靶向蛋白酶：成功、失败与前景(二)
■鉴别和确认蛋白酶靶标
了解健康与病变中蛋白酶信号的一个关键是鉴别蛋白酶的内生底物，目前已经应用许多方法来达到这一目的，计算生物学、遗传学和蛋白质组学的进展也为其提供了有力手段。例如，通过采用噬菌体展示库、组合荧光底物库或基于共价抑制剂的位置扫描库，一旦确定蛋白酶的扩展底物特性，就可以在基因组范围的基础上获得生物信息学知识，根据已确定的蛋白酶底物特性来发现潜在的底物。
底物搜索的遗传途径通常是采用经典的基因敲除动物模型、RNA干扰(RNAi)技术。在靶标确认中应用的另一种方法往往是动物模型与经典的蛋白酶基因敲除动物模型的结合。这种方法已经用于研究半胱氨酸组织蛋白酶在不同癌细胞模型(例如Rip1-Tag2实验鼠胰岛肿瘤模型)中的作用。
蛋白质组学这一工具非常适合于鉴定和确认潜在的蛋白酶靶标。一些蛋白酶底物最近已经用这种方法确定，包括MMP底物和颗粒酶B底物。
, 百拇医药
■蛋白酶活性的调节
蛋白酶活性是在转录水平受不同表达调控的，在蛋白质水平受无活性酶原的激活和抑制剂及辅因子的结合调控。
活性调节的基本机制存在于大多数的蛋白酶中。潜在的蛋白酶原等待一个激活的信号，这种信号可能来自变构激活体或者其他的蛋白酶。一旦激活后，底物和抑制剂竞争与蛋白酶的结合。蛋白酶活性也受到辅因子的调控，蛋白质往往是以变构的方式可逆地与蛋白酶和/或抑制剂结合，影响其最终活性。蛋白酶活性的其他重要调控物是它们内生或外生的抑制剂。一种抑制剂可以抑制几种蛋白酶，如所有金属肽链内切酶(180种以上)的主要抑制剂仅由4种蛋白质组成：金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)、TIMP2、TIMP3和TIMP4。
迄今为止，在靶向蛋白酶信号的一些途径中，对蛋白酶进行抑制的探索最为广泛。除了直接阻滞靶标蛋白酶的活性外，蛋白酶抑制剂也阻滞下游蛋白酶的激活，或者与辅因子联合影响蛋白酶的活性。
, http://www.100md.com
■直接抑制
◆大分子
在血液凝固领域已经开发出一些以蛋白酶为靶标的新型大分子抑制剂。
第一个例子是水蛭素的衍生物，这是一种从医用水蛭中提纯的强力可逆的凝血酶抑制剂，被批准作为抗凝血剂供临床应用。第二个是来自犬钩口线虫的重组线虫类抗凝血剂蛋白(rNAP)。据报告，rNAP具有令人满意的安全性，在一项IIa临床试验中，治疗急性冠脉综合征(ACS)患者，剂量达10克/千克体重时耐受性良好。
从大豆分离出来的Bowman-Birk抑制剂浓缩物是几种丝氨酸蛋白酶抑制剂的混合物，它主要具有糜蛋白酶抑制活性，也有一些胰岛素的抑制活性，几年前的II期临床试验已表明其治疗口癌有肯定效果。
另一种大分子抑制剂是人源性抗体。虽然对以蛋白酶为靶标的抑制性抗体研究处于早期阶段，但已有一些这类药物处于临床前和早期临床开发中，包括尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和组织蛋白酶B的抑制性抗体用于癌症的治疗，组织因子的抑制性抗体用于广泛的血栓性疾病的治疗，VIIIa因子抑制性抗体用于静脉血栓症的治疗。
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◆小分子
发现蛋白酶抑制药物的主要成就仍然是在小分子抑制剂上。通常，将虚拟筛选、基于结构的筛选和化合物小型集中库的筛选结合起来进行筛选。
开发可逆还是不可逆的抑制剂是发现蛋白酶药物要考虑的重要因素之一。可逆的抑制剂，尤其是选择性好的可逆抑制剂可能仅部分阻滞其他蛋白酶的活性。但不可逆的抑制剂，根据结合动力学不同，迟早会阻滞它能结合的所有蛋白酶。已开发的一些不可逆的抑制剂就存在这种选择性问题。理想的抑制剂应是非共价的可逆抑制剂——通常能提供更好的选择性，引起的副作用要比共价抑制剂少。不过，非共价抑制剂的设计要困难得多。迄今为止，已经开发出为数不多的非共价可逆抑制剂，有些已经上市，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂阿加曲班(Argatroban)，有些则仍处于早期实验阶段。
