非手术切除原发性肝癌以造血干细胞为技术平台的免疫治疗
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参见附件(81kb)。
北京大学临床肿瘤学院内科 任 军
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一 ， 居全世界发病率第 5 位 ， 每年死亡人数 1000000 ， 在亚洲和中非地区发病率为 20 ～ 28/100000 人 ， 北欧、北美和澳大利亚为 < 5/100000 人。过去 20 年内，美国发病率由 1.4/100000 人上升到 2.4/100000 人 [1] 。 目前大部分进展期肝癌患者缺乏有效的治疗手段，总的生存率仅为 3 %～ 5 %。近年来随着对肿瘤生物学认识的逐步深入以及分子生物学和细胞生物学的迅速发展，为肝癌的综合治疗提供了许多新的手段，其中生物免疫治疗显示了令人感到鼓舞的前景。现将本课题组近年来在原发性肝癌的生物免疫治疗方面进行总结。
一、 细胞免疫治疗
(一)树突状细胞( Dendritic Cell ， DC )
本课题组以健康供者外周血单个核细胞( PBSC )为来源，在 GM-CSF 、 TNF-a 和 IL-4 作用下体外诱导培养出具有典型形态特征和表型的 DC [2] 。且应用肝癌细胞 HepG2 冻融抗原致敏 DC ( Hep-DC )，与自体淋巴细胞共培养后，进行体外杀伤试验。结果显示 Hep-DC-L 对 HepG2 具有较强的杀伤作用，明显高于未致敏 DC 刺激的淋巴细胞( DC-L )和单纯淋巴细胞( L )( P <0.05 )，提示 HepG2 冻融抗原致敏的 DC 可诱导自体淋巴细胞产生 HepG2 抗原特异性 CTL ，对 HepG2 发挥高效特异的杀伤作用 [3] ，在此基础上我们使用基因修饰 DC 制成肿瘤疫苗。近三年来我科在应用 DC 治疗人原发性肝癌方面进行了临床探索，共治疗 25 例 III ～ IV 肝癌患者，结果显示治疗组疾病进展时间( TTP )为 5.6 月，随访至 2006 年 1 月，治疗后存活时间最长已经超过 12 个月 [4] 。其中一例进行 DC 治疗时已为 IV 肝癌患者，出现肺转移，治疗后存活时间已经超过 18 个月，随访至今仍存活。
肿瘤免疫治疗的关键是如何找到肿瘤特异的排斥抗原，近年来外切体( exosome )作为一种崭新的肿瘤抗原的来源，逐渐成为非细胞性肿瘤疫苗研究的热点。有学者证明肿瘤细胞本身也可以产生外切体，当将这些外切体负载到人树突状细胞的时候，可以诱导出 T 细胞免疫应答。而且来源于肿瘤细胞的外来体含有共有肿瘤排斥抗原( shared tumor rejected antigen ) [5] ，极大地扩展了外切体作为肿瘤疫苗的可能性。
我们采用基因重组技术构建了用乙肝病毒表面抗原 "a" 位点基因替换 CD74 分子的 CLIP 片段基因的真核表达质粒 [6] ，希望通过恒定链分子的引导肽将该抗原引导到 MVB 中，从而进入外来体的形成通路，最终将目的抗原负载到外来体。同时我们利用外来体的直径是 50 ～ 90 nm 的物理特性，采用用基于孔径的生物膜分离技术成功地制备了外来体 [7] 。希望能采用外来体提取肝癌等肿瘤抗原，解决肝癌生物治疗中特异性肿瘤抗原来源困难的问题。目前进一步研究正在进行中。
(二)免疫基因治疗
肝癌患者往往存在免功能低下，因此可通过导入相关免疫调节基因，达到提高宿主免疫力和治疗作用的目的。使用最为普遍为基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗和细胞因子基因治疗两个方面，是当前肝癌基因治疗研究的重点之一 [8] 。
其中本课题组在基因修饰基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗方面进行了研究。 我国为肝癌高发地区，发病具有明显特征，约 90% 具有病毒性肝炎背景，肝癌患者中约 80% 可见 AFP 阳性， 50% 患者肝癌组织中 P53 高表达， 60% 患者可检测到病毒性肝炎抗原。我们课题组 应用 AFP-cDNA 真核表达载体转染 DC 制备 AFP-DC 瘤苗，电化学发光法检测培养上清中含有 AFP 抗原分子，证实 AFP-DC 能够表达并分泌 AFP ，同时，细胞免疫荧光染色可见细胞膜及胞浆荧光染色阳性，表明 AFP-DC 不仅能够表达 AFP ，并且能够将 AFP 抗原分子提呈到细胞膜上。 