川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及Bcl2和Bax表达的影响
WANG HanMin1,2, WU XiongFei1, TAN Hua2, CHEN GuangLei2, LI Feng3
1Department of Nephrology, Xinan Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China, 2Department of Nephrology, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of ligustrazine on cell apoptosis and expressions of Bcl2 and Bax in rat kidneys with acute ischemiareperfusion(I/R) injury, and study the possible mechanism of renal protection affected by ligustrazine against acute I/R injury. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I/R model(n=10), intraperitoneal ligustrazine 32 mg/kg every 6 h after reperfusion for 30 min(n=10) and intraperitoneal ligustrazine 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia(n=10). The models were established through clamping bilateral renal arteries for 45 min and then reperfusing for 24 h. Cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax protein were measured by immunohistochemical technique and the kidney ultrastrucutre was observed by electron microscope. RESULTS: Compared with those in the control group, the cell apoptotic index(1.9±0.5 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax(162.6±17.1 vs 182.7±12.8, P<0.01) were significantly increased, and the Bcl2/Bax ratio (1.1±0.1 vs 1.0±0.1, P<0.01) was decreased significantly in I/R model group. By ligustrazine pretreatment, the apoptotic index(28.8±4.6 vs 13.6±2.9, P<0.05) and the expression of Bax were decreased significantly(179.1±12.7 vs 162.6±17.1, P<0.05), the expression of Bcl2(166.6±15.1 vs 178.7±13.0, P<0.05) and the Bcl2/Bax ratio(0.9±0.1 vs 1.1±0.1, P<0.05) were increased significantly. CONCLUSION: Ligustrazine can protect kidney from acute I/R injury, partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.
【Keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; genes, Bcl2; genes, Bax
【摘要】 目的： 观察川芎嗪对急性缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响，探讨川芎嗪对急性肾I/R损伤保护作用的可能机制. 方法： 将40只Wistar大鼠夹闭双侧肾动脉45 min再灌注24 h，制备成急性肾I/R损伤动物模型，随机分为假手术对照组、I/R组、川芎嗪治疗组和川芎嗪预防组，采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数，免疫组化法测定Bcl2，Bax表达，电镜观察肾组织细胞超微结构. 结果： I/R组较假手术对照组肾小管细胞凋亡指数明显增多(28.8±4.6 vs 1.9±0.5, P<0.01)，Bax表达显著增强(162.6±17.1 vs 182.7±12.8, P<0.01)，Bcl2/Bax显著降低(1.1±0.1 vs 1.0±0.1, P<0.01)；川芎嗪预防组较I/R组肾小管凋亡细胞数明显减少(13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.05)，Bax表达明显减弱(179.1±12.7 vs 162.6±17.1, P<0.05)，Bcl2表达明显增强(166.6±15.1 vs 178.7±13.0, P<0.05)，Bcl2/Bax显著增高(0.9±0.1 vs 1.1±0.1, P<0.05). 结论： 川芎嗪对急性肾I/R损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过调节凋亡相关基因Bcl2和Bax介导的I/R损伤肾脏细胞凋亡而实现.
【关键词】 川芎嗪；肾；再灌注损伤；细胞凋亡；基因，Bcl2；基因，Bax
急性肾脏缺血再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的临床病理生理现象，可以导致急性肾衰竭(ARF)和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞. 研究[1]表明，急性肾I/R损伤后肾小管细胞除发生坏死外，细胞凋亡也是其重要的死亡形式. 细胞凋亡受多种因素调控，Bcl2家族是一组凋亡相关基因，对细胞凋亡起着重要的调控作用[2]. 川芎嗪(四甲基吡嗪)对I/R损伤的肾脏保护作用已被实验证实[3-4]，这种保护作用是否通过影响肾脏的细胞凋亡及凋亡相关基因而实现尚不清楚，我们旨在观察川芎嗪对急性I/R大鼠肾小管细胞凋亡与凋亡相关基因Bcl2和Bax的影响，探讨川芎嗪对缺血性急性肾损伤的保护作用机制.
