TGF-β1对胃癌细胞和耐药性胃癌细胞生长及p16，cyclin D1蛋白表达的影响
[摘要] [目的] 探讨TGF-β1对胃癌细胞株SNU-601/WT和耐药性胃癌细胞株SNU-601/cis2生长p16，cyclin D1蛋白表达的影响. [方法] 将经TGF-β1处理SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞作为实验组，未经处理的作为对照组，利用MTT法检测TGF-β1对两组细胞生存率的影响，并利用免疫细胞化学方法检测各组细胞内p16，cyclin D1蛋白表达情况. [结果] 实验组SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生存率呈时间依赖性下降，与对照组比较均有显著性差异;SUN-601/WT，SNU-601/cis2实验组细胞内p16蛋白表达呈时间依赖性增强，而cyclin D1蛋白表达则无明显变化. [结论] TGF-β1具有抑制SNU-601/WT胃癌细胞和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞生长作用，其机制可能与增强p16蛋白表达有关，而与cyclin D1蛋白无明显相关性.
[关键词] 胃肿瘤;耐药性;基因，p16
Effects of TGF-β1on gastric cancer and drug resistant cells line growth，p16and cyclin D1protein expression
LI Zhu-hu 1 ，REN Xiang-shan 1 ，LEE Mi-za 2
(1.Department of Pathology，Yanbian University College of Basic Medicine，Yanji133000，Jilin，China;2.Department of Pathology，Chosun University College of Medicine，Korea)
ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the effects of TGF-β1on the cell growth of gastric cancer cell line SNU-601/WT and drug resistant cell line SNU-601/cis2and the expression of p16and cyclin D1protein.METHODS SNU-601/WT and SNU-601/cis2cell lines were divided into the experimental and control groups.The effect of TGF-β1on survival rate of these cell lines were measured by MTT assay.The protein expression of p16and cyclin D1were detected by immunocytochemical staining.RESULTS In the experimental group，the growth rate of SNU-601/WT and SNU-601/cis2were decreased along with the time process.All were significantly different compared with the control group.In the mean while，the growth rate of drug resistant cell line was lower than that of the gastric cancer cell line at48and72h.TGF-β1was a time-dependent increase incells positive for p16expression in the experimental group.But，the expression of cyclin D1were without difference in the experimental group and control group.CONCLUSION TGF-β1can inhibit the growth of SNU-601/WT gastric cancer cell and SNU-601/cis2drug resistant cell，and increase p16protein expression，but has no significant influence cyclin D1protein expression.
Key words:stomach neoplasms;drug resistance;genes，p16
β转化生长因子(transforming growth factor-be-ta，TGF-β)是分子质量为25ku的蛋白质，对多种类型细胞生长具有抑制作用 [1，2] .本研究通过观察TGF-β1对胃癌细胞和耐药性胃癌细胞生长及p16，cyclin D1蛋白表达的影响，探讨了TGF-β1对胃癌细胞，尤其是耐药性胃癌细胞生长的影响及其机制.
1 材料与方法
1.1 材料 SNU-601/WT胃癌细胞株和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞株由韩国朝鲜大学校耐药性细胞研究中心提供;TGF-β1为美国Biovi-sion公司产品，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)为美国JBI公司产品，MTT试剂为美国Sigma公司产品，p16，cyclin D1试剂均为Santa Cruz公司产品;ABC试剂盒为美国Zymed公司产品.
1.2 方法
1.2.1 胃癌细胞及耐药性胃癌细胞的培养 SNU-601/WT胃癌细胞株和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞株分别用含100mL/L FBS的RPMI1640培养液，在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中进行培养.
1.2.2 MTT法检测TGF-β1对SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生长的影响 取对数生长期细胞.将SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞分别接种于平底96孔板中，每孔细胞数为2×10 4 个，每次设空白对照组(调零)、对照组及实验组，每组分别设3个复孔，接种后培养24h，使细胞贴壁生长.向实验组各孔加入10μg/L TGF-β1，分别培养24，48，72，96h后，向每孔加入5g/L MTT试剂10μL，在二氧化碳培养箱中继续培养4h，弃去MTT液，加入150μL DMSO，振荡10min;对照组处理除未给予 TGF-β1外与实验组相同.用酶标仪在540nm波长 测定各组细胞吸光值，按下列公式计算细胞生长率:细胞生长率(%)=实验组吸光值对照组吸光值×100
1.2.3 免疫细胞化学染色 将1×10 3 个SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞接种于Chamber Slide(Nunc，Inc.2000North Aurora Road Naperville，SNA)，在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长.实验组细胞用10μg/L TGF-β1进行处理，对照组只加入培养液，分别培养24，48，72，96h后，弃去培养液，用PBS清洗，100g/L甲醛(pH值为7.0)固定10min，收集标本.免疫细胞化学染色根据ABC试剂盒说明书方法进行.结果判定蛋白表达强度根据阳性物质的着色即阳性细胞数的多少分为3级:每高倍视野阳性细胞数少于10%为阴性(-);阳性细胞数在10%～50%之间为阳性(+);阳性细胞数超过50%为强阳 性().
