龙葵多糖含量测定及组分分析
1 引言
龙葵(Solanum nigrum L.)属茄科植物，其性寒味苦，具有清热解毒，活血消肿，治疗疮、痈、肿、跌打损伤，龙葵全草在治疗子宫绒毛膜癌、卵巢癌和肝癌等效果显著。多年来工作者从脂溶性成分中分离出龙葵碱，并且从水溶性成分中分离出两种龙葵多糖。本实验主要研究龙葵多糖含量测定及其组分的分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂 高效毛细管电泳仪(美国贝克曼公司);721型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。龙葵多糖(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心提供)、葡萄糖、苯酚、无水甲醇、三氯甲烷、硼砂、α萘胺、硼氢化氰钠、冰乙酸、L鼠李糖、D半乳糖、D木糖、D阿拉伯糖、D葡萄糖、D甘露糖(以上试剂均为分析纯)，实验用水为去离子水。
2.2 实验方法 (1)多糖含量测定 多糖含量测定使用苯酚硫酸法，精密称取龙葵粗多糖及精制品各0.2 g，用蒸馏水定容到250 mL容量瓶中，摇匀得样品液。吸取待测样品液2.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，再垂直快速加入浓H2SO4 50 mL，摇匀，放置5 min，沸水浴15 min，取出，流水迅速冷至室温，于490 nm波长处测吸光度。样品平行测3次。(2) 电泳条件 缓冲液：75 mmol/L硼砂溶液(pH 10.5)。柱温：25℃。柱压：20 kV。检测波长：240 nm。清洗液：0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L HCl，去离子水。(3) 衍生剂的配制 称取α萘胺143.2 mg和硼氢化氰钠35 mg，溶于450 μL无水甲醇中，再加入41 μL冰乙酸，置于冰箱中待用。(4)单糖的α萘胺衍生化 用双蒸水配成浓度为20 g/L的各种单糖标准溶液，各取200 μL，加入40 μL衍生试剂置于试管中封管，80℃恒温4h衍生化，然后各加入三氯甲烷和双蒸水1 mL，反复离心萃取3次，取上层水相过滤后定容至5 mL，冷藏待测。(5) 多糖水解样品的配制 以2 mol/L H2SO4 2 mL溶解10 mg样品，封管，100℃水解6 h，冷却，离心取上清液，NaOH中和，离心取上清液200 μL，同上述方法衍生化。(6)标准品及样品的测定 将衍生化的标准品及样品试液经微孔滤膜过滤，进行毛细管电泳。分别平行做3份。根据各吸收峰的峰面积来计算各单糖组成的相对比例。
3 结果与讨论
3.1 多糖含量测定 标准葡萄糖绘制标准曲线得回归方程: y=0.008x-0.0313(r=0.9984)。并测定换算因子f=19725，由公式：多糖含量(%)=100CDf/W计算得出。其中， C为样品液的葡萄糖浓度(g/L)，D为样品的稀释因素，f为换算因子，W为样品的重量(mg)计算得出龙葵粗多糖含量为36.25%，纯化多糖含量为65.28%。本方法的稳定性好(RSD=1.6%。)、测量精密度高(RSD=0.1%)。
3.2 标准单糖及多糖样品分析 将6种单糖混合，作出标准单糖电泳谱图。其迁移时间依次为L鼠李糖(19.8 min)、D木糖(23.6 min)、D葡萄糖(27.5 min)、D甘露糖(28.2 min)、 D阿拉伯糖(29.0 min)、D半乳糖(35.6 min)。将龙葵多糖作出的谱图与标准混合单糖的谱图对照，可以确定龙葵多糖由D半乳糖、L鼠李糖、D阿拉伯糖、D木糖、D葡萄糖和D甘露糖组成，其含量百分比分别为29.3%、10.7%、17.1%、9.5%、4.2%和29.2%。
3.3 结论 HPCE对于检测多糖中单糖有较好的分离效果，但前处理及电泳条件尤为重要。单糖的紫外吸收很弱，用α萘胺衍生后可使单糖的还原端接上很强的紫外吸收基团，但单糖的α萘胺衍生物在水溶液中仍然不带电荷，不能实现电泳分离，采用以硼砂为介质的电泳体系，硼砂可与糖基上相邻的二羟基络合，形成糖硼酸根阴离子，不同糖基上羟基取向不同以及分子量的差异，使其络合物具有不同的淌度，从而达到有效分离。分光光度法测定龙葵粗多糖含量为3915%，精制后多糖含量为65.28%，高效毛细管电泳分析证明龙葵多糖由鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖组成。并且该方法具有简便、灵敏、干扰少的特点，是理想的多糖组分分析方法。
本文系国家自然基金资助项目(No.30400591)
(哈尔滨商业大学,生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨 150076), 百拇医药(季宇彬 王帅帅 汲晨锋)
