基于T细胞受体基因的血液肿瘤免疫治疗研究
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参见附件(44kb)。
暨南大学医学院血液病研究所 李扬秋 李 闯
获得性抗原特异免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗最为理想的方式之一，它不因病人自身的免疫活性而影响疗效，所输注特异性淋巴细胞可以有效靶向肿瘤相关抗原，后者由于免疫原性低不能引起有效的自体抗肿瘤 T 细胞免疫应答。由于分离和体外扩增抗原特异淋巴细胞的限制，传统的获得性免疫治疗仅仅限于某些特定研究中心的少数病人的应用。借助对抗原特异淋巴细胞的 T 细胞受体( TCR )基因分析结果，将 TCR 作为基因治疗分子而实施新的非传统性的获得性抗原特异免疫治疗正在研究中。
一、 T 细胞受体基因
T 细胞受体( TCR )是 T 细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子。 TCR 包括有 α 、 β 、 γ 和 δ 四种肽链，以两种形式存在，由二硫键连接形成异二聚体 α/β 或 γ/δ 蛋白链。在正常儿童和成人中，血液中的大部分 T 细胞表达 TCRαβ 异二聚体，而仅表达少量的 TCRγδ 分子。外周血中 TCRαβ + T 细胞占 90%~95% ，而 TCRγδ + T 细胞仅占 5%~10% 。
TCR 属免疫球蛋白超家族，与免疫球蛋白( Ig )的结构相似，具有抗原特异性的 V 区(可变区)和恒定区( C 区)。 TCR 识别抗原的特异性和多样性在于其 V 区的多样性，该多样性来自于 TCR 基因谱系和重排的特点。构成了 T 细胞对众多外来抗原的特异识别和产生免疫应答的巨大潜力。
TCR 基因的结构与 Ig 基因相似，在胚系中，编码 TCR 链的 DNA 是由多个分隔开的基因片段组成，在胸腺细胞发育过程中重排后，形成编码一条完整肽链的基因。每一个 TCR 胚系基因包括可变区( V 区)、结合区( J 区)和恒定区( C 区)等基因片段，在 TCRβ 和 TCRδ 基因中还包含多样区( D 区)。在 TCR 胚系基因的 5' 端包含不同数量的 V 区基因片段，并将其分成多个亚家族。此外，每个 TCR 胚系基因还包含不同数量的 D 区( TCRβ 和 TCRδ )、 J 区和 C 区。 TCRβ 基因所含 V 区片段一般分为 24 个亚家族，而 TCRα 基因多分为 29 个亚家族。
TCR 基因的重排过程也与 Ig 基因重排相似。在前 T 细胞中， TCR 基因处于无功能的胚系结构状态，在前 T 细胞分化成熟为双阳性细胞的过程中， TCR 基因片段按限定的顺序进行重排，形成功能性 TCR ，重排的过程是 TCR 表达的先决条件。 TCR 重排过程首先由重组酶识别 RSS 而启动的。首先由随机的一个 D 区和一个 J 区发生重排，然后是随机的一个 V 区与已重排的 DJ 区发生重排，在 V-D 和 D-J 各基因片段连接的过程中，有不同数量的核苷酸( 3~24 个)随机的插入，称为 N 区，故在 V 区与 D 区、 D 区与 J 区的连接处，均有不同数量核苷酸的 N 区，形成了 V N ( D N ) J 的重排基因，同时，参加重排的 D 区基因片段可长可短，并不一定为整个 D 区的基因片段，最后，不参加重排的 C 区连接到 J 区上，形成一个完整的 TCR 基因 -V N D N JC 。 TCRα 和 TCRγ 基因不含有 D 区，故仅有 V 区与 J 区的重排。 V 区编码了 CDR1 、 CDR2 和部分 CDR3 ，在 V N ( D N ) J 的连接区，称为互补决定区 3 ( CDR3 )，它是识别抗原的区域，由于 N 区的插入和 D 区重排时的长短不一，即 CDR3 长度的多样性，构成了不同克隆的 T 细胞具有不同的 TCR-CDR3 序列，所以 TCR 的多样性并不仅仅依据各 V 、( D )、 J 区基因片段随机组合的数量，更与结合过程的多样性( CDR3 )有关，从而形成了 T 细胞识别不同抗原的高度多样性。通过分析 TCR 亚家族基因和重排的特点，就可以了解抗原特异的 TCR 基因序列。
? 抗原特异 T 细胞的确定