1材料和方法
1.1材料Bcl2, Bax mAb, 免疫组化试剂盒, DAB显色试剂盒、原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；川芎嗪注射液(无锡第七制药厂，批号02081911). 健康成年Wistar大鼠40只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄不拘，体质量200~240 g. 日立7179全自动生化分析仪，HPIAS1000图像分析系统，JEM100SX型透射电镜等.
1.2方法
1.2.1动物模型复制将动物随机分为4组，每组10只. 即假手术对照组、缺血再灌注(I/R)组、I/R+川芎嗪治疗(I/R+T)组(再灌注30 min后腹腔注射川芎嗪32 mg/kg，每6 h注射1次，共4次)和I/R+川芎嗪预防(I/R+P)组(于缺血前24, 16, 8 h和45 min腹腔注射川芎嗪32 mg/kg，术后不再注射). 用30 g/L戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉，阻断45 min后松开动脉夹，肉眼可见肾脏由暗红变为鲜红，表明灌注成功，缝合切口，自由摄取水和食物. 假手术对照组仅游离双侧肾脏，暴露60 min后再关闭切口. 24 h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，活体摘取左肾并采血，血标本以4000 r/min离心10 min，分离血清，置-20℃保存用于测定肌酐和尿素氮. 肾组织用40 g/L甲醛固定做原位凋亡及免疫组化检测，另取部分肾组织用30 mL/L戊二醛固定做电镜观察.
1.2.2肾功能指标用生化分析仪测定各组血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)含量.
1.2.3肾小管上皮细胞凋亡检测采用TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡指数(AI). 肾组织切片常规脱蜡入水，经30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，蛋白酶K消化，加入TdT和DigdUTP, 37℃标记2 h，加生物素化地高辛抗体封闭洗涤，加SABC, DAB显色，光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 于阳性表达分布区域在光镜200倍下随机选择5个无重叠视野，计数阳性细胞，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞AI.
1.2.4肾组织Bcl2, Bax免疫组织化学检测及半定量分析切片常规脱蜡入水，3 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，微波进行抗原修复，加兔抗鼠Bcl2抗体(1∶100稀释)、Bax抗体(1∶150稀释)4℃过夜，次日依次滴加羊抗兔IgG二抗和SABC，最后在显微镜下用DAB显色. 同时采用删除第一抗体的方法作为阴性对照. 胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞，每张切片于阳性表达区域选取5个低倍无重叠视野，应用图像分析系统计算吸光度(A)值并以此作为半定量参数反映Bcl2, Bax表达. A值越小，表示阳性产物Bcl2, Bax蛋白表达越多；Bcl2/Bax 的A值越高，表示Bcl2/Bax越低.
1.2.5电镜观察楔形切除左肾腹面半个肾组织的下极约3 mm厚肾组织，置于30 mL/L戊二醛磷酸盐缓冲液中固定24 h (4℃)，再以10 g/L锇酸固定1.5 h，常规脱水、包埋，制备透射电镜切片，在电镜下观察肾组织的超微结构.
统计学处理： 计量资料用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，两组比较用t检验，多组间比较用方差分析. P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著.