1.2.4 统计学处理 采用两样本率比较的卡方检验进行.
2 结果
2.1 TGF-β1对SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生长的影响 MTT法检测结果见Table1.由Table1可见，实验组SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生存率均具有时间依赖性，即随着作用时间的延长，生存率降低，但SNU-601/cis2细胞在72h时出现最低生存率，96h时有所增高.实验组SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生存率与对照组比较均有显著性差异(P<0.01);实验组SNU-601/cis2，SNU-601/WT细胞生存率之间相比较，在48，72h时具有显著性差异(P<0.01，P<0.05). Table1 Effect of TGF-β1in SNU-601/WT and SNU-601/cis2cell growth
2.2 TGF-β1对SNU-601/WT细胞p16，cyclin D1蛋白表达的影响 免疫组织化学染色结果示，对照组中p16蛋白表达在24，48，72，96h时均呈阴性(-)，在实验组中24h时呈阳性(+)，48，72，96h 时呈强阳性();提示TGF-β1可时间依赖性增强
SNU-601/WT细胞内p16蛋白的表达.对照组中cyclin D1蛋白的表达在24，48，72，96h时均呈强阳性()，在实验组中在24，48h时呈阳性(+)，72，96h时呈强阳性();提示TGF-β1对SNU-601/WT细胞内cyclin D1蛋白表达无明显影响(Fig1). 2.3 TGF-β1对SNU-601/cis2细胞p16，cyclin D1蛋白表达的影响 免疫组织化学染色结果示，对照组细胞p16蛋白的表达在24，48，72，96h中均呈阴性(-)，在实验组中各时间段均呈强阳性();提示TGF-β1明显增强SNU-601/cis2细胞内p16蛋白表达.对照组及实验组中cyclin D1蛋白的表达在各时间段均呈强阳性()，提示TGF-β1对SNU-601/cis2细胞内cyclin D1蛋白表达无明显影响
3 讨论
TGF-β1在包括人类的哺乳动物中已发现了 β1，β2，β3等3种类型，在人体中发现最多，而研究最集中的类型为β1.TGF-β1在细胞生长及分化过程中起调节作用，可抑制大部分上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞生长 [3～5] .本研究结果表明，TGF-β1可时间依赖性抑制胃癌细胞株和耐药性胃癌细胞株的生长，而对后者的抑制作用更强.此结果与Kim等 [6] 利用鼠白血病细胞株L1210和耐药性细胞株L1210AdR，L1210VcR，L1210cis研究的TGF-β1对细胞生长抑制作用的实验结果一致.p16基因是定位于染色体9q21的抑癌基因，在大部分原发癌中由于染色体缺失或点突变，使p16蛋白表达受抑制，导致癌症发生 [7，8] .p16蛋白属于细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI)，通过抑制cyclin D/CDK4复合体的活性，阻止pRb蛋白磷酸化，从而抑制细胞周期从G1到S期的转换 [9，10] .本研究用10μg/L TGF-β1处理胃癌细胞及耐药性胃癌细胞后，用免疫细胞化学方法检测了p16蛋白的表达，结果示SNU-601/WT胃癌细胞和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞内p16蛋白表达明显增强，并具有时间依赖性特点，提示TGF-β1可通过增强p16蛋白的表达来抑制SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞的生长.cyclin D1基因定位于常染色体11q13上，参与细胞生长过程中从G1到S期的转换，促进细胞分裂.cyclin D1与CDK4或CDK6形成复合体后被激活，促进pRb蛋白的磷酸化，使细胞进入S期 [11] ，通过基因扩增或过度表达来促进细胞增殖 [12] .本研究结果表明，TGF-β1对胃癌细胞株SNU-601/WT和耐药性胃癌细胞株SNU-601/cis2内cyclin D1蛋白表达无明显影响.综上所述，TGF-β1可抑制胃癌细胞株SNU-601/WT及耐药性胃癌细胞株SNU-601/cis2的生长，其作用机制可能与增强p16蛋白表达有关，而与cyclin D1蛋白无明显相关性.
