基于T细胞受体基因的血液肿瘤免疫治疗研究
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参见附件(44KB)。
暨南大学医学院血液病研究所 李扬秋 李 闯
获得性抗原特异免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗最为理想的方式之一，它不因病人自身的免疫活性而影响疗效，所输注特异性淋巴细胞可以有效靶向肿瘤相关抗原，后者由于免疫原性低不能引起有效的自体抗肿瘤 T 细胞免疫应答。由于分离和体外扩增抗原特异淋巴细胞的限制，传统的获得性免疫治疗仅仅限于某些特定研究中心的少数病人的应用。借助对抗原特异淋巴细胞的 T 细胞受体( TCR )基因分析结果，将 TCR 作为基因治疗分子而实施新的非传统性的获得性抗原特异免疫治疗正在研究中。
一、 T 细胞受体基因
T 细胞受体( TCR )是 T 细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子。 TCR 包括有 α 、 β 、 γ 和 δ 四种肽链，以两种形式存在，由二硫键连接形成异二聚体 α/β 或 γ/δ 蛋白链。在正常儿童和成人中，血液中的大部分 T 细胞表达 TCRαβ 异二聚体，而仅表达少量的 TCRγδ 分子。外周血中 TCRαβ + T 细胞占 90%~95% ，而 TCRγδ + T 细胞仅占 5%~10% 。
TCR 属免疫球蛋白超家族，与免疫球蛋白( Ig )的结构相似，具有抗原特异性的 V 区(可变区)和恒定区( C 区)。 TCR 识别抗原的特异性和多样性在于其 V 区的多样性，该多样性来自于 TCR 基因谱系和重排的特点。构成了 T 细胞对众多外来抗原的特异识别和产生免疫应答的巨大潜力。
TCR 基因的结构与 Ig 基因相似，在胚系中，编码 TCR 链的 DNA 是由多个分隔开的基因片段组成，在胸腺细胞发育过程中重排后，形成编码一条完整肽链的基因。每一个 TCR 胚系基因包括可变区( V 区)、结合区( J 区)和恒定区( C 区)等基因片段，在 TCRβ 和 TCRδ 基因中还包含多样区( D 区)。在 TCR 胚系基因的 5' 端包含不同数量的 V 区基因片段，并将其分成多个亚家族。此外，每个 TCR 胚系基因还包含不同数量的 D 区( TCRβ 和 TCRδ )、 J 区和 C 区。 TCRβ 基因所含 V 区片段一般分为 24 个亚家族，而 TCRα 基因多分为 29 个亚家族。
TCR 基因的重排过程也与 Ig 基因重排相似。在前 T 细胞中， TCR 基因处于无功能的胚系结构状态，在前 T 细胞分化成熟为双阳性细胞的过程中， TCR 基因片段按限定的顺序进行重排，形成功能性 TCR ，重排的过程是 TCR 表达的先决条件。 TCR 重排过程首先由重组酶识别 RSS 而启动的。首先由随机的一个 D 区和一个 J 区发生重排，然后是随机的一个 V 区与已重排的 DJ 区发生重排，在 V-D 和 D-J 各基因片段连接的过程中，有不同数量的核苷酸( 3~24 个)随机的插入，称为 N 区，故在 V 区与 D 区、 D 区与 J 区的连接处，均有不同数量核苷酸的 N 区，形成了 V N ( D N ) J 的重排基因，同时，参加重排的 D 区基因片段可长可短，并不一定为整个 D 区的基因片段，最后，不参加重排的 C 区连接到 J 区上，形成一个完整的 TCR 基因 -V N D N JC 。 TCRα 和 TCRγ 基因不含有 D 区，故仅有 V 区与 J 区的重排。 