2结果
2.1各组肾功能的变化与假手术对照组比较，I/R组血BUN, Cr水平显著增高(P<0.05，表1). 与I/R组比较,I/R+T组血BUN, Cr水平轻度下降，但无统计学差异(P>0.05)，I/R+P组血BUN，Cr水平较I/R+T组显著下降(P<0.05).表1各组血清尿素氮及肌酐水平的比较
2.2肾小管上皮细胞AI的变化假手术对照组少见凋亡细胞；I/R组凋亡细胞明显增多，多数是远端小管细胞，少数在近曲小管，肾小球未见凋亡细胞；I/R+T组细胞AI较I/R组无显著差异(P>0.05)；I/R+P组细胞AI较I/R, I/R+T组显著减少(P均<0.05，表2).表2各组肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)及Bcl2, Bax和Bcl2/Bax的A值比较
2.3Bcl2, Bax蛋白表达的变化与假手术对照组比较，I/R组Bax表达显著增强(P<0.01)，Bcl2表达略增强(P<0.05)，Bcl2/Bax比值显著下降(P<0.01)；I/R+T组Bcl2, Bax表达及Bcl2/Bax比值较I/R组无显著差异(P>0.05)；I/R+P组较I/R组Bcl2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl2/Bax比值升高(P<0.05)；I/R+P组较I/R+T组差异显著(P<0.05，表2).
2.4肾组织超微结构的变化假手术对照组肾组织超微结构未见明显异常(图1A)；I/R组可见部分肾小管上皮细胞有凋亡形态特征变化，即核染色质致密，成团块状附在内核膜上，出现染色质边集(图1B)，小管上皮细胞空泡变性、内质网扩张. I/R+T组肾小管细胞超微结构损伤与I/R组相近. I/R+P组肾小管上皮细胞超微结构损伤程度较I/R和I/R+T组明显减轻：表现为肾小管上皮细胞大部分结构正常或基本正常，内质网无扩张，无空泡形成，核膜完整. 肾小球结构基本正常.
3讨论
肾脏急性I/R损伤可以导致ARF或使移植肾功能丧失. 研究[5-6]证实缺血性ARF时存在肾小管上皮细胞凋亡. 细胞凋亡也是缺血性ARF细胞死亡的重要形式. 我们的实验证实了以往的观察结果： I/R损伤组肾功能损伤明显，凋亡细胞数量增多，提示细胞凋亡是缺血性ARF的重要因素之一，肾小管上皮凋亡细胞数与肾功能损伤程度密切相关.
细胞凋亡是细胞的另一种死亡形式，Bcl2作为一种广义的抑制凋亡基因，其功能主要是抑制细胞凋亡、促进细胞生存. 它通过羧基端的信号锚定序列跨线粒体膜而发挥作用，在线粒体上可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性，以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡[7]. Bax基因亦为Bcl2家族成员，结构与Bcl2有21%的相似性，其作用则与Bcl2相反，活化的Bax可使线粒体和脂质体通透性增加，启动凋亡信号，具有促凋亡作用. 而Bcl2可抑制Bax的活化，从而抑制细胞凋亡[8]. Bcl2/Bax比值是决定细胞命运的一个关键因素，Bcl2/Bax的比值增加，细胞趋于存活；比值下降，细胞趋于凋亡. 本实验结果表明，肾脏I/R 24 h 时，Bcl2, Bax蛋白表达均增强，Bcl2/Bax比值下降，提示Bcl2和Bax确实参与了I/R时肾小管上皮细胞凋亡的调控.
川芎嗪是从川芎中分离提纯的一种生物碱单体，研究[3-4,9]证实其对I/R损伤的肾脏有明显的保护作用. 川芎嗪具有钙通道阻滞作用及抗缺血、缺氧、清除氧自由基、保护肾脏细胞的功能[3,10]. 我们的实验结果显示，肾I/R前注射川芎嗪具有肾脏保护作用，表现在川芎嗪预防组肾功能明显好转，电镜观察肾脏上皮细胞超微结构明显改善. 我们推测： 预防性使用川芎嗪能在肾脏缺血期及再灌注早期对抗细胞损伤因子，增加线粒体膜的稳定性，从而保护肾脏细胞，而再灌注30 mim后给药则难以在短期内缓解细胞已遭受的严重损伤. 我们的研究结果还显示，预防性使用川芎嗪能使肾脏I/R过程中细胞AI下降，Bcl2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减弱，Bcl2/Bax比值增高. 表明川芎嗪能抑制急性肾I/R过程中肾小管上皮细胞凋亡的发生，且川芎嗪的肾脏保护作用与抑制Bcl2/Bax介导的肾小管上皮细胞凋亡密切相关，提示在肾脏I/R损伤中细胞凋亡是可以预防的.
