重组人血管内皮抑素I期临床研究
[摘要] 目的 评价重组人血管内皮抑素的人体安全性和药代动力学特征。方法 将27例健康受试者分成4个剂量组，分别为30 mg/m2(3例)、60 mg/m2(8例)、120 mg/m2(8例)、180 mg/m2(8例)，均单次静脉输注重组人血管内皮抑素；16例恶性肿瘤患者，分3个剂量组，分别为10 mg/m2(10例)、20 mg/m2(3例)、30 mg/m2(3例)，每组连续静脉输注重组人血管内皮抑素28天；27例健康受试者及10例恶性肿瘤患者(10 mg/m2)采用美国Quantikine免疫分析药盒测定血清重组人血管内皮抑素浓度，进行药代动力学研究。结果 全组未见明显的剂量限制性毒性，少数出现一定的心脏毒性，如窦性心动过速、心肌缺血、室性期前收缩、窦性心律不齐。其他不良反应有皮疹、腹泻、发热、疲劳。可评价患者16例中，MR 1例、SD 14例、PD 1例。单次给药组Cmax和AUC随给药剂量提高呈线性增加，Vd和Cl也随剂量相应提高；多次给药组药物谷浓度在连续给药1周左右达到稳态水平，连用28天，在体内的维持浓度较低且不会产生明显蓄积。结论 初步观察治疗肿瘤有一定疗效，推荐Ⅱ期临床试验的剂量为每次10 mg/m2，每日1次，连续给药28天，以进一步考察本药对肿瘤患者的疗效和安全性。
[关键词] 重组人血管内皮抑素;Ⅰ期临床研究;剂量限制性毒性;药动学
重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin)于1997年初从小鼠血管内皮细胞瘤的细胞(EOMA)培养液中分离得到，是一种小鼠胶原蛋白十八(collagen ⅩⅧ)C末端183个氨基酸20 kD的蛋白质片断，具有抗血管生成(anti-angiogenesis)抑制肿瘤生长的作用。本试验的重组人血管内皮抑素采用大肠杆菌表达制备获得，分子量为20 kDa，共由184个氨基酸、552个核苷酸组成，有2对二硫键，无糖基化位点，不加任何修饰，与天然人源的内皮抑素氨基酸序列相同，属于抗血管生成疗法中的肿瘤血管形成抑制剂类型。现对本品的临床Ⅰ期研究结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例选择
1.1.1 健康受试者 入选标准：年龄18～45岁，50 kg以上标准体重。无心、肝、肾及血液系统疾病史，试验前临床体检、血常规、肝肾功能、心电图检查均为正常并签署知情同意书。排除标准：体检及各项检查超过正常范围者；年龄未满18周岁或超过45周岁者，妊娠和哺乳期妇女；近4周内参与其他临床试验者；长期服药、吸烟、饮酒者；有药物过敏者。
1.1.2 肿瘤患者 入选标准：有明确病理或组织学依据诊为恶性肿瘤、因各种原因难以实施其他更有效治疗者；18~65岁，男女性别不限；ECOG体力状况：0～1分；预期生存期超过3个月；血常规、肝肾功能基本正常，心电图检查均为正常，距上次化疗至少4周。排除标准：妊娠和哺乳期妇女;血液系统疾病；严重脑疾病，原发或转移性脑瘤；4周内参加过其他临床试验者；有药物过敏史者；试验中采用其他抗肿瘤药物治疗者。
1.2 试验方法
1.2.1 药物来源 重组人血管内皮抑素注射液由江苏吴中实业股份有限公司苏州中凯生物制药厂提供(生产批号： 20050901)，水针剂，15 mg/(15 ml·支)，2 ℃~8 ℃冰箱避光保存。
1.2.2 给药方法 (1)取出本品，注入250 ml生理盐水中静脉滴注，匀速滴注时间2 h。(1)单次给药：按照临床前试验数据和临床剂量递增原则，设计4个剂量组，分别为30 mg/m2、60 mg/m2、120 mg/m2、180 mg/m2，最小剂量组为3例，其余3组各8例。(2)连续给药：选择恶性肿瘤患者，设计3个剂量组，分别为10 mg/m2(10例)、20 mg/m2(3例)、30 mg/m2(3例)，每组连续给药28天，给药结束后继续观察1周。(3)终止剂量升级的标准：如某组中出现1例剂量限制性毒性(DLT)，还需在同一剂量组增加3例，在增加的病例中如未发现DLT，可升至下一个剂量组，如再出现1例以上DLT即终止试验。在给予试验设计的最大剂量仍未出现Ⅲ度及以上毒性反应，研究者认为该剂量范围已经可以满足有效性研究的需要，此时也可终止试验[1]。(4)伴随用药：试验中如出现Ⅲ度以上不良反应，应给予积极的抢救及治疗。试验中可使用必要的药物治疗感染、出血及其他伴随疾病，但应记录在案。一般不宜预防性使用抗过敏及对出、凝血功能及心功能有明显影响的药物[2]。
1.3 观察指标 单次给药组受试者给药前、后测定心率、呼吸、血压、脉搏、体温，给药后每2 h测定1次血压、心率至24 h，并随时记录与用药有关的不良反应，治疗前、治疗后第3、7天测定血常规、凝血、二聚体检查、肝肾功能、尿常规、心电图。
多次给药组肿瘤患者给药前、后，每天测定心率、呼吸、血压、脉搏、体温，并进行心电监护至停药后2 h，若给药过程中出现心脏的不良反应，行心电监护及对症处理，给药前3天内、给药后3天、10天、17天、24天、31天测定血常规、凝血、二聚体检查、肝肾功能、尿常规、心电图检查。