V 区编码了 CDR1 、 CDR2 和部分 CDR3 ，在 V N ( D N ) J 的连接区，称为互补决定区 3 ( CDR3 )，它是识别抗原的区域，由于 N 区的插入和 D 区重排时的长短不一，即 CDR3 长度的多样性，构成了不同克隆的 T 细胞具有不同的 TCR-CDR3 序列，所以 TCR 的多样性并不仅仅依据各 V 、( D )、 J 区基因片段随机组合的数量，更与结合过程的多样性( CDR3 )有关，从而形成了 T 细胞识别不同抗原的高度多样性。通过分析 TCR 亚家族基因和重排的特点，就可以了解抗原特异的 TCR 基因序列。
?抗原特异 T 细胞的确定
获得抗原特异 CTL 是实施靶向过继性免疫治疗的关键，它可由病人体内肿瘤抗原刺激而产生，也可经体外特定抗原诱导而获得，后者包括自体和异基因抗原诱导的特异 CTL 。体外诱导特异 CTL 的血液肿瘤抗原包括采用整个肿瘤细胞、肿瘤细胞凋亡产物、人工合成的多肽(融合基因、癌基因产物等)和独特型抗原等。利用肿瘤细胞或肿瘤细胞凋亡产物等诱导的 CTL ，由于存在多种肿瘤抗原或多个肿瘤抗原决定簇等情况，往往出现 1 个以上的 TCR Vα/Vβ 亚家族的 T 细胞扩增。越来越多的研究应用针对某一癌基因产物、融合基因产物或突变基因产物等等，而设计的人工合成 HLA 限制性多肽作为单一的抗原诱导特异性 T 细胞增殖。如融合多肽( bcr-abl 、 PML-RARα 、 AML1-MTG8 等)，直接或通过 DC 刺激 T 细胞，均有可能获得单一的抗原特异克隆性 CTL 。
克隆性 CTL 的分析可通过检测 TCR Vβ 亚家族基因谱系或四聚体( tetramer )分析而确定。利用 TCR Vβ 基因分析是基于每一克隆增殖 T 细胞均存在相同的 Vβ-Dβ-Jβ 重排，构成抗原特异的互补决定区 3 ( CDR3 )，经 RT-PCR 和基因扫描分析各 Vβ 亚家族 T 细胞的克隆性，确定单克隆增殖的 T 细胞，从而了解抗原特异 CTL 的分布。
?TCR 基因转导技术和抗原识别模式改构
体外实验和小鼠动物模型体内研究均显示抗原特异 CTL 具有靶向杀伤抗原负载肿瘤细胞的作用，提示了可以通过分选和扩增这些特异性的 TCRVβ 亚家族 T 细胞克隆应用于肿瘤或病毒感染等患者的免疫治疗，经体外的实验完全证实了这种可能性，但真正能用于病人治疗的方案却寥寥无几，其原因在于短时间内很难从患者的 T 细胞或患者白血病抗原诱导的异基因 T 细胞中获得足够数量的 CTL 用于治疗。所以，如何获得足够数量白血病抗原特异 CTL 是更为主要的问题。通过转导能够识别白血病、肿瘤或病毒抗原的 TCR 基因至正常 T 细胞中，使其强制性表达这种独特性 TCR ，改变 T 细胞内源性 TCR 识别抗原的原有模式，经过大量扩增后，有可能成为具备分泌细胞因子或特异杀伤靶细胞的功能，完成机体对抗原的免疫应答，可产生足够用于治疗的特异性 CTL 。
实际上，早在 1986 年已经报道第一个受鼠 T 细胞转导 MHC 限制性 TCRα 和 TCRβ 基因技术，但直到 1999 年才开始明确转导 TCR 基因的应用性：转导病毒或肿瘤抗原特异 TCR 基因，形成病毒或抗原特异 CTL 用于相应的免疫治疗。通过 T 细胞克隆性分析确定与肿瘤抗原相关的 T 细胞克隆所属的 TCR Vα 或 TCR Vβ 亚家族，序列分析确定其 CDR3 序列后，经各种转基因手段将此肿瘤抗原相关的 TCR Vα 或 TCR Vβ 基因( HLA 限制性)转导至外周血 T 细胞中，已有报道多种特异性 TCRα 和 TCRβ 基因的有效基因转导系统，目前绝大多数 TCR 转导技术均通过逆转录病毒载体而实现的。
