CLA与胰岛素抵抗的关系研究
【摘要】 目的 通过研究共轭亚油酸CLA对2型糖尿病小鼠肝脏和血清中FFA及TNF-α的作用探讨其与胰岛素抵抗的关系。方法 通过对饲喂高糖高脂饲料建立起来的肥胖型小鼠注射链脲佐菌素，建立2型糖尿病小鼠模型，给模型鼠分别喂食CLA 36天，测定小鼠血清和肝脏FFA及TNF-α指标。结果 与对照组相比，喂食CLA能使2型糖尿病小鼠肝脏和血清中的FFA及TNF-α显著降低(P<0.01)。结论 对实验性胰岛素抵抗小鼠的研究证明CLA有改善胰岛素抵抗的作用，其作用机制之一可能是通过抑制机体FFA及TNF-α水平而发挥作用。
【关键词】 共轭亚油酸(CLA)；2型糖尿病小鼠； 游离脂肪酸； 肿瘤坏死因子α
Relationships between CLA and insulin resistant
JIANG Wei，YI Dan，SHI Hong-qi，et al.First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China
【Abstract】 Objective The effects of CLA on FFA and TNF-αin liver and serum of diabetic mice were researched in order to discuss the relationships between CLA and insulin resistant.Methods In this study the type 2 diabetic mice model were built up by feeding a diet rich in fat and sugar and then injected with Streptozotocin.The diabetic mice were fed with CLA for 36 days then FFA and TNF α were determined.Results The FFA and TNF-α in liver and serum of diabetic mice were remarkably decreased after feeding CLA(P<0.05).Conclution The researches on the diabetic mice of insulin resistant shew that CLA could improve the insulin resistant.The mechanism may be related to deceasing TNF α and FFA.
【Key words】 CLA；type 2 diabetes mice；FFA；TNF-α
胰岛素抵抗是公认的2型糖尿病的病理生理基础[1]，近年来逐步成为人们关注的热点，目前在2型糖尿病的胰岛素抵抗机制研究中，主要集中在游离脂肪酸(FFA)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等方面[2]。FFA是联系肥胖和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的重要环节，高浓度的FFA可以通过多种途径影响胰岛素的作用及葡萄糖代谢，与胰岛素抵抗的发生有着密切关系[3～6]。TNF-α主要由巨噬细胞产生，具有广泛的生理功能[7]。国外的大量报道提示，TNF-α可能是胰岛素抵抗发病机制中的重要中介环节[8～10]。体内及体外实验均证明TNF-α可干扰周围组织胰岛素作用致胰岛素抵抗。因此，本文通过研究CLA对肝脏和血清中FFA及TNF-α的作用探讨其与胰岛素抵抗的关系。
1 实验材料
1.1 实验动物 实验动物昆明种小鼠，购自青岛市实验动物中心，雄性，4周龄，体重为18～22g。
1.2 样品 试验用CLA由青岛澳海生物有限公司提供，含量为89.8%。
1.3 主要仪器和试剂 稳态血糖仪(美国强生公司)；GC-112气相色谱仪(上海分析仪器厂)；TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Bio-Rad550型酶联免疫检测仪；96孔培养板、移液器；游离脂肪酸测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α检测试剂盒(第四军医大学)。
1.4 饲料 基础饲料：购自青岛市实验动物中心。高糖高脂饲料：基础饲料中加入10%蛋黄粉、10%熟猪油、1%胆固醇、0.5%脱氧胆酸钠。
2 实验方法
2.1 模型建立 随机选取生长正常的小鼠40只，饲喂高脂高糖饲料4周，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，注射量为100mg/kg，同时继续饲喂高脂高糖饲料4周，模型对照组注射0.05mol/L的柠檬酸溶液，每周监测小鼠血糖值，选取血糖达到糖尿病级数的小鼠作为糖尿病模型小鼠。
2.2 小鼠肝脏和血清FFA含量测定 利用FFA能与铜离子结合成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其量与FFA含量成正比，用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可推算出FFA的含量。按试剂盒说明操作。