我们的研究可得出如下初步结论：急性肾I/R损伤时肾小管上皮细胞凋亡数增多，Bcl2, Bax蛋白表达增强，Bcl2/Bax比值下降，肾功能恶化. 预防性使用川芎嗪能明显改善肾功能，减少肾小管上皮细胞凋亡，并下调Bax 蛋白表达，增强Bcl2蛋白表达，使Bcl2/Bax比值增高. 由此推断，川芎嗪对I/R肾脏的保护作用可能部分是通过调节Bcl2和Bax介导的肾脏细胞凋亡而实现的.
致谢此研究中动物实验得到第四军医大学生理学教研室王跃民高级实验师的指导；数据处理得到卫生统计学教研室刘亚玲博士的帮助，特此致谢.
【参考文献】
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[2] Devarajan P, Mishra J, Supavekin S, et al. Gene expression in early ischemic renal injury: clues towards pathogenesis, biomarker discovery, and novel therapeutics[J]. Mol Gene Metab, 2003,80(4):365-376.
[3] 孙立江，李玉军，石景森. 川芎嗪对缺血再灌注损伤肾脏细胞凋亡的影响[J]. 第四军医大学学报，2002,23(18):1683-1685.
[4] Feng L, Xiong Y, Cheng F, et al. Effect of ligustrazine on ischemiareperfusion injury in murine kidney[J]. Transplant Proc, 2004,36(7):1949-1951.
[5] Saikumar P, Venkatachalam MA. Role of apoptosis in hypoxic/ischemic damage in the kidney[J]. Semin Nephrol, 2003,23(6):511-521.
[6] 谭华，王汉民，潘龙，等. 缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡的影响[J]. 第四军医大学学报，2004,25(9):818-821.
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[9] 王忠，翁国星，杜建. 川芎嗪对缺血再灌注肾保护作用的研究[J]. 福建中医学院学报，2005,15(2):26-27.
[10] Sun L, Li Y, Shi L, et al. Protective effects of ligustrazine on ischemiareperfusion injury in rat kidneys[J]. Microsurgery, 2002,22(8):343-346.
(1第三军医大学西南医院肾科，重庆 400038，第四军医大学西京医院： 2肾内科， 3中医科，陕西 西安 710033)
编辑王睿, 百拇医药(王汉民，吴雄飞，谭华，陈光磊，李锋)
1Department of Nephrology, Xinan Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China, 2Department of Nephrology, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of ligustrazine on cell apoptosis and expressions of Bcl2 and Bax in rat kidneys with acute ischemiareperfusion(I/R) injury, and study the possible mechanism of renal protection affected by ligustrazine against acute I/R injury. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I/R model(n=10), intraperitoneal ligustrazine 32 mg/kg every 6 h after reperfusion for 30 min(n=10) and intraperitoneal ligustrazine 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia(n=10). The models were established through clamping bilateral renal arteries for 45 min and then reperfusing for 24 h. Cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax protein were measured by immunohistochemical technique and the kidney ultrastrucutre was observed by electron microscope. RESULTS: Compared with those in the control group, the cell apoptotic index(1.9±0.5 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax(162.6±17.1 vs 182.7±12.8, P<0.01) were significantly increased, and the Bcl2/Bax ratio (1.1±0.1 vs 1.0±0.1, P<0.01) was decreased significantly in I/R model group. By ligustrazine pretreatment, the apoptotic index(28.8±4.6 vs 13.6±2.9, P<0.05) and the expression of Bax were decreased significantly(179.1±12.7 vs 162.6±17.1, P<0.05), the expression of Bcl2(166.6±15.1 vs 178.7±13.0, P<0.05) and the Bcl2/Bax ratio(0.9±0.1 vs 1.1±0.1, P<0.05) were increased significantly. CONCLUSION: Ligustrazine can protect kidney from acute I/R injury, partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.
【Keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; genes, Bcl2; genes, Bax
【摘要】 目的： 观察川芎嗪对急性缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响，探讨川芎嗪对急性肾I/R损伤保护作用的可能机制. 方法： 将40只Wistar大鼠夹闭双侧肾动脉45 min再灌注24 h，制备成急性肾I/R损伤动物模型，随机分为假手术对照组、I/R组、川芎嗪治疗组和川芎嗪预防组，采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数，免疫组化法测定Bcl2，Bax表达，电镜观察肾组织细胞超微结构. 结果： I/R组较假手术对照组肾小管细胞凋亡指数明显增多(28.8±4.6 vs 1.9±0.5, P<0.01)，Bax表达显著增强(162.6±17.1 vs 182.7±12.8, P<0.01)，Bcl2/Bax显著降低(1.1±0.1 vs 1.0±0.1, P<0.01)；川芎嗪预防组较I/R组肾小管凋亡细胞数明显减少(13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.05)，Bax表达明显减弱(179.1±12.7 vs 162.6±17.1, P<0.05)，Bcl2表达明显增强(166.6±15.1 vs 178.7±13.0, P<0.05)，Bcl2/Bax显著增高(0.9±0.1 vs 1.1±0.1, P<0.05). 结论： 川芎嗪对急性肾I/R损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过调节凋亡相关基因Bcl2和Bax介导的I/R损伤肾脏细胞凋亡而实现.
【关键词】 川芎嗪；肾；再灌注损伤；细胞凋亡；基因，Bcl2；基因，Bax
急性肾脏缺血再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的临床病理生理现象，可以导致急性肾衰竭(ARF)和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞. 研究[1]表明，急性肾I/R损伤后肾小管细胞除发生坏死外，细胞凋亡也是其重要的死亡形式. 细胞凋亡受多种因素调控，Bcl2家族是一组凋亡相关基因，对细胞凋亡起着重要的调控作用[2]. 川芎嗪(四甲基吡嗪)对I/R损伤的肾脏保护作用已被实验证实[3-4]，这种保护作用是否通过影响肾脏的细胞凋亡及凋亡相关基因而实现尚不清楚，我们旨在观察川芎嗪对急性I/R大鼠肾小管细胞凋亡与凋亡相关基因Bcl2和Bax的影响，探讨川芎嗪对缺血性急性肾损伤的保护作用机制.
1材料和方法
1.1材料Bcl2, Bax mAb, 免疫组化试剂盒, DAB显色试剂盒、原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；川芎嗪注射液(无锡第七制药厂，批号02081911). 健康成年Wistar大鼠40只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄不拘，体质量200~240 g. 日立7179全自动生化分析仪，HPIAS1000图像分析系统，JEM100SX型透射电镜等.
1.2方法
1.2.1动物模型复制将动物随机分为4组，每组10只. 即假手术对照组、缺血再灌注(I/R)组、I/R+川芎嗪治疗(I/R+T)组(再灌注30 min后腹腔注射川芎嗪32 mg/kg，每6 h注射1次，共4次)和I/R+川芎嗪预防(I/R+P)组(于缺血前24, 16, 8 h和45 min腹腔注射川芎嗪32 mg/kg，术后不再注射). 用30 g/L戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉，阻断45 min后松开动脉夹，肉眼可见肾脏由暗红变为鲜红，表明灌注成功，缝合切口，自由摄取水和食物. 假手术对照组仅游离双侧肾脏，暴露60 min后再关闭切口. 24 h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，活体摘取左肾并采血，血标本以4000 r/min离心10 min，分离血清，置-20℃保存用于测定肌酐和尿素氮. 肾组织用40 g/L甲醛固定做原位凋亡及免疫组化检测，另取部分肾组织用30 mL/L戊二醛固定做电镜观察.
