“酚氯仿裂解法”提取质粒DNA
【关键词】 质粒DNA；酚氯仿；提取；内切酶；聚合酶链反应；电泳
1材料和方法
1.1材料含有人柯萨奇腺病毒受体 (human Coxsackie and adenovirus receptor, hCAR)基因的真核表达质粒载体pIRES2EGFPhCAR由本研究所构建；转化菌E.coli DH5a由本研究所保存；内切酶PstI购自TaKaRa公司. LB培养基(蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g). Tris饱和酚、氯仿按1∶1体积比配制成混合液；无水乙醇；RTE溶液： 10 mmol/L TrisHCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA+20 mg/mL RNase A(无DNase). 直径35 mm可反复使用针式小滤器及0.22 μm滤膜购自华美生物生物公司.
1.2方法 ① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 μg/mL)摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿(1∶1体积)混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37℃，1 h). 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据参考文献[1]设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素(30 μ/mL)LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况.
2结果
提取质粒DNA经Pst I酶切能获得1.17 kb的目的片断(图1). 以提取质粒DNA为模版，进行目的基因hCAR的PCR，可以获得714 bp产物片断，与预期大小一致(图2). 提取质粒DNA常规转化感受态细菌，能获得较多的阳性克隆.
M: maker；1： 未酶切质粒，星号所示为超螺旋结构的质粒DNA；2： 经PstI酶切质粒片断.
图1质粒酶切片断的电泳结果(略)
M: marker;1~2: PCR产物.
图2PCR电泳(略)
3讨论
目前常用的质粒提取方法是在“碱裂解法”[2]基础上优化和改进形成. “碱裂解法”所需溶液试剂比较多，配制过程繁琐. “酚氯仿裂解法”[3]利用酚氯仿混合有机溶剂破碎细菌，使菌体蛋白质变性析出，细菌核酸、质粒DNA经无水乙醇沉淀后，用RNase A降解RNA，细菌基因组DNA和质粒DNA被提取出. 由于该方法质粒DNA未经变性复性过程，三级结构保持较完整，所以提取的质粒DNA以超螺旋结构为主. 本方法提取的质粒DNA中含有细菌基因组DNA，影响提取质粒DNA的准确定量，但这并不影响下一步的实验，如酶切、转化、亚克隆以及聚和酶链反应等基本分子生物学实验.
【参考文献】
[1] Lai YJ, Pong RC, McConnell JD, et al. Surrogate marker for predicting the virus binding of urogenital cancer cells during adenovirusbased gene therapy [J]. Biotechniques, 2003,35(1):186-190,192-194.
[2] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 3nd ed [M]. Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001:16-19.
[3] Song J, Geltinger C, Sun K, et al. Direct lysis method for the rapid preparation of plasmid DNA [J]. Anal Biochem,1999,271(1):89-91.
编辑许昌泰
(西安交通大学第一附属医院泌尿外科研究所，陕西 西安 710061), http://www.100md.com(张林琳，李翔，张栋，贺大林，李磊，王新阳)
1材料和方法
1.1材料含有人柯萨奇腺病毒受体 (human Coxsackie and adenovirus receptor, hCAR)基因的真核表达质粒载体pIRES2EGFPhCAR由本研究所构建；转化菌E.coli DH5a由本研究所保存；内切酶PstI购自TaKaRa公司. LB培养基(蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g). Tris饱和酚、氯仿按1∶1体积比配制成混合液；无水乙醇；RTE溶液： 10 mmol/L TrisHCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA+20 mg/mL RNase A(无DNase). 直径35 mm可反复使用针式小滤器及0.22 μm滤膜购自华美生物生物公司.
1.2方法 ① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 μg/mL)摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿(1∶1体积)混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37℃，1 h). 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据参考文献[1]设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素(30 μ/mL)LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况.
2结果
提取质粒DNA经Pst I酶切能获得1.17 kb的目的片断(图1). 以提取质粒DNA为模版，进行目的基因hCAR的PCR，可以获得714 bp产物片断，与预期大小一致(图2). 提取质粒DNA常规转化感受态细菌，能获得较多的阳性克隆.
M: maker；1： 未酶切质粒，星号所示为超螺旋结构的质粒DNA；2： 经PstI酶切质粒片断.
图1质粒酶切片断的电泳结果(略)
M: marker;1~2: PCR产物.
图2PCR电泳(略)
3讨论
目前常用的质粒提取方法是在“碱裂解法”[2]基础上优化和改进形成. “碱裂解法”所需溶液试剂比较多，配制过程繁琐. “酚氯仿裂解法”[3]利用酚氯仿混合有机溶剂破碎细菌，使菌体蛋白质变性析出，细菌核酸、质粒DNA经无水乙醇沉淀后，用RNase A降解RNA，细菌基因组DNA和质粒DNA被提取出. 由于该方法质粒DNA未经变性复性过程，三级结构保持较完整，所以提取的质粒DNA以超螺旋结构为主. 本方法提取的质粒DNA中含有细菌基因组DNA，影响提取质粒DNA的准确定量，但这并不影响下一步的实验，如酶切、转化、亚克隆以及聚和酶链反应等基本分子生物学实验.
【参考文献】
[1] Lai YJ, Pong RC, McConnell JD, et al. Surrogate marker for predicting the virus binding of urogenital cancer cells during adenovirusbased gene therapy [J]. Biotechniques, 2003,35(1):186-190,192-194.
[2] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 3nd ed [M]. Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001:16-19.
[3] Song J, Geltinger C, Sun K, et al. Direct lysis method for the rapid preparation of plasmid DNA [J]. Anal Biochem,1999,271(1):89-91.
编辑许昌泰
(西安交通大学第一附属医院泌尿外科研究所，陕西 西安 710061), http://www.100md.com(张林琳，李翔，张栋，贺大林，李磊，王新阳)