(一) TCR 基因转导技术
目前 TCR 基因转导的载体主要还是病毒载体，但一直以来都在尝试寻找出更理想的理化转导方式。
利用病毒载体将 TCR 基因转染至 T 细胞，该载体最大的优点是高效率的转染，但存在着病毒自身的感染和较强的免疫原性导致机体对病毒产生免疫应答。目前主要采用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体，还有其它如腺相关病毒载体等。采用逆转录病毒作为载体的转染效果更高，将特异性 TCR 基因与其重组，经包装细胞包装后，形成具备感染能力的新病毒颗粒。经逆转录病毒转导系统转导 TCR 基因有效率报道不一，转染率低者仅有 10% 左右，而高者可达 90% ，也有报道在转导后经靶抗原刺激增殖后可提高阳性细胞水平，不同逆转导病毒载体转导 TCR 基因的转染率也有所不同，有报道利用 MPSV 载体转导 T 细胞后表达的 TCR 基因水平明显高于较利用鼠白血病病毒( MLV )载体转导 T 细胞。由于是转染成熟 T 细胞，所以相对来说风险性较低，目前体外和动物体内实验研究报道尚未发现逆转录病毒转导 TCR 基因后所出现的副作用。
与病毒载体相比，理化转染技术安全性高、周期短、相对简单、易于开展，但核酸 RNA 酶对转染基因的降解、靶细胞对转染基因的摄取效率低、赖氨酸酶的降解、靶基因在细胞核表面的定位性差等诸多原因导致转染失败。常用的理化转染技术有电穿孔技术、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法等，但在 TCR 基因转导技术中应用较少，原因是应用这些技术很难将基因转导至成熟的 T 细胞中，转染效率很低。近期报道一种新 RNA 电穿孔技术( RNA electroporation )，应用体外转录的 mRNA ，在 80% 以上转染存活的原代人和小鼠 T 细胞中 90% 表达了所转导的 TCR 基因，具有高转染率和低转染相关毒性的优势，有报道应用该技术转导 NY-ESO-1 、 MART-1 和 p53 抗原特异的 TCR ，都获得了成功。另外，近期报道了一种新的非病毒载体转导方式 -Nucleofaction (核转染)的方式，直接将 DNA 转导至细胞核中，所采用的设备是近期德国发明的 Nucleofactor ，结果显示在细胞株中的转染率介于 40% ~75% ，这种新技术可能会对基因转染技术产生重要的影响。
(二) TCR 基因修饰 T 细胞的特性
TCR 基因转染后的 T 细胞理论上可表达四种 TCR ：( 1 )内源性的 TCRα/ β 二聚体，( 2 )转导的抗原特异 TCRα/ β 二聚体，( 3 )内源 α 链和转染 β 链的 α/ β TCR 二聚体，( 4 )内源 β 链和转染 α 链的 TCRα/β 二聚体。理论上第 3 、 4 的内源和转染的杂合 TCRα/ β 二聚体不能被机体 MHC 识别，具有抗受者 MHC 的效应，由于 TCRα/ β 二聚体是在胸腺中经过自然选择形成的，但实验检测结果显示 TCR 基因修饰 T 细胞并不表达这两种嵌合方式的 TCR ，可以排除修饰后 T 细胞所可能存在的异反应性。这可能是因为转染的 TCR 基因已经经过重排，所以这也是目前研究中没有发现成功转染的 TCR 基因不能被 MHC 识别的原因。虽然在内源性 TCR 和转染 TCR 两者之间一种 TCR 占相对主导地位，但他们的基本功能并未发生根本改变。