1.2.2肾功能指标用生化分析仪测定各组血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)含量.
1.2.3肾小管上皮细胞凋亡检测采用TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡指数(AI). 肾组织切片常规脱蜡入水，经30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，蛋白酶K消化，加入TdT和DigdUTP, 37℃标记2 h，加生物素化地高辛抗体封闭洗涤，加SABC, DAB显色，光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 于阳性表达分布区域在光镜200倍下随机选择5个无重叠视野，计数阳性细胞，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞AI.
1.2.4肾组织Bcl2, Bax免疫组织化学检测及半定量分析切片常规脱蜡入水，3 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化酶，微波进行抗原修复，加兔抗鼠Bcl2抗体(1∶100稀释)、Bax抗体(1∶150稀释)4℃过夜，次日依次滴加羊抗兔IgG二抗和SABC，最后在显微镜下用DAB显色. 同时采用删除第一抗体的方法作为阴性对照. 胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞，每张切片于阳性表达区域选取5个低倍无重叠视野，应用图像分析系统计算吸光度(A)值并以此作为半定量参数反映Bcl2, Bax表达. A值越小，表示阳性产物Bcl2, Bax蛋白表达越多；Bcl2/Bax 的A值越高，表示Bcl2/Bax越低.
1.2.5电镜观察楔形切除左肾腹面半个肾组织的下极约3 mm厚肾组织，置于30 mL/L戊二醛磷酸盐缓冲液中固定24 h (4℃)，再以10 g/L锇酸固定1.5 h，常规脱水、包埋，制备透射电镜切片，在电镜下观察肾组织的超微结构.
统计学处理： 计量资料用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，两组比较用t检验，多组间比较用方差分析. P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著.
2结果
2.1各组肾功能的变化与假手术对照组比较，I/R组血BUN, Cr水平显著增高(P<0.05，表1). 与I/R组比较,I/R+T组血BUN, Cr水平轻度下降，但无统计学差异(P>0.05)，I/R+P组血BUN，Cr水平较I/R+T组显著下降(P<0.05).表1各组血清尿素氮及肌酐水平的比较
2.2肾小管上皮细胞AI的变化假手术对照组少见凋亡细胞；I/R组凋亡细胞明显增多，多数是远端小管细胞，少数在近曲小管，肾小球未见凋亡细胞；I/R+T组细胞AI较I/R组无显著差异(P>0.05)；I/R+P组细胞AI较I/R, I/R+T组显著减少(P均<0.05，表2).表2各组肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)及Bcl2, Bax和Bcl2/Bax的A值比较
2.3Bcl2, Bax蛋白表达的变化与假手术对照组比较，I/R组Bax表达显著增强(P<0.01)，Bcl2表达略增强(P<0.05)，Bcl2/Bax比值显著下降(P<0.01)；I/R+T组Bcl2, Bax表达及Bcl2/Bax比值较I/R组无显著差异(P>0.05)；I/R+P组较I/R组Bcl2表达显著增强(P<0.05)，Bax表达明显下降(P<0.05)，Bcl2/Bax比值升高(P<0.05)；I/R+P组较I/R+T组差异显著(P<0.05，表2).
2.4肾组织超微结构的变化假手术对照组肾组织超微结构未见明显异常(图1A)；I/R组可见部分肾小管上皮细胞有凋亡形态特征变化，即核染色质致密，成团块状附在内核膜上，出现染色质边集(图1B)，小管上皮细胞空泡变性、内质网扩张. I/R+T组肾小管细胞超微结构损伤与I/R组相近. I/R+P组肾小管上皮细胞超微结构损伤程度较I/R和I/R+T组明显减轻：表现为肾小管上皮细胞大部分结构正常或基本正常，内质网无扩张，无空泡形成，核膜完整. 肾小球结构基本正常.