AFP-DC 活化的 CTL 对表达 AFP 的肝癌细胞株 HepG2 有强的杀伤作用，与对照组相比，差异显著，表明 AFP-DC 活化的 CTL 是 AFP 特异性的。证实肝癌相关性抗原 AFP 可作为肝癌靶向治疗的突破点， AFP-DC 疫苗可以成功诱导出 AFP 特异性 CTL ，对表达 AFP 的肝癌细胞株 HepG2 具有特异性杀伤效用。同时根据原发性 HBV 感染的肝癌表达病毒抗原 HBsAg 的特点，以 HBsAg 作为靶点，采用 HBsAg 基因脂质体介导转染的未成熟单个核细胞来源的树突状细胞，能够诱导特异性的 CTL ，能够表达乙型肝炎表面抗原。 CTL 对表达 HBsAg 的肝癌细胞 HepG2.2.15 有较强的杀伤作用， MTT 法检测显示细胞毒性作用明显增强( P <0.01) [9 - 11] 。提示基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗具有很好的临床应用前景。
(三)干细胞在肝癌治疗中的价值和应用前景
近年来已有多个学者研究报道了骨髓干细胞参与了肝组织的再生、修复过程 [12] 。最近研究发现骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs )是骨髓中最具向肝细胞分化潜能的细胞组分 [13] 。肝癌病人多继发于肝硬化基础上，同时存在肝功能障碍，我们设想利用干细胞的可塑性、横向分化的潜能，对肝癌病人进行 DC 治疗同时进行定向诱导分化成熟肝细胞，根据组织工程学原理对肝脏进行修复、再造，可能会成为干细胞治疗肝癌的研究热点。我们课题组先期建立了兔鳞癌肝转移模型，研究发现 BMSCs 在肝癌微环境中可以分化为肝细胞样细胞，并可以分泌和表达白蛋白和 CK-18 、 CK-19 ，具有肝细胞的生物活性；注入的 BMSCs 在癌组织中未见向癌细胞转变，少数干细胞在癌组织中表达 CK18 ，无白蛋白、 CK19 表达 [14] 。但兔鳞癌肝转移模型存在许多缺陷，其中最关键的是该模型不是真正的肝细胞癌模型。而后本课题组建立了小鼠原位移植性肝癌模型 [15] ，将 BALB/c 雄性小鼠来源的 BMSCs 及 Rosa26 转基因雄性小鼠来源的 BMSCs 分别接种 BALB/c 小鼠原位肝癌移植模型，探讨 BMSCs 在原位肝癌移植模型中的分化；并观察荷瘤小鼠接受 BMSCs 局部注射后 ......
北京大学临床肿瘤学院内科 任 军
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一 ， 居全世界发病率第 5 位 ， 每年死亡人数 1000000 ， 在亚洲和中非地区发病率为 20 ～ 28/100000 人 ， 北欧、北美和澳大利亚为 < 5/100000 人。过去 20 年内，美国发病率由 1.4/100000 人上升到 2.4/100000 人 [1] 。 目前大部分进展期肝癌患者缺乏有效的治疗手段，总的生存率仅为 3 %～ 5 %。近年来随着对肿瘤生物学认识的逐步深入以及分子生物学和细胞生物学的迅速发展，为肝癌的综合治疗提供了许多新的手段，其中生物免疫治疗显示了令人感到鼓舞的前景。现将本课题组近年来在原发性肝癌的生物免疫治疗方面进行总结。
一、 细胞免疫治疗
(一)树突状细胞( Dendritic Cell ， DC )
本课题组以健康供者外周血单个核细胞( PBSC )为来源，在 GM-CSF 、 TNF-a 和 IL-4 作用下体外诱导培养出具有典型形态特征和表型的 DC [2] 。且应用肝癌细胞 HepG2 冻融抗原致敏 DC ( Hep-DC )，与自体淋巴细胞共培养后，进行体外杀伤试验。结果显示 Hep-DC-L 对 HepG2 具有较强的杀伤作用，明显高于未致敏 DC 刺激的淋巴细胞( DC-L )和单纯淋巴细胞( L )( P <0.05 )，提示 HepG2 冻融抗原致敏的 DC 可诱导自体淋巴细胞产生 HepG2 抗原特异性 CTL ，对 HepG2 发挥高效特异的杀伤作用 [3] ，在此基础上我们使用基因修饰 DC 制成肿瘤疫苗。近三年来我科在应用 DC 治疗人原发性肝癌方面进行了临床探索，共治疗 25 例 III ～ IV 肝癌患者，结果显示治疗组疾病进展时间( TTP )为 5.6 月，随访至 2006 年 1 月，治疗后存活时间最长已经超过 12 个月 [4] 。其中一例进行 DC 治疗时已为 IV 肝癌患者，出现肺转移，治疗后存活时间已经超过 18 个月，随访至今仍存活。