1.4 不良反应及疗效评价标准 不良反应按照美国国立癌症研究所(NCI)制定的通用毒性评价标准(CTC)分为0~4级。疗效根据2000年NCI提出的实体瘤疗效评价标准(RECIST)进行[3]。
1.5 重组人血管内皮抑素药代动力学检测 采血时间[4]：在单次给药组的60 mg/m2、120 mg/m2、180 mg/m2剂量组进行药代动力学试验，分别在给药前、静脉注射后1、5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48和72 h取静脉血。多次给药的10 mg/m2剂量组参加药代试验，第1、7次给药前以及给药后15、30、45 min，1、1.5、2、4、8、12和24 h。第3、5、14、28次给药前2 h(根据单次给药峰浓度时间而定)和24 h。第28次给药后48 h、72 h取静脉血。每次采集静脉血约3 ml，4 ℃ 3000 r/min，离心10 min后取出血清，置-20 ℃冰箱保存待测。采用美国R&D Systems公司重组人内皮抑素为抗原免疫动物生成的多克隆抗体药盒测定人血清中重组人血管内皮抑素。
1.6 药代动力学参数计算及统计学方法 用3p97实用药代动力学计算程序及统计矩法估算药代动力学参数，用梯形法计算药-时曲线下面积AUC。同一受试者数据用配对t检验，不同组间用组间t检验。采用方差分析或χ2检验来比较人口学资料和其他基础值指标。计量资料行配对t检验，计数资料行χ2检验。所有统计学计算采用Excel或SPSS统计软件。
2 结果
2.1 耐受性试验
2.1.1 单次给药组 (1)入组情况：共纳入健康受试者27例。其中，30 mg/m2剂量组3例，60 mg/m2、120 mg/m2、180 mg/m2剂量组各为8例，各剂量组受试者的年龄、身高和体重资料均具有可比性(P>0.05)。(2)安全性结果：60 mg/m2剂量组受试者用药后体温、呼吸、心率及收缩压的均值较用药前高，经配对t检验，差异有显著性(P<0.05)，但其值均在正常范围内，无临床意义。其他剂量组受试者的生命体征用药前后均稳定，经配对t检验，差异无显著性(P>0.05)。(3)不良反应结果：30 mg/m2和60 mg/m2剂量组在用药前后，均未出现明显不良反应。120 mg/m2剂量组出现Ⅰ度皮疹1例，在用药后第1天，以面部及双上肢稍多，持续5天，未经任何治疗痊愈；Ⅰ度恶心伴腹泻1例，Ⅱ度腹泻1例，均在用药结束后第4天恢复正常；180 mg/m2剂量组出现Ⅰ度腹泻2例，用药结束后第3天恢复正常。各剂量组均未出现血液学、生化及肝肾功能毒性。30 mg/m2剂量组中出现1例窦性心律不齐，60 mg/m2剂量组中出现3例窦性心律不齐。120、180 mg/m2剂量组中未见心电图改变。见表1。
表1 健康志愿者不同剂量人重组血管内皮抑素治疗后髓外不良反应 (略)
2.1.2 连续给药组 入组情况：本组纳入肿瘤受试者16例。其中10 mg/m2剂量组入选受试者10例，20、30 mg/m2剂量组各3例，未有脱落病例。
各剂量组患者的性别分布相当，年龄、身高和体重资料均相近。ECOG评分等无差异。(1)其中乳腺癌4例，大肠癌3例，肾癌2例，卵巢癌2例，胃癌、颌下腺癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤各1例。(2)重组人血管内皮抑素注射液临床疗效结果：16例患者中，可评价患者12例，MR 1例，SD 10例，PD 1例。(3)安全性结果：各剂量组受试者的生命体征用药前后均保持稳定，经配对t检验，差异无显著性(P>0.05)。(4)不良反应结果：各剂量组在用药过程中及用药后，血液学、血生化、肝肾功能未出现不良反应。20 mg/m2剂量组中，出现1例Ⅱ级发热病例，于给药第4～10天发热，常在每次输液后2 h内，考虑与用药有关。10 mg/m2剂量组用药后出现1例心肌缺血、1例出现室性期前收缩；20 mg/m2剂量组用药后出现1例心肌缺血，患者无明显临床症状；30 mg/m2剂量组未出现前后变化。见表2。
表2 连续给药组不同剂量人重组血管内皮抑素静滴后髓外不良反应 (略)
图1 健康志愿者单次输注不同剂量重组人血管内皮抑素的血药浓度-时间曲线(略)
2.2 药代动力学试验结果