[参 考 文 献]
[1] Tseng WF，Huang SS，Huang JS.LRP-1/TbetaR-Vmediates TGF-beta1-induced growth inhibition in CHO cells[J].FEBS Lett，2004，562(1-3):71.
[2] Derynck R，Akhurst RJ，Balmain A.TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression[J].Nat Genet，2001，29(2):117.
[3] Huang SS，Leal SM，Chen CL，et al..Cellular growth inhibition by TGF-beta1involves IRS proteins[J].FEBS Lett，2004，565(1-3):117.
[4] Heldin NE，Bergstrom D，Hermansson A，et al..Lackof responsiveness to TGF-beta1in a thyroid carcinoma cell line with functional typeⅠand typeⅡTGF-beta receptors and smad proteins，suggests a novel mechanism for TGF-beta insensitivity in carcinoma cells[J].MolCell Endocrinol，1999，153(1-2):79.
[5] Massague J，Blain SW，Lo RS.TGF beta signaling in growth control，cancer and heritable disorders[J].Cell，2000，103(2):295.
[6] Kim SY，Lee KS，Kim JR，et al..TGF-β1effect onsurvival of anticancer drug-resistant L1210sublines[J].J Korean Cancer Assoc，1998，30(5):1005.
[7] Musgrove EA，Lilischkis R，Cornish AL，et，al..Ex- pression of the cyclin-dependent kinase inhibitors p16INK4，p15INK4B and p21WAF1/CIP1in hu-man breast cancer[J].Int J Cancer，1995，63(4):584.
[8] Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feldhaus J，et al..A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science，1994，264(51):436.
[9] Schwarze SR，Shi Y，Fu VX，et al..Role of cyclin-de- pendent kinase inhibitors in the growth arrest at senes-cence in human prostate epithelial and uroepithelial cells[J].Oncogene，2001，20(57):8184.
[10] Sandhu C，Peehl DM，Slingerland J.p16INK4A mediates cyclin dependent kinase4and6inhibition in senescent prostatic epithelial cells[J].Cancer Res，2000，60(10):2616.
[11] Kang YK，Kim WH，Jang JJ.Expression of G1-S modulators(p53，p16，p27，cyclin D1，Rb)and Smad4/Dpc4in intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Hum Pathol，2002，33(9):877.
[12] Jong HS，Lee HS，Kim TY，et al..Attenuation oftransforming growth factor beta-induced growth inhibi-tion in human hepatocellular carcinoma cell lines by cy-clin D1overexpression[J].Biochem Biophys Res Com-mun，2002，292(2):383.
(1.延边大学基础医学院病理学教研室，吉林延吉133000;2.朝鲜大学校医科大学病理学教研室，韩国), http://www.100md.com(李柱虎 ，任香善 ，李美子)
[关键词] 胃肿瘤;耐药性;基因，p16
Effects of TGF-β1on gastric cancer and drug resistant cells line growth，p16and cyclin D1protein expression
LI Zhu-hu 1 ，REN Xiang-shan 1 ，LEE Mi-za 2
(1.Department of Pathology，Yanbian University College of Basic Medicine，Yanji133000，Jilin，China;2.Department of Pathology，Chosun University College of Medicine，Korea)
ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the effects of TGF-β1on the cell growth of gastric cancer cell line SNU-601/WT and drug resistant cell line SNU-601/cis2and the expression of p16and cyclin D1protein.METHODS SNU-601/WT and SNU-601/cis2cell lines were divided into the experimental and control groups.The effect of TGF-β1on survival rate of these cell lines were measured by MTT assay.The protein expression of p16and cyclin D1were detected by immunocytochemical staining.RESULTS In the experimental group，the growth rate of SNU-601/WT and SNU-601/cis2were decreased along with the time process.All were significantly different compared with the control group.In the mean while，the growth rate of drug resistant cell line was lower than that of the gastric cancer cell line at48and72h.TGF-β1was a time-dependent increase incells positive for p16expression in the experimental group.But，the expression of cyclin D1were without difference in the experimental group and control group.CONCLUSION TGF-β1can inhibit the growth of SNU-601/WT gastric cancer cell and SNU-601/cis2drug resistant cell，and increase p16protein expression，but has no significant influence cyclin D1protein expression.
Key words:stomach neoplasms;drug resistance;genes，p16
β转化生长因子(transforming growth factor-be-ta，TGF-β)是分子质量为25ku的蛋白质，对多种类型细胞生长具有抑制作用 [1，2] .本研究通过观察TGF-β1对胃癌细胞和耐药性胃癌细胞生长及p16，cyclin D1蛋白表达的影响，探讨了TGF-β1对胃癌细胞，尤其是耐药性胃癌细胞生长的影响及其机制.