2.3 小鼠肝脏和血清TNF-α含量测定 按试剂盒说明以ELISA法操作。酶标仪，410nm处测定OD值，制作标准曲线，通过标本的OD410nm值，利用标准曲线计算出其TNF-α浓度。
2.4 剂量选择 共轭亚油酸人体推荐量为0.1g/kg体重。扩大10倍作为实验用中剂量，即1.0g/kg，上、下各设一个剂量组2.0g/kg和0.5g/kg，分别作为高剂量组和低剂量组。
2.5 实验步骤 20只基础饲料喂养的大鼠分为两组作为普通对照组和普通CLA组，40只高脂饲料喂养的模型大鼠随机分为4组：模型对照组、低、中、高剂量组。普通对照组和模型对照组均给予花生油；普通CLA组和模型低、中、高剂量组大鼠分别给予相应剂量的CLA。连续给药36天，检测小鼠血清和肝脏FFA和TNF-α水平。
3 结果与讨论
3.1 CLA对小鼠血清和肝脏TNF-α水平的影响 CLA对血清和肝脏TNF-α水平影响的实验结果见图1和图2。可以看出CLA对正常小鼠血清和肝脏TNF-α水平的影响不明显(P>0.05)，而对模型组小鼠，低、中、高剂量组小鼠血清TNF-α均明显降低，经统计学分析，差异有非常显著性(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，其作用效果的顺序为高剂量>中剂量>低剂量。
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图1 CLA对血清TNF-α的影响
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图2 CLA对肝脏TNF-α的影响
3.2 CLA对小鼠血清和肝脏FFA含量的影响 CLA对小鼠血清和肝脏FFA含量影响的实验结果分别见图3和图4。可以看出，与对TNF-α影响的规律基本一致，即CLA对正常小鼠血清和肝脏FFA水平的影响不明显(P>0.05)，而对模型组小鼠，低剂量、中剂量和高剂量样品都能显著降低糖尿病小鼠血清和肝脏的FFA含量(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，但3种剂量样品之间作用差异无显著性(P>0.05)。
4 讨论
胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发病机制的主要环节。在大多数2型糖尿病患者中，胰岛素抵抗是始动因素。TNF-α是一种具有多功能的细胞因子，可降低胰岛素受体的自身磷酸化和其后的胰岛素受体底物-1(IRS-1)酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素传导途径，并可使GluT4mRNA水平显著下降，结果使胰岛素刺激时细胞摄取葡萄糖的能力下降。故TNF-α在受体后胰岛素抵抗中起
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图3 CLA对血清FFA的影响
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图4 CLA对肝脏FFA的影响
重要作用。FFA是联系肥胖和胰岛素抵抗及高胰岛素血症的重要环节，肥胖患者脂肪分解合成代谢旺盛，导致血液FFA浓度升高，高浓度的FFA可通过多种途径影响胰岛素的作用及葡萄糖代谢，与胰岛素抵抗的发生有着密切关系。TNF-α和FFA在胰岛素抵抗方面的研究为治疗2型糖尿病开辟了新的途径。
通过本研究证明，喂食CLA能使糖尿病小鼠肝脏和血清中的TNF-α和FFA显著降低。这说明对实验性胰岛素抵抗小鼠的研究证明CLA有改善胰岛素抵抗的作用，其作用机制之一可能是通过抑制机体FFA和TNF-α水平而发挥作用，但胰岛素抵抗是一个很复杂的过程，因此研究CLA改善胰岛素抵抗，调节血糖的作用还需要继续深入研究。
【参考文献】
1 沈隽.TNF-α与肥胖、2型糖尿病的胰岛素抵抗.国外医学·生理、病理科学与临床分册，2002，2(20):154-156.
2 郭建辉.2型糖尿病肿瘤坏死因子-α与胰岛素抵抗关系的研究现状.甘肃中医，2003，4(16):10-11.
3 郭启煜，郭妍.游离脂肪酸导致胰岛素抵抗的机制.国外医学·生理病理科学与临床分册，2002，1(22):80-83.
4 Boden G.Fatty acids and insulin resistane.Diabetes Care，1996，19(4):394-395.
5 Chen X，Bodern G.Effects of fatty acids on insulin secretion in patients with NIDDM.Diabetes，1996，45:311.
6 Carpentier A，Mittelman SD，Bergman RN，et al.Prolonged elevation of plasma free fatty acids impairs pancreatic beta-cell function in obese nondiabetic humans but not in individuals with type2 diabetes.Diabetes，2000，49(3):399-406.
7 吴静.肿瘤坏死因子-α与胰岛素抵抗.国外医学·内分泌学分册，1999，19(5):220.
8 王占科.TNF-α与胰岛素抵抗.国外医学·临床生物化学与检验学分册，1996，4(17):173-175.
8 鲁瑾.高脂饮食诱发胰岛素抵抗后肿瘤坏死因子-α的改变.中国糖尿病杂志，1999，7(5):284-286.