目前常用绿色荧光蛋白基因作为转染阳性对照，检测 TCR 基因转染是否成功。研究结果证明经 TCR 基因修饰后 T 细胞具有以下的特征：具有功能健全的 T 细胞增殖、特异识别抗原肽的能力、细胞毒活性与不经修饰 CTL 能力相同，可在体外扩增一定时间且功能恒定，能形成记忆细胞。小鼠模型体内实验则已证明了 TCR 基因修饰后 T 细胞的抗原特异性细胞毒活性，且未发现自身免疫反应。此外， TCR 基因修饰后 T 细胞主要表达自身 TCR 和抗原特异 TCR ，为了促进抗原特异 TCR 的高表达，可在转导 TCR 基因后，可在体外培养中用靶抗原继续刺激基因修饰 T 细胞。
?TCR 基因修饰 T 细胞在血液肿瘤免疫治疗的研究
TCR 基因修饰的抗原特异 T 细胞目前主要用于抗肿瘤、抗病毒和自身免疫性疾病的治疗研究中。 TCR 基因修饰的 CTL 的应用研究开始于 EBV 和黑色素瘤相关抗原特异 TCR 基因转导。
由于黑色素瘤细胞抗原性相对较强、易于被机体的免疫系统识别，大多数抗肿瘤免疫应答的研究都以其作为研究模型。将表达于大多数黑色素瘤的肿瘤相关抗原 MART-1 和 gp100 特异的 HLA-I 限制性 T 细胞克隆的 TCRαβ 基因有效地转导到 T 细胞中，获得了识别 MART-1 或
gp100 多肽的抗肿瘤功能 CTL 株。检测结果显示其基因转染率可以达到 50% 以上，转染后的 T 细胞具备了识别低水平肽，而不识别无关多肽的特异性，基因转导后 T 细胞在体外经相关抗原多肽刺激后，高表达 IFN- γ ，具有 HLA-1 类分子限制杀伤表达 gp100 的黑色素瘤细胞等特点。另外， TCR 基因转导对黑色素瘤无免疫应答作用的肿瘤浸润淋巴细胞后，同样可以诱导出具有抗原特异的抗黑色素瘤应答。
伴有 EB 病毒感染的淋巴瘤细胞表达 EBV 的一些产物如 BZLF1 ，它们可以诱导 T 细胞产生免疫应答，形成相应的抗 EBV 的 CTL 克隆，获得性转化的 EBV 特异 CTL 能有效地清除 EBV + 淋巴瘤细胞。此外， EBV 相关的移植后淋巴细胞增殖障碍( PTLDs )是器官移植后免疫抑制的常见并发症，死亡率高。应用自身 EBV 特异 CT L 的预防性干预可能改善 PTLD 的治疗效果。由于产生大量自身 EBV 特异 CTL 同样存在一定的困难，故构建和转导 EBV-TCRαβ 基因形成抗 EBV 特异的 T 细胞的研究在几年前就率先开展了。通过 SAMEN 逆转录病毒载体转导 TCR 基因至 T 细胞后，形成具有识别 EBV 潜伏抗原能力的 CTL ，并具有抗 EBV-II 型恶性肿瘤活性。
肿瘤抗原特异 TCR 基因转导在 WT1 多肽特异 TCR 的研究比较系统，多个研究报道从不同层面完成了 WT1 特异 TCR 基因修饰 T 细胞的体外和动物体内功能检测。转导 T 细胞包括 CD4 + 和 CD8 + T 细胞，细胞来源包括来自白血病病人自体 T 细胞或者正常供者 T 细胞， Tsuji 等利用慢病毒载体转导识别 WT1 多肽的 HLA-A24 限制性 TCRαβ 基因至 Th1 和 Tc1 细胞，转导后 Th1 和 Tc1 细胞均显示了对多肽负载的幼稚淋巴细胞株和表达 WT1 和 HLA-A24 的原代白血病细胞具有抗原特异细胞毒活性和反应性分泌大量 IFN- γ 。动物实验则应用含有人白血病细胞的 NOD/SCID 模型，证明了 WT1-TCR 修饰 T 细胞可以清楚小鼠体内的白血病细胞。该结果比较直接地提示了利用 WT1-TCR 基因修饰病人 T 细胞可以考虑应用于白血病的免疫治疗。......（后略) ......