2.2.1 单次给药组 血药浓度-时间曲线：用药前健康受试者血浆用ELISA方法均可测得内源性Endostatin存在，60 mg/m2、120 mg/m2和180 mg/m2 3个剂量组的内源性Endostatin平均分别为126.54±25.04、110.44±22.82和114.41±29.18，提示3个剂量组内源性Endostatin含量的组间差异较小。24例健康受试者分别单次静滴rh-Endostatin 60 mg/m2、120 mg/m2或180 mg/m2后，测得各受试者rh-Endostatin血药浓度-时间曲线(见图1)，药动学参数比较，见表3。(2)药动学参数分析：①Tmax、Cmax和AUC：单次给药3个剂量组中大多数受试者Tmax出现在滴注停止时(2h)，平均Tmax分别为(1.785±0.354)h、(1.750±0.463)h和(1.750±0.463)h。在本次研究剂量范围内，Cmax和AUC随给药剂量提高呈线性增加(见图2，3)，且个体间差异较小。②表观分布容积(Vd)：3个剂量组平均表观分布容积分别为(5.374±3.459)L/m2、(9.887±3.72)L/m2和(20.715±9.964)L/m2，Vd计算结果呈现随给药剂量增加而增大的趋势。③半衰期(t1 2α、t1 2β和t1 2Ζ)：低、中、高3个剂量组的分布半衰期(t1 2α)分别为(0.865±0.936)h、(1.077±0.761)h和(2.176±1.491)h，呈现随剂量增加逐渐延长的趋势。3个剂量组的平均消除半衰期(t1 2β)分别为(8.762±19.337)h、(6.59±9.322)h和(26.844±27.194)h。但各剂量组中受试者个体差异比较显著，个体之间t1 2β计算结果可相差几十倍。特别是在180 mg/m2剂量组的8例受试者中，4例t1 2β小于4 h，另外4例t1 2β则大于40 h。3个剂量组统计矩参数t1 2Z计算结果相近，分别为(22.874±12.014)h、(25.109±15.727)h和(24.934±17.095)h，且组内差异较小，建议作为反rh-Endostatin体内消除情况的主要参数，主要参数见表3。
图2 Cmax随剂量变化趋势(略)
图3 AUC随剂量变化趋势(略)
表3 健康受试者单次静滴rh-Endostatin后的药动学参数比较(略)
2.2.2 多次给药组 血药浓度-时间曲线及药动学参数：图4显示，在rh-Endostatin 10 mg/m2剂量下，2 h滴注给药完成后rh-Endostatin的血浆浓度立即下降，完成首剂量给药后12 h rh-Endostatin浓度基本回到基线水平，在连续给药7天后未发现明显的药物蓄积现象，进一步观察连续给药第14天和第28天的药物谷浓度分别为(220.447±31.860)μg/L和(251.424±59.241)μg/L(见表4)，均保持在较低的浓度水平，且与Css_av相近。表明rh-Endostatin 10 mg/m2静脉滴注2 h，连用28天，在体内的维持浓度较低且不会产生明显蓄积。
受试者接受连续28天的rh-Endostatin 10 mg/m2静脉滴注2 h，药物谷浓度在连续给药1周左右达到稳态水平，Css_max为(861.286 ±160.264)μg/L，Css_min为(166.312±53.355)μg/L，Css_av为(272.439±91.975)μg/L。AUCss为(6538.524±2207.404)μg/(L·h)，波动系数DF为2.942±1.517，见表4。
图4 连续输注重组人血管内皮抑素(10 mg/m2)的血药浓度-时间曲线(略)
表4 10名受试者多次静滴10(mg/m2)rh-Endostatin后的主要药动学参数(略)
3 讨论
抗肿瘤血管生成的理论源于美国哈佛大学医学院儿童医院Folkman博士提出了关于肿瘤血管形成以及通过抗血管生成(anti-angiogenesis)抑制肿瘤生长的假设[5]，主要通过抑制肿瘤血管的形成来达到抑制肿瘤生长的目的。虽然不能消除所有的肿瘤细胞，但能阻止肿瘤细胞的生长，这种治疗方式称为抗血管生成疗法，又称为“诱导休眠”。肿瘤血管的形成依赖于血管内皮细胞的激活、增殖、吸附和成熟过程，所有这些过程都可以成为血管形成抑制剂作用的靶点。美国Entre Med公司用酵母表达的重组人内皮抑素对多种肿瘤模型有抗肿瘤活性，其抗肿瘤谱广、毒性轻微[6]。由江苏吴中实业股份有限公司苏州中凯生物制药厂联合研制的重组人内皮抑素注射液，采用大肠杆菌作为表达载体，不加任何修饰，同天然人源的内皮抑素氨基酸序列相同。临床前研究显示，在20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg剂量，连续静脉给药7天对小鼠肝癌H22平均抑瘤率为68.06%、51.18%和43.47%。对小鼠Lewis肺癌平均抑瘤率分别为61.61%、48.44%和30.21%。对小鼠B16黑色素瘤肺转移的抑制率为73.85%、72.96%和68.80%，对小鼠黑色素瘤肺转移有明显的抑制作用。对移植于裸鼠的人体表皮癌A431、肠癌LOVO静脉连续给药7~14天，高剂量(20 mg/kg)抑瘤率达60%以上，量效关系明显，对已形成的肿瘤的生长显示了明显的抑制作用。重组人内皮抑素注射液5 mg/kg、10 mg/kg分别与小剂量环磷酰胺、甲氨蝶呤、丝裂霉素C联合应用对小鼠肝癌H22生长的抑制作用明显强于单独用药，有一定的协同作用；重组人内皮抑素10 mg/kg与氟尿嘧啶(5-FU)合用时对人体肝癌QGY的抑瘤率明显高于两药单独使用，有协同作用。实验结果提示：重组人内皮抑素注射液可与化疗药物联合应用以降低化疗剂量，减少毒副作用。小鼠、大鼠急性毒性试验，大鼠和猴长期毒性试验均未见与该药有关的明显毒性，说明该药无明显毒性。制剂安全性试验静脉刺激和溶血试验均阴性，豚鼠过敏试验反应阳性，主要是由于该药为重组人的蛋白制品。