10 Fasshauer M，Klein J，Neumann S，et al.Biochem Biophys Res Commun，2001，288(4):1027-1031.
作者单位： 266061 山东青岛，国家海洋局第一海洋研究所
(编辑：汪 洋), 百拇医药(姜伟，衣 丹，石红旗，刘发义)
【关键词】 共轭亚油酸(CLA)；2型糖尿病小鼠； 游离脂肪酸； 肿瘤坏死因子α
Relationships between CLA and insulin resistant
JIANG Wei，YI Dan，SHI Hong-qi，et al.First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China
【Abstract】 Objective The effects of CLA on FFA and TNF-αin liver and serum of diabetic mice were researched in order to discuss the relationships between CLA and insulin resistant.Methods In this study the type 2 diabetic mice model were built up by feeding a diet rich in fat and sugar and then injected with Streptozotocin.The diabetic mice were fed with CLA for 36 days then FFA and TNF α were determined.Results The FFA and TNF-α in liver and serum of diabetic mice were remarkably decreased after feeding CLA(P<0.05).Conclution The researches on the diabetic mice of insulin resistant shew that CLA could improve the insulin resistant.The mechanism may be related to deceasing TNF α and FFA.
【Key words】 CLA；type 2 diabetes mice；FFA；TNF-α
胰岛素抵抗是公认的2型糖尿病的病理生理基础[1]，近年来逐步成为人们关注的热点，目前在2型糖尿病的胰岛素抵抗机制研究中，主要集中在游离脂肪酸(FFA)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等方面[2]。FFA是联系肥胖和胰岛素抵抗或高胰岛素血症的重要环节，高浓度的FFA可以通过多种途径影响胰岛素的作用及葡萄糖代谢，与胰岛素抵抗的发生有着密切关系[3～6]。TNF-α主要由巨噬细胞产生，具有广泛的生理功能[7]。国外的大量报道提示，TNF-α可能是胰岛素抵抗发病机制中的重要中介环节[8～10]。体内及体外实验均证明TNF-α可干扰周围组织胰岛素作用致胰岛素抵抗。因此，本文通过研究CLA对肝脏和血清中FFA及TNF-α的作用探讨其与胰岛素抵抗的关系。
1 实验材料
1.1 实验动物 实验动物昆明种小鼠，购自青岛市实验动物中心，雄性，4周龄，体重为18～22g。
1.2 样品 试验用CLA由青岛澳海生物有限公司提供，含量为89.8%。
1.3 主要仪器和试剂 稳态血糖仪(美国强生公司)；GC-112气相色谱仪(上海分析仪器厂)；TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Bio-Rad550型酶联免疫检测仪；96孔培养板、移液器；游离脂肪酸测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-α检测试剂盒(第四军医大学)。
1.4 饲料 基础饲料：购自青岛市实验动物中心。高糖高脂饲料：基础饲料中加入10%蛋黄粉、10%熟猪油、1%胆固醇、0.5%脱氧胆酸钠。
2 实验方法
2.1 模型建立 随机选取生长正常的小鼠40只，饲喂高脂高糖饲料4周，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，注射量为100mg/kg，同时继续饲喂高脂高糖饲料4周，模型对照组注射0.05mol/L的柠檬酸溶液，每周监测小鼠血糖值，选取血糖达到糖尿病级数的小鼠作为糖尿病模型小鼠。
2.2 小鼠肝脏和血清FFA含量测定 利用FFA能与铜离子结合成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其量与FFA含量成正比，用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可推算出FFA的含量。按试剂盒说明操作。
2.3 小鼠肝脏和血清TNF-α含量测定 按试剂盒说明以ELISA法操作。酶标仪，410nm处测定OD值，制作标准曲线，通过标本的OD410nm值，利用标准曲线计算出其TNF-α浓度。
2.4 剂量选择 共轭亚油酸人体推荐量为0.1g/kg体重。扩大10倍作为实验用中剂量，即1.0g/kg，上、下各设一个剂量组2.0g/kg和0.5g/kg，分别作为高剂量组和低剂量组。