暨南大学医学院血液病研究所 李扬秋 李 闯
获得性抗原特异免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗最为理想的方式之一，它不因病人自身的免疫活性而影响疗效，所输注特异性淋巴细胞可以有效靶向肿瘤相关抗原，后者由于免疫原性低不能引起有效的自体抗肿瘤 T 细胞免疫应答。由于分离和体外扩增抗原特异淋巴细胞的限制，传统的获得性免疫治疗仅仅限于某些特定研究中心的少数病人的应用。借助对抗原特异淋巴细胞的 T 细胞受体( TCR )基因分析结果，将 TCR 作为基因治疗分子而实施新的非传统性的获得性抗原特异免疫治疗正在研究中。
一、 T 细胞受体基因
T 细胞受体( TCR )是 T 细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子。 TCR 包括有 α 、 β 、 γ 和 δ 四种肽链，以两种形式存在，由二硫键连接形成异二聚体 α/β 或 γ/δ 蛋白链。在正常儿童和成人中，血液中的大部分 T 细胞表达 TCRαβ 异二聚体，而仅表达少量的 TCRγδ 分子。外周血中 TCRαβ + T 细胞占 90%~95% ，而 TCRγδ + T 细胞仅占 5%~10% 。
TCR 属免疫球蛋白超家族，与免疫球蛋白( Ig )的结构相似，具有抗原特异性的 V 区(可变区)和恒定区( C 区)。 TCR 识别抗原的特异性和多样性在于其 V 区的多样性，该多样性来自于 TCR 基因谱系和重排的特点。构成了 T 细胞对众多外来抗原的特异识别和产生免疫应答的巨大潜力。
TCR 基因的结构与 Ig 基因相似，在胚系中，编码 TCR 链的 DNA 是由多个分隔开的基因片段组成，在胸腺细胞发育过程中重排后，形成编码一条完整肽链的基因。每一个 TCR 胚系基因包括可变区( V 区)、结合区( J 区)和恒定区( C 区)等基因片段，在 TCRβ 和 TCRδ 基因中还包含多样区( D 区)。在 TCR 胚系基因的 5' 端包含不同数量的 V 区基因片段，并将其分成多个亚家族。此外，每个 TCR 胚系基因还包含不同数量的 D 区( TCRβ 和 TCRδ )、 J 区和 C 区。 TCRβ 基因所含 V 区片段一般分为 24 个亚家族，而 TCRα 基因多分为 29 个亚家族。
TCR 基因的重排过程也与 Ig 基因重排相似。在前 T 细胞中， TCR 基因处于无功能的胚系结构状态，在前 T 细胞分化成熟为双阳性细胞的过程中， TCR 基因片段按限定的顺序进行重排，形成功能性 TCR ，重排的过程是 TCR 表达的先决条件。 TCR 重排过程首先由重组酶识别 RSS 而启动的。首先由随机的一个 D 区和一个 J 区发生重排，然后是随机的一个 V 区与已重排的 DJ 区发生重排，在 V-D 和 D-J 各基因片段连接的过程中，有不同数量的核苷酸( 3~24 个)随机的插入，称为 N 区，故在 V 区与 D 区、 D 区与 J 区的连接处，均有不同数量核苷酸的 N 区，形成了 V N ( D N ) J 的重排基因，同时，参加重排的 D 区基因片段可长可短，并不一定为整个 D 区的基因片段，最后，不参加重排的 C 区连接到 J 区上，形成一个完整的 TCR 基因 -V N D N JC 。 TCRα 和 TCRγ 基因不含有 D 区，故仅有 V 区与 J 区的重排。 V 区编码了 CDR1 、 CDR2 和部分 CDR3 ，在 V N ( D N ) J 的连接区，称为互补决定区 3 ( CDR3 )，它是识别抗原的区域，由于 N 区的插入和 D 区重排时的长短不一，即 CDR3 长度的多样性，构成了不同克隆的 T 细胞具有不同的 TCR-CDR3 序列，所以 TCR 的多样性并不仅仅依据各 V 、( D )、 J 区基因片段随机组合的数量，更与结合过程的多样性( CDR3 )有关，从而形成了 T 细胞识别不同抗原的高度多样性。通过分析 TCR 亚家族基因和重排的特点，就可以了解抗原特异的 TCR 基因序列。