根据临床前药效学、毒理学及临床药动学研究结果，同时参考国内外类似产品Ⅰ期临床用药剂量[6，7]，本试验选择单次给药30～180 mg/m2，临床实施过程中的4个剂量组均未出现Ⅲ级以上毒性，按研究计划该剂量范围已经可以满足有效性研究的需要，连续28天10～30 mg/m2给药，不良反应主要表现为Ⅰ度皮疹，Ⅰ~Ⅱ度腹泻，1例Ⅱ度发热，少数受试者表现为心电图的改变，包括窦性心律不齐、心肌缺血、室性期前收缩。国内外文献也有类似报道，原因不明，尚需进一步研究。
连续给药组可评价患者12例，10 mg/m2剂量组中，1例MR，1例疾病进展，其他均为疾病稳定；各剂量组未见CR和PR病例。结果同AHG Hansma[7]，与杨林报道一致[8]。究其原因考虑为：(1)选择患者多为多疗程晚期患者；(2)药物进入机体可能代谢分解；(3)据报道药物进入机体，血中检测出相应抗体，而影响疗效。
本次药代动力学研究分别考察了重组人内皮抑素注射液(rh-Endostatin)经单次给药和多次给药后体内分布代谢特征并得到主要药动学参数。所采用美国R&D Systems公司生产的Quantikine免疫分析药盒，特异性强、灵敏度高，各批结果稳定。但是，一些客观存在的因素仍然可能导致检测结果的偏差。例如，由于受试药物本身可能是一种由蛋白N段脱落4个氨基酸或不脱落的组分组成的rh-Endostatin混合物，商业化的ELISA试剂盒往往能100%的识别这两种组分，这意味着N端发生水解或糖基化等导致蛋白失活的组分也能被检测。另一方面，含量的测定结果并不能与临床效果直接对应，因为用来测定蛋白总量的ELISA方法，不能测定蛋白活性，rh-Endostatin在体内经蛋白酶降解可能降低其活性，但却无法用ELISA方法进行测定。
国内文献报道[8]，烟台荣昌生物工程有限公司研制的rh-Endostatin注射液(YH-16)60 mg/m2静脉滴注30 min，AUC为(18.67±4.08)μg/(ml·h)与本研究同剂量组结果相近，但其Cmax为(13.87±0.61)μg/ml高于本研究同剂量结果，这可能与其给药时间短有关。另外，美国MD Anderson癌症中心与Dana-Farber癌症研究所共同完成的rh-Endostatin临床I期试验结果显示[9]，内源性Endostatin的血浆浓度仅为(27.6±12.9)μg/L，低于本研究中得到的国人内源性Endostatin血浆浓度[(117.13±25.68)μg/L，n=24]，同时也低于YH-16研究组的结果[(234.25±76.5)μg/L，n=12]。进一步比较相应剂量组给药后血浆rh-Endostatin浓度，其Cmax和AUC均明显低于本研究组和YH-16研究组结果，产生这种差异的原因可能与人种、检测方法、给药方案以及药物来源等因素有关，有待进一步研究。
重组人内皮抑素Ⅰ期临床研究显示，健康志愿者单次给药剂量达到180 mg/m2，未见明显Ⅲ级以上毒性，满足有效性研究的需要；晚期肿瘤患者连续28天给药，少数出现心电图改变，其余不良反应轻微，推荐Ⅱ期临床给药剂量为10 mg/m2，连续28天，以进一步考察本药对肿瘤患者的疗效和安全性。
[参考文献]
1 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则(施行).北京：中国医药科技出版社，2002.
2 国家药品监督管理局.药品临床试验管理规范，1999.
3 Gehan EA，Teffe MC.Will there be resistance to the RECIST(Respones Evaluation Criteria In Solid Tumors)，121.J Natl Cancer Inst，2000，92(3)：179-181.
4 赵香兰.临床药代动力学.郑州：郑州大学出版社，2003，121.
5 Folkman J.Tumor angiogenesis：therapeutic implications.N Engl J Med，1971，285：1182-1186.
6 Thomas JP，Araoomanian RZ，Alberti D，et al.PhaseⅠpharmacokinetic and pharmacodynamic study of recombinant human endostatin in patients with advanced solid tumors.Journal of Clinical Oncology，2003，21：223-231.