1 材料与方法
1.1 材料 SNU-601/WT胃癌细胞株和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞株由韩国朝鲜大学校耐药性细胞研究中心提供;TGF-β1为美国Biovi-sion公司产品，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)为美国JBI公司产品，MTT试剂为美国Sigma公司产品，p16，cyclin D1试剂均为Santa Cruz公司产品;ABC试剂盒为美国Zymed公司产品.
1.2 方法
1.2.1 胃癌细胞及耐药性胃癌细胞的培养 SNU-601/WT胃癌细胞株和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞株分别用含100mL/L FBS的RPMI1640培养液，在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中进行培养.
1.2.2 MTT法检测TGF-β1对SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生长的影响 取对数生长期细胞.将SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞分别接种于平底96孔板中，每孔细胞数为2×10 4 个，每次设空白对照组(调零)、对照组及实验组，每组分别设3个复孔，接种后培养24h，使细胞贴壁生长.向实验组各孔加入10μg/L TGF-β1，分别培养24，48，72，96h后，向每孔加入5g/L MTT试剂10μL，在二氧化碳培养箱中继续培养4h，弃去MTT液，加入150μL DMSO，振荡10min;对照组处理除未给予 TGF-β1外与实验组相同.用酶标仪在540nm波长 测定各组细胞吸光值，按下列公式计算细胞生长率:细胞生长率(%)=实验组吸光值对照组吸光值×100
1.2.3 免疫细胞化学染色 将1×10 3 个SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞接种于Chamber Slide(Nunc，Inc.2000North Aurora Road Naperville，SNA)，在37℃，50mL/L二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长.实验组细胞用10μg/L TGF-β1进行处理，对照组只加入培养液，分别培养24，48，72，96h后，弃去培养液，用PBS清洗，100g/L甲醛(pH值为7.0)固定10min，收集标本.免疫细胞化学染色根据ABC试剂盒说明书方法进行.结果判定蛋白表达强度根据阳性物质的着色即阳性细胞数的多少分为3级:每高倍视野阳性细胞数少于10%为阴性(-);阳性细胞数在10%～50%之间为阳性(+);阳性细胞数超过50%为强阳 性().
1.2.4 统计学处理 采用两样本率比较的卡方检验进行.
2 结果
2.1 TGF-β1对SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生长的影响 MTT法检测结果见Table1.由Table1可见，实验组SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生存率均具有时间依赖性，即随着作用时间的延长，生存率降低，但SNU-601/cis2细胞在72h时出现最低生存率，96h时有所增高.实验组SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞生存率与对照组比较均有显著性差异(P<0.01);实验组SNU-601/cis2，SNU-601/WT细胞生存率之间相比较，在48，72h时具有显著性差异(P<0.01，P<0.05). Table1 Effect of TGF-β1in SNU-601/WT and SNU-601/cis2cell growth
2.2 TGF-β1对SNU-601/WT细胞p16，cyclin D1蛋白表达的影响 免疫组织化学染色结果示，对照组中p16蛋白表达在24，48，72，96h时均呈阴性(-)，在实验组中24h时呈阳性(+)，48，72，96h 时呈强阳性();提示TGF-β1可时间依赖性增强
SNU-601/WT细胞内p16蛋白的表达.对照组中cyclin D1蛋白的表达在24，48，72，96h时均呈强阳性()，在实验组中在24，48h时呈阳性(+)，72，96h时呈强阳性();提示TGF-β1对SNU-601/WT细胞内cyclin D1蛋白表达无明显影响(Fig1). 2.3 TGF-β1对SNU-601/cis2细胞p16，cyclin D1蛋白表达的影响 免疫组织化学染色结果示，对照组细胞p16蛋白的表达在24，48，72，96h中均呈阴性(-)，在实验组中各时间段均呈强阳性();提示TGF-β1明显增强SNU-601/cis2细胞内p16蛋白表达.对照组及实验组中cyclin D1蛋白的表达在各时间段均呈强阳性()，提示TGF-β1对SNU-601/cis2细胞内cyclin D1蛋白表达无明显影响
3 讨论
TGF-β1在包括人类的哺乳动物中已发现了 β1，β2，β3等3种类型，在人体中发现最多，而研究最集中的类型为β1.TGF-β1在细胞生长及分化过程中起调节作用，可抑制大部分上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞生长 [3～5] .本研究结果表明，TGF-β1可时间依赖性抑制胃癌细胞株和耐药性胃癌细胞株的生长，而对后者的抑制作用更强.此结果与Kim等 [6] 利用鼠白血病细胞株L1210和耐药性细胞株L1210AdR，L1210VcR，L1210cis研究的TGF-β1对细胞生长抑制作用的实验结果一致.p16基因是定位于染色体9q21的抑癌基因，在大部分原发癌中由于染色体缺失或点突变，使p16蛋白表达受抑制，导致癌症发生 [7，8] .p16蛋白属于细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI)，通过抑制cyclin D/CDK4复合体的活性，阻止pRb蛋白磷酸化，从而抑制细胞周期从G1到S期的转换 [9，10] .