?抗原特异 T 细胞的确定
获得抗原特异 CTL 是实施靶向过继性免疫治疗的关键，它可由病人体内肿瘤抗原刺激而产生，也可经体外特定抗原诱导而获得，后者包括自体和异基因抗原诱导的特异 CTL 。体外诱导特异 CTL 的血液肿瘤抗原包括采用整个肿瘤细胞、肿瘤细胞凋亡产物、人工合成的多肽(融合基因、癌基因产物等)和独特型抗原等。利用肿瘤细胞或肿瘤细胞凋亡产物等诱导的 CTL ，由于存在多种肿瘤抗原或多个肿瘤抗原决定簇等情况，往往出现 1 个以上的 TCR Vα/Vβ 亚家族的 T 细胞扩增。越来越多的研究应用针对某一癌基因产物、融合基因产物或突变基因产物等等，而设计的人工合成 HLA 限制性多肽作为单一的抗原诱导特异性 T 细胞增殖。如融合多肽( bcr-abl 、 PML-RARα 、 AML1-MTG8 等)，直接或通过 DC 刺激 T 细胞，均有可能获得单一的抗原特异克隆性 CTL 。
克隆性 CTL 的分析可通过检测 TCR Vβ 亚家族基因谱系或四聚体( tetramer )分析而确定。利用 TCR Vβ 基因分析是基于每一克隆增殖 T 细胞均存在相同的 Vβ-Dβ-Jβ 重排，构成抗原特异的互补决定区 3 ( CDR3 )，经 RT-PCR 和基因扫描分析各 Vβ 亚家族 T 细胞的克隆性，确定单克隆增殖的 T 细胞，从而了解抗原特异 CTL 的分布。
?TCR 基因转导技术和抗原识别模式改构
体外实验和小鼠动物模型体内研究均显示抗原特异 CTL 具有靶向杀伤抗原负载肿瘤细胞的作用，提示了可以通过分选和扩增这些特异性的 TCRVβ 亚家族 T 细胞克隆应用于肿瘤或病毒感染等患者的免疫治疗，经体外的实验完全证实了这种可能性，但真正能用于病人治疗的方案却寥寥无几，其原因在于短时间内很难从患者的 T 细胞或患者白血病抗原诱导的异基因 T 细胞中获得足够数量的 CTL 用于治疗。所以，如何获得足够数量白血病抗原特异 CTL 是更为主要的问题。通过转导能够识别白血病、肿瘤或病毒抗原的 TCR 基因至正常 T 细胞中，使其强制性表达这种独特性 TCR ，改变 T 细胞内源性 TCR 识别抗原的原有模式，经过大量扩增后，有可能成为具备分泌细胞因子或特异杀伤靶细胞的功能，完成机体对抗原的免疫应答，可产生足够用于治疗的特异性 CTL 。
实际上，早在 1986 年已经报道第一个受鼠 T 细胞转导 MHC 限制性 TCRα 和 TCRβ 基因技术，但直到 1999 年才开始明确转导 TCR 基因的应用性：转导病毒或肿瘤抗原特异 TCR 基因，形成病毒或抗原特异 CTL 用于相应的免疫治疗。通过 T 细胞克隆性分析确定与肿瘤抗原相关的 T 细胞克隆所属的 TCR Vα 或 TCR Vβ 亚家族，序列分析确定其 CDR3 序列后，经各种转基因手段将此肿瘤抗原相关的 TCR Vα 或 TCR Vβ 基因( HLA 限制性)转导至外周血 T 细胞中，已有报道多种特异性 TCRα 和 TCRβ 基因的有效基因转导系统，目前绝大多数 TCR 转导技术均通过逆转录病毒载体而实现的。
(一) TCR 基因转导技术
目前 TCR 基因转导的载体主要还是病毒载体，但一直以来都在尝试寻找出更理想的理化转导方式。