龙葵(Solanum nigrum L.)属茄科植物，其性寒味苦，具有清热解毒，活血消肿，治疗疮、痈、肿、跌打损伤，龙葵全草在治疗子宫绒毛膜癌、卵巢癌和肝癌等效果显著。多年来工作者从脂溶性成分中分离出龙葵碱，并且从水溶性成分中分离出两种龙葵多糖。本实验主要研究龙葵多糖含量测定及其组分的分析。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂 高效毛细管电泳仪(美国贝克曼公司);721型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。龙葵多糖(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心提供)、葡萄糖、苯酚、无水甲醇、三氯甲烷、硼砂、α萘胺、硼氢化氰钠、冰乙酸、L鼠李糖、D半乳糖、D木糖、D阿拉伯糖、D葡萄糖、D甘露糖(以上试剂均为分析纯)，实验用水为去离子水。
2.2 实验方法 (1)多糖含量测定 多糖含量测定使用苯酚硫酸法，精密称取龙葵粗多糖及精制品各0.2 g，用蒸馏水定容到250 mL容量瓶中，摇匀得样品液。吸取待测样品液2.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，再垂直快速加入浓H2SO4 50 mL，摇匀，放置5 min，沸水浴15 min，取出，流水迅速冷至室温，于490 nm波长处测吸光度。样品平行测3次。(2) 电泳条件 缓冲液：75 mmol/L硼砂溶液(pH 10.5)。柱温：25℃。柱压：20 kV。检测波长：240 nm。清洗液：0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L HCl，去离子水。(3) 衍生剂的配制 称取α萘胺143.2 mg和硼氢化氰钠35 mg，溶于450 μL无水甲醇中，再加入41 μL冰乙酸，置于冰箱中待用。(4)单糖的α萘胺衍生化 用双蒸水配成浓度为20 g/L的各种单糖标准溶液，各取200 μL，加入40 μL衍生试剂置于试管中封管，80℃恒温4h衍生化，然后各加入三氯甲烷和双蒸水1 mL，反复离心萃取3次，取上层水相过滤后定容至5 mL，冷藏待测。(5) 多糖水解样品的配制 以2 mol/L H2SO4 2 mL溶解10 mg样品，封管，100℃水解6 h，冷却，离心取上清液，NaOH中和，离心取上清液200 μL，同上述方法衍生化。(6)标准品及样品的测定 将衍生化的标准品及样品试液经微孔滤膜过滤，进行毛细管电泳。分别平行做3份。根据各吸收峰的峰面积来计算各单糖组成的相对比例。
3 结果与讨论
3.1 多糖含量测定 标准葡萄糖绘制标准曲线得回归方程: y=0.008x-0.0313(r=0.9984)。并测定换算因子f=19725，由公式：多糖含量(%)=100CDf/W计算得出。其中， C为样品液的葡萄糖浓度(g/L)，D为样品的稀释因素，f为换算因子，W为样品的重量(mg)计算得出龙葵粗多糖含量为36.25%，纯化多糖含量为65.28%。本方法的稳定性好(RSD=1.6%。)、测量精密度高(RSD=0.1%)。
3.2 标准单糖及多糖样品分析 将6种单糖混合，作出标准单糖电泳谱图。其迁移时间依次为L鼠李糖(19.8 min)、D木糖(23.6 min)、D葡萄糖(27.5 min)、D甘露糖(28.2 min)、 D阿拉伯糖(29.0 min)、D半乳糖(35.6 min)。将龙葵多糖作出的谱图与标准混合单糖的谱图对照，可以确定龙葵多糖由D半乳糖、L鼠李糖、D阿拉伯糖、D木糖、D葡萄糖和D甘露糖组成，其含量百分比分别为29.3%、10.7%、17.1%、9.5%、4.2%和29.2%。
3.3 结论 HPCE对于检测多糖中单糖有较好的分离效果，但前处理及电泳条件尤为重要。单糖的紫外吸收很弱，用α萘胺衍生后可使单糖的还原端接上很强的紫外吸收基团，但单糖的α萘胺衍生物在水溶液中仍然不带电荷，不能实现电泳分离，采用以硼砂为介质的电泳体系，硼砂可与糖基上相邻的二羟基络合，形成糖硼酸根阴离子，不同糖基上羟基取向不同以及分子量的差异，使其络合物具有不同的淌度，从而达到有效分离。分光光度法测定龙葵粗多糖含量为3915%，精制后多糖含量为65.28%，高效毛细管电泳分析证明龙葵多糖由鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖组成。并且该方法具有简便、灵敏、干扰少的特点，是理想的多糖组分分析方法。
本文系国家自然基金资助项目(No.30400591)
(哈尔滨商业大学,生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨 150076), 百拇医药(季宇彬 王帅帅 汲晨锋)
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