生物利用度也是蛋白酶抑制剂最优化的关键问题之一。对于在动物模型中可以观察到良好的生物利用度，而在人体上则不能重复这一难题，解决的一个策略是设计能在体内转换成活性代谢物的前体药物，比如ACE抑制剂主要就是作为酯前体药物设计的。
, 百拇医药
蛋白酶药物设计的另一个考虑因素是，抑制剂是竞争性还是非竞争性的。除了第一种抗蛋白酶治疗药物肝素——血凝蛋白酶的一种变构间接抑制剂以外，目前应用或开发的所有其他蛋白酶抑制剂都是竞争性抑制剂。由于采用的活性实验简单，发现竞争性抑制剂通常较容易。但这种途径也有缺陷，例如，竞争性抑制剂可以引起底物竞争的饱和，必须要应用相当高的药物剂量，安全窗狭窄。
虽然开发要困难得多，但变构小分子抑制剂对拮抗许多蛋白酶可能有用。最近Sunesis制药公司完成了一项突破，开发出第一种变构半胱天冬酶抑制剂。
■上调蛋白酶
在一些情形中，上调蛋白酶的活性可能是必须的，要达到这一目的，策略之一是阻滞内生蛋白酶抑制剂的活性。美国伯纳姆研究所的一个小组应用基于聚苯基脲架构的化合物来拮抗蛋白质的凋亡抑制剂(IAP)，由于它能抑制半胱天冬酶的活性，因此能刺激癌细胞的凋亡。细胞培养的初期研究表明，其对癌细胞具有明显的凋亡作用和很好的选择性，包括能增强其他化疗药物的敏感性。此外，这类化合物在肿瘤异种移植物的实验鼠模型中也有效，未显示毒性。
阻滞内生蛋白酶抑制剂的另一条途径是运用反义分子。Aegera Therapeutics公司最近宣称，已开始AEG35156的I期临床试验——这是X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的第二代反义寡核苷酸抑制剂，能促进癌细胞凋亡。单克隆抗体也可能具有潜力，新上市的抗血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1(PAI1)单克隆抗体33H1F7显示，能将活性PAI1转换成组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的底物，从而促进实验鼠肠系膜动脉模型的的溶栓治疗。
(二)
(余志平 编译), 百拇医药
了解健康与病变中蛋白酶信号的一个关键是鉴别蛋白酶的内生底物，目前已经应用许多方法来达到这一目的，计算生物学、遗传学和蛋白质组学的进展也为其提供了有力手段。例如，通过采用噬菌体展示库、组合荧光底物库或基于共价抑制剂的位置扫描库，一旦确定蛋白酶的扩展底物特性，就可以在基因组范围的基础上获得生物信息学知识，根据已确定的蛋白酶底物特性来发现潜在的底物。
底物搜索的遗传途径通常是采用经典的基因敲除动物模型、RNA干扰(RNAi)技术。在靶标确认中应用的另一种方法往往是动物模型与经典的蛋白酶基因敲除动物模型的结合。这种方法已经用于研究半胱氨酸组织蛋白酶在不同癌细胞模型(例如Rip1-Tag2实验鼠胰岛肿瘤模型)中的作用。
蛋白质组学这一工具非常适合于鉴定和确认潜在的蛋白酶靶标。一些蛋白酶底物最近已经用这种方法确定，包括MMP底物和颗粒酶B底物。
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■蛋白酶活性的调节
蛋白酶活性是在转录水平受不同表达调控的，在蛋白质水平受无活性酶原的激活和抑制剂及辅因子的结合调控。
活性调节的基本机制存在于大多数的蛋白酶中。潜在的蛋白酶原等待一个激活的信号，这种信号可能来自变构激活体或者其他的蛋白酶。一旦激活后，底物和抑制剂竞争与蛋白酶的结合。蛋白酶活性也受到辅因子的调控，蛋白质往往是以变构的方式可逆地与蛋白酶和/或抑制剂结合，影响其最终活性。蛋白酶活性的其他重要调控物是它们内生或外生的抑制剂。一种抑制剂可以抑制几种蛋白酶，如所有金属肽链内切酶(180种以上)的主要抑制剂仅由4种蛋白质组成：金属蛋白酶的组织抑制剂1(TIMP1)、TIMP2、TIMP3和TIMP4。
迄今为止，在靶向蛋白酶信号的一些途径中，对蛋白酶进行抑制的探索最为广泛。除了直接阻滞靶标蛋白酶的活性外，蛋白酶抑制剂也阻滞下游蛋白酶的激活，或者与辅因子联合影响蛋白酶的活性。
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■直接抑制
◆大分子
在血液凝固领域已经开发出一些以蛋白酶为靶标的新型大分子抑制剂。