利用病毒载体将 TCR 基因转染至 T 细胞，该载体最大的优点是高效率的转染，但存在着病毒自身的感染和较强的免疫原性导致机体对病毒产生免疫应答。目前主要采用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体，还有其它如腺相关病毒载体等。采用逆转录病毒作为载体的转染效果更高，将特异性 TCR 基因与其重组，经包装细胞包装后，形成具备感染能力的新病毒颗粒。经逆转录病毒转导系统转导 TCR 基因有效率报道不一，转染率低者仅有 10% 左右，而高者可达 90% ，也有报道在转导后经靶抗原刺激增殖后可提高阳性细胞水平，不同逆转导病毒载体转导 TCR 基因的转染率也有所不同，有报道利用 MPSV 载体转导 T 细胞后表达的 TCR 基因水平明显高于较利用鼠白血病病毒( MLV )载体转导 T 细胞。由于是转染成熟 T 细胞，所以相对来说风险性较低，目前体外和动物体内实验研究报道尚未发现逆转录病毒转导 TCR 基因后所出现的副作用。
与病毒载体相比，理化转染技术安全性高、周期短、相对简单、易于开展，但核酸 RNA 酶对转染基因的降解、靶细胞对转染基因的摄取效率低、赖氨酸酶的降解、靶基因在细胞核表面的定位性差等诸多原因导致转染失败。常用的理化转染技术有电穿孔技术、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法等，但在 TCR 基因转导技术中应用较少，原因是应用这些技术很难将基因转导至成熟的 T 细胞中，转染效率很低。近期报道一种新 RNA 电穿孔技术( RNA electroporation )，应用体外转录的 mRNA ，在 80% 以上转染存活的原代人和小鼠 T 细胞中 90% 表达了所转导的 TCR 基因，具有高转染率和低转染相关毒性的优势，有报道应用该技术转导 NY-ESO-1 、 MART-1 和 p53 抗原特异的 TCR ，都获得了成功。另外，近期报道了一种新的非病毒载体转导方式 -Nucleofaction (核转染)的方式，直接将 DNA 转导至细胞核中，所采用的设备是近期德国发明的 Nucleofactor ，结果显示在细胞株中的转染率介于 40% ~75% ，这种新技术可能会对基因转染技术产生重要的影响。
(二) TCR 基因修饰 T 细胞的特性
TCR 基因转染后的 T 细胞理论上可表达四种 TCR ：( 1 )内源性的 TCRα/ β 二聚体，( 2 )转导的抗原特异 TCRα/ β 二聚体，( 3 )内源 α 链和转染 β 链的 α/ β TCR 二聚体，( 4 )内源 β 链和转染 α 链的 TCRα/β 二聚体。理论上第 3 、 4 的内源和转染的杂合 TCRα/ β 二聚体不能被机体 MHC 识别，具有抗受者 MHC 的效应，由于 TCRα/ β 二聚体是在胸腺中经过自然选择形成的，但实验检测结果显示 TCR 基因修饰 T 细胞并不表达这两种嵌合方式的 TCR ，可以排除修饰后 T 细胞所可能存在的异反应性。这可能是因为转染的 TCR 基因已经经过重排，所以这也是目前研究中没有发现成功转染的 TCR 基因不能被 MHC 识别的原因。虽然在内源性 TCR 和转染 TCR 两者之间一种 TCR 占相对主导地位，但他们的基本功能并未发生根本改变。目前常用绿色荧光蛋白基因作为转染阳性对照，检测 TCR 基因转染是否成功。研究结果证明经 TCR 基因修饰后 T 细胞具有以下的特征：具有功能健全的 T 细胞增殖、特异识别抗原肽的能力、细胞毒活性与不经修饰 CTL 能力相同，可在体外扩增一定时间且功能恒定，能形成记忆细胞。小鼠模型体内实验则已证明了 TCR 基因修饰后 T 细胞的抗原特异性细胞毒活性，且未发现自身免疫反应。此外， TCR 基因修饰后 T 细胞主要表达自身 TCR 和抗原特异 TCR ，为了促进抗原特异 TCR 的高表达，可在转导 TCR 基因后，可在体外培养中用靶抗原继续刺激基因修饰 T 细胞。
?TCR 基因修饰 T 细胞在血液肿瘤免疫治疗的研究
TCR 基因修饰的抗原特异 T 细胞目前主要用于抗肿瘤、抗病毒和自身免疫性疾病的治疗研究中。 TCR 基因修饰的 CTL 的应用研究开始于 EBV 和黑色素瘤相关抗原特异 TCR 基因转导。