本研究用10μg/L TGF-β1处理胃癌细胞及耐药性胃癌细胞后，用免疫细胞化学方法检测了p16蛋白的表达，结果示SNU-601/WT胃癌细胞和SNU-601/cis2耐药性胃癌细胞内p16蛋白表达明显增强，并具有时间依赖性特点，提示TGF-β1可通过增强p16蛋白的表达来抑制SNU-601/WT，SNU-601/cis2细胞的生长.cyclin D1基因定位于常染色体11q13上，参与细胞生长过程中从G1到S期的转换，促进细胞分裂.cyclin D1与CDK4或CDK6形成复合体后被激活，促进pRb蛋白的磷酸化，使细胞进入S期 [11] ，通过基因扩增或过度表达来促进细胞增殖 [12] .本研究结果表明，TGF-β1对胃癌细胞株SNU-601/WT和耐药性胃癌细胞株SNU-601/cis2内cyclin D1蛋白表达无明显影响.综上所述，TGF-β1可抑制胃癌细胞株SNU-601/WT及耐药性胃癌细胞株SNU-601/cis2的生长，其作用机制可能与增强p16蛋白表达有关，而与cyclin D1蛋白无明显相关性.
[参 考 文 献]
[1] Tseng WF，Huang SS，Huang JS.LRP-1/TbetaR-Vmediates TGF-beta1-induced growth inhibition in CHO cells[J].FEBS Lett，2004，562(1-3):71.
[2] Derynck R，Akhurst RJ，Balmain A.TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression[J].Nat Genet，2001，29(2):117.
[3] Huang SS，Leal SM，Chen CL，et al..Cellular growth inhibition by TGF-beta1involves IRS proteins[J].FEBS Lett，2004，565(1-3):117.
[4] Heldin NE，Bergstrom D，Hermansson A，et al..Lackof responsiveness to TGF-beta1in a thyroid carcinoma cell line with functional typeⅠand typeⅡTGF-beta receptors and smad proteins，suggests a novel mechanism for TGF-beta insensitivity in carcinoma cells[J].MolCell Endocrinol，1999，153(1-2):79.
[5] Massague J，Blain SW，Lo RS.TGF beta signaling in growth control，cancer and heritable disorders[J].Cell，2000，103(2):295.
[6] Kim SY，Lee KS，Kim JR，et al..TGF-β1effect onsurvival of anticancer drug-resistant L1210sublines[J].J Korean Cancer Assoc，1998，30(5):1005.
[7] Musgrove EA，Lilischkis R，Cornish AL，et，al..Ex- pression of the cyclin-dependent kinase inhibitors p16INK4，p15INK4B and p21WAF1/CIP1in hu-man breast cancer[J].Int J Cancer，1995，63(4):584.
[8] Kamb A，Gruis NA，Weaver-Feldhaus J，et al..A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science，1994，264(51):436.
[9] Schwarze SR，Shi Y，Fu VX，et al..Role of cyclin-de- pendent kinase inhibitors in the growth arrest at senes-cence in human prostate epithelial and uroepithelial cells[J].Oncogene，2001，20(57):8184.
[10] Sandhu C，Peehl DM，Slingerland J.p16INK4A mediates cyclin dependent kinase4and6inhibition in senescent prostatic epithelial cells[J].Cancer Res，2000，60(10):2616.
[11] Kang YK，Kim WH，Jang JJ.Expression of G1-S modulators(p53，p16，p27，cyclin D1，Rb)and Smad4/Dpc4in intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Hum Pathol，2002，33(9):877.
[12] Jong HS，Lee HS，Kim TY，et al..Attenuation oftransforming growth factor beta-induced growth inhibi-tion in human hepatocellular carcinoma cell lines by cy-clin D1overexpression[J].Biochem Biophys Res Com-mun，2002，292(2):383.
(1.延边大学基础医学院病理学教研室，吉林延吉133000;2.朝鲜大学校医科大学病理学教研室，韩国), http://www.100md.com(李柱虎 ，任香善 ，李美子)