获得抗原特异 CTL 是实施靶向过继性免疫治疗的关键，它可由病人体内肿瘤抗原刺激而产生，也可经体外特定抗原诱导而获得，后者包括自体和异基因抗原诱导的特异 CTL 。体外诱导特异 CTL 的血液肿瘤抗原包括采用整个肿瘤细胞、肿瘤细胞凋亡产物、人工合成的多肽(融合基因、癌基因产物等)和独特型抗原等。利用肿瘤细胞或肿瘤细胞凋亡产物等诱导的 CTL ，由于存在多种肿瘤抗原或多个肿瘤抗原决定簇等情况，往往出现 1 个以上的 TCR Vα/Vβ 亚家族的 T 细胞扩增。越来越多的研究应用针对某一癌基因产物、融合基因产物或突变基因产物等等，而设计的人工合成 HLA 限制性多肽作为单一的抗原诱导特异性 T 细胞增殖。如融合多肽( bcr-abl 、 PML-RARα 、 AML1-MTG8 等)，直接或通过 DC 刺激 T 细胞，均有可能获得单一的抗原特异克隆性 CTL 。
克隆性 CTL 的分析可通过检测 TCR Vβ 亚家族基因谱系或四聚体( tetramer )分析而确定。利用 TCR Vβ 基因分析是基于每一克隆增殖 T 细胞均存在相同的 Vβ-Dβ-Jβ 重排，构成抗原特异的互补决定区 3 ( CDR3 )，经 RT-PCR 和基因扫描分析各 Vβ 亚家族 T 细胞的克隆性，确定单克隆增殖的 T 细胞，从而了解抗原特异 CTL 的分布。
? TCR 基因转导技术和抗原识别模式改构
体外实验和小鼠动物模型体内研究均显示抗原特异 CTL 具有靶向杀伤抗原负载肿瘤细胞的作用，提示了可以通过分选和扩增这些特异性的 TCRVβ 亚家族 T 细胞克隆应用于肿瘤或病毒感染等患者的免疫治疗，经体外的实验完全证实了这种可能性，但真正能用于病人治疗的方案却寥寥无几，其原因在于短时间内很难从患者的 T 细胞或患者白血病抗原诱导的异基因 T 细胞中获得足够数量的 CTL 用于治疗。所以，如何获得足够数量白血病抗原特异 CTL 是更为主要的问题。通过转导能够识别白血病、肿瘤或病毒抗原的 TCR 基因至正常 T 细胞中，使其强制性表达这种独特性 TCR ，改变 T 细胞内源性 TCR 识别抗原的原有模式，经过大量扩增后，有可能成为具备分泌细胞因子或特异杀伤靶细胞的功能，完成机体对抗原的免疫应答，可产生足够用于治疗的特异性 CTL 。
实际上，早在 1986 年已经报道第一个受鼠 T 细胞转导 MHC 限制性 TCRα 和 TCRβ 基因技术，但直到 1999 年才开始明确转导 TCR 基因的应用性：转导病毒或肿瘤抗原特异 TCR 基因，形成病毒或抗原特异 CTL 用于相应的免疫治疗。通过 T 细胞克隆性分析确定与肿瘤抗原相关的 T 细胞克隆所属的 TCR Vα 或 TCR Vβ 亚家族，序列分析确定其 CDR3 序列后，经各种转基因手段将此肿瘤抗原相关的 TCR Vα 或 TCR Vβ 基因( HLA 限制性)转导至外周血 T 细胞中，已有报道多种特异性 TCRα 和 TCRβ 基因的有效基因转导系统，目前绝大多数 TCR 转导技术均通过逆转录病毒载体而实现的 ......
暨南大学医学院血液病研究所 李扬秋 李 闯
获得性抗原特异免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗最为理想的方式之一，它不因病人自身的免疫活性而影响疗效，所输注特异性淋巴细胞可以有效靶向肿瘤相关抗原，后者由于免疫原性低不能引起有效的自体抗肿瘤 T 细胞免疫应答。由于分离和体外扩增抗原特异淋巴细胞的限制，传统的获得性免疫治疗仅仅限于某些特定研究中心的少数病人的应用。借助对抗原特异淋巴细胞的 T 细胞受体( TCR )基因分析结果，将 TCR 作为基因治疗分子而实施新的非传统性的获得性抗原特异免疫治疗正在研究中。
一、 T 细胞受体基因
T 细胞受体( TCR )是 T 细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子。 TCR 包括有 α 、 β 、 γ 和 δ 四种肽链，以两种形式存在，由二硫键连接形成异二聚体 α/β 或 γ/δ 蛋白链。在正常儿童和成人中，血液中的大部分 T 细胞表达 TCRαβ 异二聚体，而仅表达少量的 TCRγδ 分子。外周血中 TCRαβ + T 细胞占 90%~95% ，而 TCRγδ + T 细胞仅占 5%~10% 。
TCR 属免疫球蛋白超家族，与免疫球蛋白( Ig )的结构相似，具有抗原特异性的 V 区(可变区)和恒定区( C 区)。 TCR 识别抗原的特异性和多样性在于其 V 区的多样性，该多样性来自于 TCR 基因谱系和重排的特点。构成了 T 细胞对众多外来抗原的特异识别和产生免疫应答的巨大潜力。