由于黑色素瘤细胞抗原性相对较强、易于被机体的免疫系统识别，大多数抗肿瘤免疫应答的研究都以其作为研究模型。将表达于大多数黑色素瘤的肿瘤相关抗原 MART-1 和 gp100 特异的 HLA-I 限制性 T 细胞克隆的 TCRαβ 基因有效地转导到 T 细胞中，获得了识别 MART-1 或
gp100 多肽的抗肿瘤功能 CTL 株。检测结果显示其基因转染率可以达到 50% 以上，转染后的 T 细胞具备了识别低水平肽，而不识别无关多肽的特异性，基因转导后 T 细胞在体外经相关抗原多肽刺激后，高表达 IFN- γ ，具有 HLA-1 类分子限制杀伤表达 gp100 的黑色素瘤细胞等特点。另外， TCR 基因转导对黑色素瘤无免疫应答作用的肿瘤浸润淋巴细胞后，同样可以诱导出具有抗原特异的抗黑色素瘤应答。
伴有 EB 病毒感染的淋巴瘤细胞表达 EBV 的一些产物如 BZLF1 ，它们可以诱导 T 细胞产生免疫应答，形成相应的抗 EBV 的 CTL 克隆，获得性转化的 EBV 特异 CTL 能有效地清除 EBV + 淋巴瘤细胞。此外， EBV 相关的移植后淋巴细胞增殖障碍( PTLDs )是器官移植后免疫抑制的常见并发症，死亡率高。应用自身 EBV 特异 CT L 的预防性干预可能改善 PTLD 的治疗效果。由于产生大量自身 EBV 特异 CTL 同样存在一定的困难，故构建和转导 EBV-TCRαβ 基因形成抗 EBV 特异的 T 细胞的研究在几年前就率先开展了。通过 SAMEN 逆转录病毒载体转导 TCR 基因至 T 细胞后，形成具有识别 EBV 潜伏抗原能力的 CTL ，并具有抗 EBV-II 型恶性肿瘤活性。
肿瘤抗原特异 TCR 基因转导在 WT1 多肽特异 TCR 的研究比较系统，多个研究报道从不同层面完成了 WT1 特异 TCR 基因修饰 T 细胞的体外和动物体内功能检测。转导 T 细胞包括 CD4 + 和 CD8 + T 细胞，细胞来源包括来自白血病病人自体 T 细胞或者正常供者 T 细胞， Tsuji 等利用慢病毒载体转导识别 WT1 多肽的 HLA-A24 限制性 TCRαβ 基因至 Th1 和 Tc1 细胞，转导后 Th1 和 Tc1 细胞均显示了对多肽负载的幼稚淋巴细胞株和表达 WT1 和 HLA-A24 的原代白血病细胞具有抗原特异细胞毒活性和反应性分泌大量 IFN- γ 。动物实验则应用含有人白血病细胞的 NOD/SCID 模型，证明了 WT1-TCR 修饰 T 细胞可以清楚小鼠体内的白血病细胞。该结果比较直接地提示了利用 WT1-TCR 基因修饰病人 T 细胞可以考虑应用于白血病的免疫治疗。......（后略) ......
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- 尿道下裂患者雄激素受体基因突变的研究.PDF
- 《决定健康与命运的遗传基因》.同异.扫描版.pdf
- 先天性尿道下裂与SRY基因关系的探讨.PDF
- 互联网四大亚马逊苹果脸书和谷歌的隐藏基因精装.pdf
- 《哈拉维与基因改良食品》.乔治·迈尔逊.扫描版.pdf
- 《上帝的手术刀》.pdf .azw3
- 基因工程原理和技术.pdf
- 细胞凋亡及其基因调控.PDF
- 《蛋白质、酶和基因——化学与生物学的交互作用》(Proteins, Enzymes, Genes: The Interplay of Che
- 《基因工程原理与技术(第2版)》扫描版.pdf
- 读客经典文库：科幻大师威尔斯精选集（翻开这六本科幻小说，隐身、时间旅行、外星人入侵、基因改造、反乌托邦……全部在这里！）.epub .azw3
- 《自私的基因》.doc
- 《天外基因》(黄国平)扫描版.pdf
- 《创新者的基因》.pdf .mobi
- 《基因传：众生之源》.pdf .epub .mobi .azw3