7 AHG Hansma，HJ Broxterman，Ivander Horst，et al.Recombinant human endostatin administered as a 28-day continuous injections：a phase and pharmacokinetic study in patients with advanced cancer.Annals of Oncology，2005，16：1695-1701.
8 杨林，王金万，汤仲明，等.重组人血管内皮抑制素Ⅰ期临床研究.中国新药研究，2004，13(6)：538-552.
9 Sim BK，MacDonald NJ，Gubish ER.Angiostatin and endostatin：Endogenous inhibitors of tumour growth.Cancer Metastasis Rev，2000，19(1-2)：181-190.
(编辑：乔 琪)
作者单位： 300060 天津，天津医科大学肿瘤医院内二科, 百拇医药(佟仲生，阎昭，巴一，李淑芬，史业辉，何丽宏，汪旭，)
[关键词] 重组人血管内皮抑素;Ⅰ期临床研究;剂量限制性毒性;药动学
重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin)于1997年初从小鼠血管内皮细胞瘤的细胞(EOMA)培养液中分离得到，是一种小鼠胶原蛋白十八(collagen ⅩⅧ)C末端183个氨基酸20 kD的蛋白质片断，具有抗血管生成(anti-angiogenesis)抑制肿瘤生长的作用。本试验的重组人血管内皮抑素采用大肠杆菌表达制备获得，分子量为20 kDa，共由184个氨基酸、552个核苷酸组成，有2对二硫键，无糖基化位点，不加任何修饰，与天然人源的内皮抑素氨基酸序列相同，属于抗血管生成疗法中的肿瘤血管形成抑制剂类型。现对本品的临床Ⅰ期研究结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例选择
1.1.1 健康受试者 入选标准：年龄18～45岁，50 kg以上标准体重。无心、肝、肾及血液系统疾病史，试验前临床体检、血常规、肝肾功能、心电图检查均为正常并签署知情同意书。排除标准：体检及各项检查超过正常范围者；年龄未满18周岁或超过45周岁者，妊娠和哺乳期妇女；近4周内参与其他临床试验者；长期服药、吸烟、饮酒者；有药物过敏者。
1.1.2 肿瘤患者 入选标准：有明确病理或组织学依据诊为恶性肿瘤、因各种原因难以实施其他更有效治疗者；18~65岁，男女性别不限；ECOG体力状况：0～1分；预期生存期超过3个月；血常规、肝肾功能基本正常，心电图检查均为正常，距上次化疗至少4周。排除标准：妊娠和哺乳期妇女;血液系统疾病；严重脑疾病，原发或转移性脑瘤；4周内参加过其他临床试验者；有药物过敏史者；试验中采用其他抗肿瘤药物治疗者。
1.2 试验方法
1.2.1 药物来源 重组人血管内皮抑素注射液由江苏吴中实业股份有限公司苏州中凯生物制药厂提供(生产批号： 20050901)，水针剂，15 mg/(15 ml·支)，2 ℃~8 ℃冰箱避光保存。
1.2.2 给药方法 (1)取出本品，注入250 ml生理盐水中静脉滴注，匀速滴注时间2 h。(1)单次给药：按照临床前试验数据和临床剂量递增原则，设计4个剂量组，分别为30 mg/m2、60 mg/m2、120 mg/m2、180 mg/m2，最小剂量组为3例，其余3组各8例。(2)连续给药：选择恶性肿瘤患者，设计3个剂量组，分别为10 mg/m2(10例)、20 mg/m2(3例)、30 mg/m2(3例)，每组连续给药28天，给药结束后继续观察1周。(3)终止剂量升级的标准：如某组中出现1例剂量限制性毒性(DLT)，还需在同一剂量组增加3例，在增加的病例中如未发现DLT，可升至下一个剂量组，如再出现1例以上DLT即终止试验。在给予试验设计的最大剂量仍未出现Ⅲ度及以上毒性反应，研究者认为该剂量范围已经可以满足有效性研究的需要，此时也可终止试验[1]。(4)伴随用药：试验中如出现Ⅲ度以上不良反应，应给予积极的抢救及治疗。试验中可使用必要的药物治疗感染、出血及其他伴随疾病，但应记录在案。一般不宜预防性使用抗过敏及对出、凝血功能及心功能有明显影响的药物[2]。
1.3 观察指标 单次给药组受试者给药前、后测定心率、呼吸、血压、脉搏、体温，给药后每2 h测定1次血压、心率至24 h，并随时记录与用药有关的不良反应，治疗前、治疗后第3、7天测定血常规、凝血、二聚体检查、肝肾功能、尿常规、心电图。
多次给药组肿瘤患者给药前、后，每天测定心率、呼吸、血压、脉搏、体温，并进行心电监护至停药后2 h，若给药过程中出现心脏的不良反应，行心电监护及对症处理，给药前3天内、给药后3天、10天、17天、24天、31天测定血常规、凝血、二聚体检查、肝肾功能、尿常规、心电图检查。
1.4 不良反应及疗效评价标准 不良反应按照美国国立癌症研究所(NCI)制定的通用毒性评价标准(CTC)分为0~4级。疗效根据2000年NCI提出的实体瘤疗效评价标准(RECIST)进行[3]。