3讨论
肾脏急性I/R损伤可以导致ARF或使移植肾功能丧失. 研究[5-6]证实缺血性ARF时存在肾小管上皮细胞凋亡. 细胞凋亡也是缺血性ARF细胞死亡的重要形式. 我们的实验证实了以往的观察结果： I/R损伤组肾功能损伤明显，凋亡细胞数量增多，提示细胞凋亡是缺血性ARF的重要因素之一，肾小管上皮凋亡细胞数与肾功能损伤程度密切相关.
细胞凋亡是细胞的另一种死亡形式，Bcl2作为一种广义的抑制凋亡基因，其功能主要是抑制细胞凋亡、促进细胞生存. 它通过羧基端的信号锚定序列跨线粒体膜而发挥作用，在线粒体上可直接调节膜上通透性转换孔来调节线粒体膜的通透性，以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡[7]. Bax基因亦为Bcl2家族成员，结构与Bcl2有21%的相似性，其作用则与Bcl2相反，活化的Bax可使线粒体和脂质体通透性增加，启动凋亡信号，具有促凋亡作用. 而Bcl2可抑制Bax的活化，从而抑制细胞凋亡[8]. Bcl2/Bax比值是决定细胞命运的一个关键因素，Bcl2/Bax的比值增加，细胞趋于存活；比值下降，细胞趋于凋亡. 本实验结果表明，肾脏I/R 24 h 时，Bcl2, Bax蛋白表达均增强，Bcl2/Bax比值下降，提示Bcl2和Bax确实参与了I/R时肾小管上皮细胞凋亡的调控.
川芎嗪是从川芎中分离提纯的一种生物碱单体，研究[3-4,9]证实其对I/R损伤的肾脏有明显的保护作用. 川芎嗪具有钙通道阻滞作用及抗缺血、缺氧、清除氧自由基、保护肾脏细胞的功能[3,10]. 我们的实验结果显示，肾I/R前注射川芎嗪具有肾脏保护作用，表现在川芎嗪预防组肾功能明显好转，电镜观察肾脏上皮细胞超微结构明显改善. 我们推测： 预防性使用川芎嗪能在肾脏缺血期及再灌注早期对抗细胞损伤因子，增加线粒体膜的稳定性，从而保护肾脏细胞，而再灌注30 mim后给药则难以在短期内缓解细胞已遭受的严重损伤. 我们的研究结果还显示，预防性使用川芎嗪能使肾脏I/R过程中细胞AI下降，Bcl2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减弱，Bcl2/Bax比值增高. 表明川芎嗪能抑制急性肾I/R过程中肾小管上皮细胞凋亡的发生，且川芎嗪的肾脏保护作用与抑制Bcl2/Bax介导的肾小管上皮细胞凋亡密切相关，提示在肾脏I/R损伤中细胞凋亡是可以预防的.
我们的研究可得出如下初步结论：急性肾I/R损伤时肾小管上皮细胞凋亡数增多，Bcl2, Bax蛋白表达增强，Bcl2/Bax比值下降，肾功能恶化. 预防性使用川芎嗪能明显改善肾功能，减少肾小管上皮细胞凋亡，并下调Bax 蛋白表达，增强Bcl2蛋白表达，使Bcl2/Bax比值增高. 由此推断，川芎嗪对I/R肾脏的保护作用可能部分是通过调节Bcl2和Bax介导的肾脏细胞凋亡而实现的.
致谢此研究中动物实验得到第四军医大学生理学教研室王跃民高级实验师的指导；数据处理得到卫生统计学教研室刘亚玲博士的帮助，特此致谢.
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(1第三军医大学西南医院肾科，重庆 400038，第四军医大学西京医院： 2肾内科， 3中医科，陕西 西安 710033)
编辑王睿, 百拇医药(王汉民，吴雄飞，谭华，陈光磊，李锋)