶液至少在20h内稳定性良好。
2.8 加样回收率实验 取已知含量的样品1ml，5份，分别加入到1、2、3、4、5ml的对照品溶液中，平均回收率为98.02%，RSD%=0.957，见表1、表2。表1 加样回收率试验结果表2 加样回收率实验
2.9 重复性实验 取同一批样品5份，依法测定含量，平均含量为0.159mg/ml，RSD为1.3%。
2.10 样品测定 按照含量测定方法共测定5批样品，含量结果如表3。表3 黄芩苷含量样品测定
3 讨论
中药复方制剂以黄芩苷为质量控制指标的文献报道较多[1～4]，只是样品大都经过回流提取步骤，而本文根据黄芩苷的性质及我院制剂制备工艺—水提醇沉，经过滤甲醇定容后直接测定，结果在本实验条件下得到了较好的分离，此方法简便，准确，重复性好，空白无干扰，可作为热必宁口服液中黄芩苷含量测定的定量方法，为医院制剂热必宁口服液的质量标准提供了快速准确的测定方法。
【参考文献】
1 褚克丹，邱水生，叶建春.复方黄芩液质量标准研究.中国现代应用药学，2003，20(2)：143-145.
2 张玲莉，彭燕.高效液相色谱法测定黄芩口服液中黄芩苷的含量.中国药师，2005，8(5)：388-389.
3 刘晓玲，赵娟，张裕民.HPLC法测定抗癌口服液中野黄芩苷的含量.中医药导报，2005，11(9)：454.
4 马涵涛，张翠英.HPLC法测定热毒清口服液中黄芩苷的含量.中华实用中西医杂志，2004，4(3)：56-57.
作者单位： 1 430061 湖北武汉，湖北省中医院
2 湖北武汉，湖北中医学院(2006届药学系毕业生)
(编辑：悦 铭), 百拇医药(董晓昱，廖蔚云，张跃军，冯汉鸽，柳俊杰，胡芳，张琳)