第一个例子是水蛭素的衍生物，这是一种从医用水蛭中提纯的强力可逆的凝血酶抑制剂，被批准作为抗凝血剂供临床应用。第二个是来自犬钩口线虫的重组线虫类抗凝血剂蛋白(rNAP)。据报告，rNAP具有令人满意的安全性，在一项IIa临床试验中，治疗急性冠脉综合征(ACS)患者，剂量达10克/千克体重时耐受性良好。
从大豆分离出来的Bowman-Birk抑制剂浓缩物是几种丝氨酸蛋白酶抑制剂的混合物，它主要具有糜蛋白酶抑制活性，也有一些胰岛素的抑制活性，几年前的II期临床试验已表明其治疗口癌有肯定效果。
另一种大分子抑制剂是人源性抗体。虽然对以蛋白酶为靶标的抑制性抗体研究处于早期阶段，但已有一些这类药物处于临床前和早期临床开发中，包括尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和组织蛋白酶B的抑制性抗体用于癌症的治疗，组织因子的抑制性抗体用于广泛的血栓性疾病的治疗，VIIIa因子抑制性抗体用于静脉血栓症的治疗。
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◆小分子
发现蛋白酶抑制药物的主要成就仍然是在小分子抑制剂上。通常，将虚拟筛选、基于结构的筛选和化合物小型集中库的筛选结合起来进行筛选。
开发可逆还是不可逆的抑制剂是发现蛋白酶药物要考虑的重要因素之一。可逆的抑制剂，尤其是选择性好的可逆抑制剂可能仅部分阻滞其他蛋白酶的活性。但不可逆的抑制剂，根据结合动力学不同，迟早会阻滞它能结合的所有蛋白酶。已开发的一些不可逆的抑制剂就存在这种选择性问题。理想的抑制剂应是非共价的可逆抑制剂——通常能提供更好的选择性，引起的副作用要比共价抑制剂少。不过，非共价抑制剂的设计要困难得多。迄今为止，已经开发出为数不多的非共价可逆抑制剂，有些已经上市，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂阿加曲班(Argatroban)，有些则仍处于早期实验阶段。
生物利用度也是蛋白酶抑制剂最优化的关键问题之一。对于在动物模型中可以观察到良好的生物利用度，而在人体上则不能重复这一难题，解决的一个策略是设计能在体内转换成活性代谢物的前体药物，比如ACE抑制剂主要就是作为酯前体药物设计的。
, 百拇医药
蛋白酶药物设计的另一个考虑因素是，抑制剂是竞争性还是非竞争性的。除了第一种抗蛋白酶治疗药物肝素——血凝蛋白酶的一种变构间接抑制剂以外，目前应用或开发的所有其他蛋白酶抑制剂都是竞争性抑制剂。由于采用的活性实验简单，发现竞争性抑制剂通常较容易。但这种途径也有缺陷，例如，竞争性抑制剂可以引起底物竞争的饱和，必须要应用相当高的药物剂量，安全窗狭窄。
虽然开发要困难得多，但变构小分子抑制剂对拮抗许多蛋白酶可能有用。最近Sunesis制药公司完成了一项突破，开发出第一种变构半胱天冬酶抑制剂。
■上调蛋白酶
在一些情形中，上调蛋白酶的活性可能是必须的，要达到这一目的，策略之一是阻滞内生蛋白酶抑制剂的活性。美国伯纳姆研究所的一个小组应用基于聚苯基脲架构的化合物来拮抗蛋白质的凋亡抑制剂(IAP)，由于它能抑制半胱天冬酶的活性，因此能刺激癌细胞的凋亡。细胞培养的初期研究表明，其对癌细胞具有明显的凋亡作用和很好的选择性，包括能增强其他化疗药物的敏感性。此外，这类化合物在肿瘤异种移植物的实验鼠模型中也有效，未显示毒性。
阻滞内生蛋白酶抑制剂的另一条途径是运用反义分子。Aegera Therapeutics公司最近宣称，已开始AEG35156的I期临床试验——这是X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的第二代反义寡核苷酸抑制剂，能促进癌细胞凋亡。单克隆抗体也可能具有潜力，新上市的抗血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1(PAI1)单克隆抗体33H1F7显示，能将活性PAI1转换成组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的底物，从而促进实验鼠肠系膜动脉模型的的溶栓治疗。
(二)
(余志平 编译), 百拇医药