1.5 重组人血管内皮抑素药代动力学检测 采血时间[4]：在单次给药组的60 mg/m2、120 mg/m2、180 mg/m2剂量组进行药代动力学试验，分别在给药前、静脉注射后1、5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48和72 h取静脉血。多次给药的10 mg/m2剂量组参加药代试验，第1、7次给药前以及给药后15、30、45 min，1、1.5、2、4、8、12和24 h。第3、5、14、28次给药前2 h(根据单次给药峰浓度时间而定)和24 h。第28次给药后48 h、72 h取静脉血。每次采集静脉血约3 ml，4 ℃ 3000 r/min，离心10 min后取出血清，置-20 ℃冰箱保存待测。采用美国R&D Systems公司重组人内皮抑素为抗原免疫动物生成的多克隆抗体药盒测定人血清中重组人血管内皮抑素。
1.6 药代动力学参数计算及统计学方法 用3p97实用药代动力学计算程序及统计矩法估算药代动力学参数，用梯形法计算药-时曲线下面积AUC。同一受试者数据用配对t检验，不同组间用组间t检验。采用方差分析或χ2检验来比较人口学资料和其他基础值指标。计量资料行配对t检验，计数资料行χ2检验。所有统计学计算采用Excel或SPSS统计软件。
2 结果
2.1 耐受性试验
2.1.1 单次给药组 (1)入组情况：共纳入健康受试者27例。其中，30 mg/m2剂量组3例，60 mg/m2、120 mg/m2、180 mg/m2剂量组各为8例，各剂量组受试者的年龄、身高和体重资料均具有可比性(P>0.05)。(2)安全性结果：60 mg/m2剂量组受试者用药后体温、呼吸、心率及收缩压的均值较用药前高，经配对t检验，差异有显著性(P<0.05)，但其值均在正常范围内，无临床意义。其他剂量组受试者的生命体征用药前后均稳定，经配对t检验，差异无显著性(P>0.05)。(3)不良反应结果：30 mg/m2和60 mg/m2剂量组在用药前后，均未出现明显不良反应。120 mg/m2剂量组出现Ⅰ度皮疹1例，在用药后第1天，以面部及双上肢稍多，持续5天，未经任何治疗痊愈；Ⅰ度恶心伴腹泻1例，Ⅱ度腹泻1例，均在用药结束后第4天恢复正常；180 mg/m2剂量组出现Ⅰ度腹泻2例，用药结束后第3天恢复正常。各剂量组均未出现血液学、生化及肝肾功能毒性。30 mg/m2剂量组中出现1例窦性心律不齐，60 mg/m2剂量组中出现3例窦性心律不齐。120、180 mg/m2剂量组中未见心电图改变。见表1。
表1 健康志愿者不同剂量人重组血管内皮抑素治疗后髓外不良反应 (略)
2.1.2 连续给药组 入组情况：本组纳入肿瘤受试者16例。其中10 mg/m2剂量组入选受试者10例，20、30 mg/m2剂量组各3例，未有脱落病例。
各剂量组患者的性别分布相当，年龄、身高和体重资料均相近。ECOG评分等无差异。(1)其中乳腺癌4例，大肠癌3例，肾癌2例，卵巢癌2例，胃癌、颌下腺癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤各1例。(2)重组人血管内皮抑素注射液临床疗效结果：16例患者中，可评价患者12例，MR 1例，SD 10例，PD 1例。(3)安全性结果：各剂量组受试者的生命体征用药前后均保持稳定，经配对t检验，差异无显著性(P>0.05)。(4)不良反应结果：各剂量组在用药过程中及用药后，血液学、血生化、肝肾功能未出现不良反应。20 mg/m2剂量组中，出现1例Ⅱ级发热病例，于给药第4～10天发热，常在每次输液后2 h内，考虑与用药有关。10 mg/m2剂量组用药后出现1例心肌缺血、1例出现室性期前收缩；20 mg/m2剂量组用药后出现1例心肌缺血，患者无明显临床症状；30 mg/m2剂量组未出现前后变化。见表2。
表2 连续给药组不同剂量人重组血管内皮抑素静滴后髓外不良反应 (略)
图1 健康志愿者单次输注不同剂量重组人血管内皮抑素的血药浓度-时间曲线(略)
2.2 药代动力学试验结果
2.2.1 单次给药组 血药浓度-时间曲线：用药前健康受试者血浆用ELISA方法均可测得内源性Endostatin存在，60 mg/m2、120 mg/m2和180 mg/m2 3个剂量组的内源性Endostatin平均分别为126.54±25.04、110.44±22.82和114.41±29.18，提示3个剂量组内源性Endostatin含量的组间差异较小。24例健康受试者分别单次静滴rh-Endostatin 60 mg/m2、120 mg/m2或180 mg/m2后，测得各受试者rh-Endostatin血药浓度-时间曲线(见图1)，药动学参数比较，见表3。(2)药动学参数分析：①Tmax、Cmax和AUC：单次给药3个剂量组中大多数受试者Tmax出现在滴注停止时(2h)，平均Tmax分别为(1.785±0.354)h、(1.750±0.463)h和(1.750±0.463)h。在本次研究剂量范围内，Cmax和AUC随给药剂量提高呈线性增加(见图2，3)，且个体间差异较小。②表观分布容积(Vd)：3个剂量组平均表观分布容积分别为(5.374±3.459)L/m2、(9.887±3.72)L/m2和(20.715±9.964)L/m2，Vd计算结果呈现随给药剂量增加而增大的趋势。