2.5 实验步骤 20只基础饲料喂养的大鼠分为两组作为普通对照组和普通CLA组，40只高脂饲料喂养的模型大鼠随机分为4组：模型对照组、低、中、高剂量组。普通对照组和模型对照组均给予花生油；普通CLA组和模型低、中、高剂量组大鼠分别给予相应剂量的CLA。连续给药36天，检测小鼠血清和肝脏FFA和TNF-α水平。
3 结果与讨论
3.1 CLA对小鼠血清和肝脏TNF-α水平的影响 CLA对血清和肝脏TNF-α水平影响的实验结果见图1和图2。可以看出CLA对正常小鼠血清和肝脏TNF-α水平的影响不明显(P>0.05)，而对模型组小鼠，低、中、高剂量组小鼠血清TNF-α均明显降低，经统计学分析，差异有非常显著性(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，其作用效果的顺序为高剂量>中剂量>低剂量。
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图1 CLA对血清TNF-α的影响
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图2 CLA对肝脏TNF-α的影响
3.2 CLA对小鼠血清和肝脏FFA含量的影响 CLA对小鼠血清和肝脏FFA含量影响的实验结果分别见图3和图4。可以看出，与对TNF-α影响的规律基本一致，即CLA对正常小鼠血清和肝脏FFA水平的影响不明显(P>0.05)，而对模型组小鼠，低剂量、中剂量和高剂量样品都能显著降低糖尿病小鼠血清和肝脏的FFA含量(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，但3种剂量样品之间作用差异无显著性(P>0.05)。
4 讨论
胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发病机制的主要环节。在大多数2型糖尿病患者中，胰岛素抵抗是始动因素。TNF-α是一种具有多功能的细胞因子，可降低胰岛素受体的自身磷酸化和其后的胰岛素受体底物-1(IRS-1)酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素传导途径，并可使GluT4mRNA水平显著下降，结果使胰岛素刺激时细胞摄取葡萄糖的能力下降。故TNF-α在受体后胰岛素抵抗中起
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图3 CLA对血清FFA的影响
A-正常对照组 B-正常CLA组 C-模型对照组
D-低剂量组 E-中剂量组 F-高剂量组
图4 CLA对肝脏FFA的影响
重要作用。FFA是联系肥胖和胰岛素抵抗及高胰岛素血症的重要环节，肥胖患者脂肪分解合成代谢旺盛，导致血液FFA浓度升高，高浓度的FFA可通过多种途径影响胰岛素的作用及葡萄糖代谢，与胰岛素抵抗的发生有着密切关系。TNF-α和FFA在胰岛素抵抗方面的研究为治疗2型糖尿病开辟了新的途径。
通过本研究证明，喂食CLA能使糖尿病小鼠肝脏和血清中的TNF-α和FFA显著降低。这说明对实验性胰岛素抵抗小鼠的研究证明CLA有改善胰岛素抵抗的作用，其作用机制之一可能是通过抑制机体FFA和TNF-α水平而发挥作用，但胰岛素抵抗是一个很复杂的过程，因此研究CLA改善胰岛素抵抗，调节血糖的作用还需要继续深入研究。
【参考文献】
1 沈隽.TNF-α与肥胖、2型糖尿病的胰岛素抵抗.国外医学·生理、病理科学与临床分册，2002，2(20):154-156.
2 郭建辉.2型糖尿病肿瘤坏死因子-α与胰岛素抵抗关系的研究现状.甘肃中医，2003，4(16):10-11.
3 郭启煜，郭妍.游离脂肪酸导致胰岛素抵抗的机制.国外医学·生理病理科学与临床分册，2002，1(22):80-83.
4 Boden G.Fatty acids and insulin resistane.Diabetes Care，1996，19(4):394-395.
5 Chen X，Bodern G.Effects of fatty acids on insulin secretion in patients with NIDDM.Diabetes，1996，45:311.
6 Carpentier A，Mittelman SD，Bergman RN，et al.Prolonged elevation of plasma free fatty acids impairs pancreatic beta-cell function in obese nondiabetic humans but not in individuals with type2 diabetes.Diabetes，2000，49(3):399-406.
7 吴静.肿瘤坏死因子-α与胰岛素抵抗.国外医学·内分泌学分册，1999，19(5):220.
8 王占科.TNF-α与胰岛素抵抗.国外医学·临床生物化学与检验学分册，1996，4(17):173-175.
8 鲁瑾.高脂饮食诱发胰岛素抵抗后肿瘤坏死因子-α的改变.中国糖尿病杂志，1999，7(5):284-286.
10 Fasshauer M，Klein J，Neumann S，et al.Biochem Biophys Res Commun，2001，288(4):1027-1031.
作者单位： 266061 山东青岛，国家海洋局第一海洋研究所
(编辑：汪 洋), 百拇医药(姜伟，衣 丹，石红旗，刘发义)