肿瘤免疫治疗的关键是如何找到肿瘤特异的排斥抗原，近年来外切体( exosome )作为一种崭新的肿瘤抗原的来源，逐渐成为非细胞性肿瘤疫苗研究的热点。有学者证明肿瘤细胞本身也可以产生外切体，当将这些外切体负载到人树突状细胞的时候，可以诱导出 T 细胞免疫应答。而且来源于肿瘤细胞的外来体含有共有肿瘤排斥抗原( shared tumor rejected antigen ) [5] ，极大地扩展了外切体作为肿瘤疫苗的可能性。
我们采用基因重组技术构建了用乙肝病毒表面抗原 "a" 位点基因替换 CD74 分子的 CLIP 片段基因的真核表达质粒 [6] ，希望通过恒定链分子的引导肽将该抗原引导到 MVB 中，从而进入外来体的形成通路，最终将目的抗原负载到外来体。同时我们利用外来体的直径是 50 ～ 90 nm 的物理特性，采用用基于孔径的生物膜分离技术成功地制备了外来体 [7] 。希望能采用外来体提取肝癌等肿瘤抗原，解决肝癌生物治疗中特异性肿瘤抗原来源困难的问题。目前进一步研究正在进行中。
(二)免疫基因治疗
肝癌患者往往存在免功能低下，因此可通过导入相关免疫调节基因，达到提高宿主免疫力和治疗作用的目的。使用最为普遍为基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗和细胞因子基因治疗两个方面，是当前肝癌基因治疗研究的重点之一 [8] 。
其中本课题组在基因修饰基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗方面进行了研究。 我国为肝癌高发地区，发病具有明显特征，约 90% 具有病毒性肝炎背景，肝癌患者中约 80% 可见 AFP 阳性， 50% 患者肝癌组织中 P53 高表达， 60% 患者可检测到病毒性肝炎抗原。我们课题组 应用 AFP-cDNA 真核表达载体转染 DC 制备 AFP-DC 瘤苗，电化学发光法检测培养上清中含有 AFP 抗原分子，证实 AFP-DC 能够表达并分泌 AFP ，同时，细胞免疫荧光染色可见细胞膜及胞浆荧光染色阳性，表明 AFP-DC 不仅能够表达 AFP ，并且能够将 AFP 抗原分子提呈到细胞膜上。 AFP-DC 活化的 CTL 对表达 AFP 的肝癌细胞株 HepG2 有强的杀伤作用，与对照组相比，差异显著，表明 AFP-DC 活化的 CTL 是 AFP 特异性的。证实肝癌相关性抗原 AFP 可作为肝癌靶向治疗的突破点， AFP-DC 疫苗可以成功诱导出 AFP 特异性 CTL ，对表达 AFP 的肝癌细胞株 HepG2 具有特异性杀伤效用。同时根据原发性 HBV 感染的肝癌表达病毒抗原 HBsAg 的特点，以 HBsAg 作为靶点，采用 HBsAg 基因脂质体介导转染的未成熟单个核细胞来源的树突状细胞，能够诱导特异性的 CTL ，能够表达乙型肝炎表面抗原。 CTL 对表达 HBsAg 的肝癌细胞 HepG2.2.15 有较强的杀伤作用， MTT 法检测显示细胞毒性作用明显增强( P <0.01) [9 - 11] 。提示基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗具有很好的临床应用前景。
(三)干细胞在肝癌治疗中的价值和应用前景
近年来已有多个学者研究报道了骨髓干细胞参与了肝组织的再生、修复过程 [12] 。最近研究发现骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs )是骨髓中最具向肝细胞分化潜能的细胞组分 [13] 。肝癌病人多继发于肝硬化基础上，同时存在肝功能障碍，我们设想利用干细胞的可塑性、横向分化的潜能，对肝癌病人进行 DC 治疗同时进行定向诱导分化成熟肝细胞，根据组织工程学原理对肝脏进行修复、再造，可能会成为干细胞治疗肝癌的研究热点。我们课题组先期建立了兔鳞癌肝转移模型，研究发现 BMSCs 在肝癌微环境中可以分化为肝细胞样细胞，并可以分泌和表达白蛋白和 CK-18 、 CK-19 ，具有肝细胞的生物活性；注入的 BMSCs 在癌组织中未见向癌细胞转变，少数干细胞在癌组织中表达 CK18 ，无白蛋白、 CK19 表达 [14] 。但兔鳞癌肝转移模型存在许多缺陷，其中最关键的是该模型不是真正的肝细胞癌模型。而后本课题组建立了小鼠原位移植性肝癌模型 [15] ，将 BALB/c 雄性小鼠来源的 BMSCs 及 Rosa26 转基因雄性小鼠来源的 BMSCs 分别接种 BALB/c 小鼠原位肝癌移植模型，探讨 BMSCs 在原位肝癌移植模型中的分化；并观察荷瘤小鼠接受 BMSCs 局部注射后 ......
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