③半衰期(t1 2α、t1 2β和t1 2Ζ)：低、中、高3个剂量组的分布半衰期(t1 2α)分别为(0.865±0.936)h、(1.077±0.761)h和(2.176±1.491)h，呈现随剂量增加逐渐延长的趋势。3个剂量组的平均消除半衰期(t1 2β)分别为(8.762±19.337)h、(6.59±9.322)h和(26.844±27.194)h。但各剂量组中受试者个体差异比较显著，个体之间t1 2β计算结果可相差几十倍。特别是在180 mg/m2剂量组的8例受试者中，4例t1 2β小于4 h，另外4例t1 2β则大于40 h。3个剂量组统计矩参数t1 2Z计算结果相近，分别为(22.874±12.014)h、(25.109±15.727)h和(24.934±17.095)h，且组内差异较小，建议作为反rh-Endostatin体内消除情况的主要参数，主要参数见表3。
图2 Cmax随剂量变化趋势(略)
图3 AUC随剂量变化趋势(略)
表3 健康受试者单次静滴rh-Endostatin后的药动学参数比较(略)
2.2.2 多次给药组 血药浓度-时间曲线及药动学参数：图4显示，在rh-Endostatin 10 mg/m2剂量下，2 h滴注给药完成后rh-Endostatin的血浆浓度立即下降，完成首剂量给药后12 h rh-Endostatin浓度基本回到基线水平，在连续给药7天后未发现明显的药物蓄积现象，进一步观察连续给药第14天和第28天的药物谷浓度分别为(220.447±31.860)μg/L和(251.424±59.241)μg/L(见表4)，均保持在较低的浓度水平，且与Css_av相近。表明rh-Endostatin 10 mg/m2静脉滴注2 h，连用28天，在体内的维持浓度较低且不会产生明显蓄积。
受试者接受连续28天的rh-Endostatin 10 mg/m2静脉滴注2 h，药物谷浓度在连续给药1周左右达到稳态水平，Css_max为(861.286 ±160.264)μg/L，Css_min为(166.312±53.355)μg/L，Css_av为(272.439±91.975)μg/L。AUCss为(6538.524±2207.404)μg/(L·h)，波动系数DF为2.942±1.517，见表4。
图4 连续输注重组人血管内皮抑素(10 mg/m2)的血药浓度-时间曲线(略)
表4 10名受试者多次静滴10(mg/m2)rh-Endostatin后的主要药动学参数(略)
3 讨论
抗肿瘤血管生成的理论源于美国哈佛大学医学院儿童医院Folkman博士提出了关于肿瘤血管形成以及通过抗血管生成(anti-angiogenesis)抑制肿瘤生长的假设[5]，主要通过抑制肿瘤血管的形成来达到抑制肿瘤生长的目的。虽然不能消除所有的肿瘤细胞，但能阻止肿瘤细胞的生长，这种治疗方式称为抗血管生成疗法，又称为“诱导休眠”。肿瘤血管的形成依赖于血管内皮细胞的激活、增殖、吸附和成熟过程，所有这些过程都可以成为血管形成抑制剂作用的靶点。美国Entre Med公司用酵母表达的重组人内皮抑素对多种肿瘤模型有抗肿瘤活性，其抗肿瘤谱广、毒性轻微[6]。由江苏吴中实业股份有限公司苏州中凯生物制药厂联合研制的重组人内皮抑素注射液，采用大肠杆菌作为表达载体，不加任何修饰，同天然人源的内皮抑素氨基酸序列相同。临床前研究显示，在20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg剂量，连续静脉给药7天对小鼠肝癌H22平均抑瘤率为68.06%、51.18%和43.47%。对小鼠Lewis肺癌平均抑瘤率分别为61.61%、48.44%和30.21%。对小鼠B16黑色素瘤肺转移的抑制率为73.85%、72.96%和68.80%，对小鼠黑色素瘤肺转移有明显的抑制作用。对移植于裸鼠的人体表皮癌A431、肠癌LOVO静脉连续给药7~14天，高剂量(20 mg/kg)抑瘤率达60%以上，量效关系明显，对已形成的肿瘤的生长显示了明显的抑制作用。重组人内皮抑素注射液5 mg/kg、10 mg/kg分别与小剂量环磷酰胺、甲氨蝶呤、丝裂霉素C联合应用对小鼠肝癌H22生长的抑制作用明显强于单独用药，有一定的协同作用；重组人内皮抑素10 mg/kg与氟尿嘧啶(5-FU)合用时对人体肝癌QGY的抑瘤率明显高于两药单独使用，有协同作用。实验结果提示：重组人内皮抑素注射液可与化疗药物联合应用以降低化疗剂量，减少毒副作用。小鼠、大鼠急性毒性试验，大鼠和猴长期毒性试验均未见与该药有关的明显毒性，说明该药无明显毒性。制剂安全性试验静脉刺激和溶血试验均阴性，豚鼠过敏试验反应阳性，主要是由于该药为重组人的蛋白制品。
根据临床前药效学、毒理学及临床药动学研究结果，同时参考国内外类似产品Ⅰ期临床用药剂量[6，7]，本试验选择单次给药30～180 mg/m2，临床实施过程中的4个剂量组均未出现Ⅲ级以上毒性，按研究计划该剂量范围已经可以满足有效性研究的需要，连续28天10～30 mg/m2给药，不良反应主要表现为Ⅰ度皮疹，Ⅰ~Ⅱ度腹泻，1例Ⅱ度发热，少数受试者表现为心电图的改变，包括窦性心律不齐、心肌缺血、室性期前收缩。国内外文献也有类似报道，原因不明，尚需进一步研究。
连续给药组可评价患者12例，10 mg/m2剂量组中，1例MR，1例疾病进展，其他均为疾病稳定；各剂量组未见CR和PR病例。结果同AHG Hansma[7]，与杨林报道一致[8]。究其原因考虑为：(1)选择患者多为多疗程晚期患者；(2)药物进入机体可能代谢分解；(3)据报道药物进入机体，血中检测出相应抗体，而影响疗效。
本次药代动力学研究分别考察了重组人内皮抑素注射液(rh-Endostatin)经单次给药和多次给药后体内分布代谢特征并得到主要药动学参数。所采用美国R&D Systems公司生产的Quantikine免疫分析药盒，特异性强、灵敏度高，各批结果稳定。但是，一些客观存在的因素仍然可能导致检测结果的偏差。例如，由于受试药物本身可能是一种由蛋白N段脱落4个氨基酸或不脱落的组分组成的rh-Endostatin混合物，商业化的ELISA试剂盒往往能100%的识别这两种组分，这意味着N端发生水解或糖基化等导致蛋白失活的组分也能被检测。另一方面，含量的测定结果并不能与临床效果直接对应，因为用来测定蛋白总量的ELISA方法，不能测定蛋白活性，rh-Endostatin在体内经蛋白酶降解可能降低其活性，但却无法用ELISA方法进行测定。
国内文献报道[8]，烟台荣昌生物工程有限公司研制的rh-Endostatin注射液(YH-16)60 mg/m2静脉滴注30 min，AUC为(18.67±4.08)μg/(ml·h)与本研究同剂量组结果相近，但其Cmax为(13.87±0.61)μg/ml高于本研究同剂量结果，这可能与其给药时间短有关。另外，美国MD Anderson癌症中心与Dana-Farber癌症研究所共同完成的rh-Endostatin临床I期试验结果显示[9]，内源性Endostatin的血浆浓度仅为(27.6±12.9)μg/L，低于本研究中得到的国人内源性Endostatin血浆浓度[(117.13±25.68)μg/L，n=24]，同时也低于YH-16研究组的结果[(234.25±76.5)μg/L，n=12]。进一步比较相应剂量组给药后血浆rh-Endostatin浓度，其Cmax和AUC均明显低于本研究组和YH-16研究组结果，产生这种差异的原因可能与人种、检测方法、给药方案以及药物来源等因素有关，有待进一步研究。
重组人内皮抑素Ⅰ期临床研究显示，健康志愿者单次给药剂量达到180 mg/m2，未见明显Ⅲ级以上毒性，满足有效性研究的需要；晚期肿瘤患者连续28天给药，少数出现心电图改变，其余不良反应轻微，推荐Ⅱ期临床给药剂量为10 mg/m2，连续28天，以进一步考察本药对肿瘤患者的疗效和安全性。
[参考文献]
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3 Gehan EA，Teffe MC.Will there be resistance to the RECIST(Respones Evaluation Criteria In Solid Tumors)，121.J Natl Cancer Inst，2000，92(3)：179-181.
4 赵香兰.临床药代动力学.郑州：郑州大学出版社，2003，121.
5 Folkman J.Tumor angiogenesis：therapeutic implications.N Engl J Med，1971，285：1182-1186.
6 Thomas JP，Araoomanian RZ，Alberti D，et al.PhaseⅠpharmacokinetic and pharmacodynamic study of recombinant human endostatin in patients with advanced solid tumors.Journal of Clinical Oncology，2003，21：223-231.
7 AHG Hansma，HJ Broxterman，Ivander Horst，et al.Recombinant human endostatin administered as a 28-day continuous injections：a phase and pharmacokinetic study in patients with advanced cancer.Annals of Oncology，2005，16：1695-1701.
8 杨林，王金万，汤仲明，等.重组人血管内皮抑制素Ⅰ期临床研究.中国新药研究，2004，13(6)：538-552.
9 Sim BK，MacDonald NJ，Gubish ER.Angiostatin and endostatin：Endogenous inhibitors of tumour growth.Cancer Metastasis Rev，2000，19(1-2)：181-190.
(编辑：乔 琪)
作者单位： 300060 天津，天津医科大学肿瘤医院内二科, 百拇医药(佟仲生，阎昭，巴一，李淑芬，史业辉，何丽宏，汪旭，)