TCR 基因的结构与 Ig 基因相似，在胚系中，编码 TCR 链的 DNA 是由多个分隔开的基因片段组成，在胸腺细胞发育过程中重排后，形成编码一条完整肽链的基因。每一个 TCR 胚系基因包括可变区( V 区)、结合区( J 区)和恒定区( C 区)等基因片段，在 TCRβ 和 TCRδ 基因中还包含多样区( D 区)。在 TCR 胚系基因的 5' 端包含不同数量的 V 区基因片段，并将其分成多个亚家族。此外，每个 TCR 胚系基因还包含不同数量的 D 区( TCRβ 和 TCRδ )、 J 区和 C 区。 TCRβ 基因所含 V 区片段一般分为 24 个亚家族，而 TCRα 基因多分为 29 个亚家族。
TCR 基因的重排过程也与 Ig 基因重排相似。在前 T 细胞中， TCR 基因处于无功能的胚系结构状态，在前 T 细胞分化成熟为双阳性细胞的过程中， TCR 基因片段按限定的顺序进行重排，形成功能性 TCR ，重排的过程是 TCR 表达的先决条件。 TCR 重排过程首先由重组酶识别 RSS 而启动的。首先由随机的一个 D 区和一个 J 区发生重排，然后是随机的一个 V 区与已重排的 DJ 区发生重排，在 V-D 和 D-J 各基因片段连接的过程中，有不同数量的核苷酸( 3~24 个)随机的插入，称为 N 区，故在 V 区与 D 区、 D 区与 J 区的连接处，均有不同数量核苷酸的 N 区，形成了 V N ( D N ) J 的重排基因，同时，参加重排的 D 区基因片段可长可短，并不一定为整个 D 区的基因片段，最后，不参加重排的 C 区连接到 J 区上，形成一个完整的 TCR 基因 -V N D N JC 。 TCRα 和 TCRγ 基因不含有 D 区，故仅有 V 区与 J 区的重排。 V 区编码了 CDR1 、 CDR2 和部分 CDR3 ，在 V N ( D N ) J 的连接区，称为互补决定区 3 ( CDR3 )，它是识别抗原的区域，由于 N 区的插入和 D 区重排时的长短不一，即 CDR3 长度的多样性，构成了不同克隆的 T 细胞具有不同的 TCR-CDR3 序列，所以 TCR 的多样性并不仅仅依据各 V 、( D )、 J 区基因片段随机组合的数量，更与结合过程的多样性( CDR3 )有关，从而形成了 T 细胞识别不同抗原的高度多样性。通过分析 TCR 亚家族基因和重排的特点，就可以了解抗原特异的 TCR 基因序列。
? 抗原特异 T 细胞的确定
获得抗原特异 CTL 是实施靶向过继性免疫治疗的关键，它可由病人体内肿瘤抗原刺激而产生，也可经体外特定抗原诱导而获得，后者包括自体和异基因抗原诱导的特异 CTL 。体外诱导特异 CTL 的血液肿瘤抗原包括采用整个肿瘤细胞、肿瘤细胞凋亡产物、人工合成的多肽(融合基因、癌基因产物等)和独特型抗原等。利用肿瘤细胞或肿瘤细胞凋亡产物等诱导的 CTL ，由于存在多种肿瘤抗原或多个肿瘤抗原决定簇等情况，往往出现 1 个以上的 TCR Vα/Vβ 亚家族的 T 细胞扩增。越来越多的研究应用针对某一癌基因产物、融合基因产物或突变基因产物等等，而设计的人工合成 HLA 限制性多肽作为单一的抗原诱导特异性 T 细胞增殖。如融合多肽( bcr-abl 、 PML-RARα 、 AML1-MTG8 等)，直接或通过 DC 刺激 T 细胞，均有可能获得单一的抗原特异克隆性 CTL 。
克隆性 CTL 的分析可通过检测 TCR Vβ 亚家族基因谱系或四聚体( tetramer )分析而确定。利用 TCR Vβ 基因分析是基于每一克隆增殖 T 细胞均存在相同的 Vβ-Dβ-Jβ 重排，构成抗原特异的互补决定区 3 ( CDR3 )，经 RT-PCR 和基因扫描分析各 Vβ 亚家族 T 细胞的克隆性，确定单克隆增殖的 T 细胞，从而了解抗原特异 CTL 的分布。
? TCR 基因转导技术和抗原识别模式改构
体外实验和小鼠动物模型体内研究均显示抗原特异 CTL 具有靶向杀伤抗原负载肿瘤细胞的作用，提示了可以通过分选和扩增这些特异性的 TCRVβ 亚家族 T 细胞克隆应用于肿瘤或病毒感染等患者的免疫治疗，经体外的实验完全证实了这种可能性，但真正能用于病人治疗的方案却寥寥无几，其原因在于短时间内很难从患者的 T 细胞或患者白血病抗原诱导的异基因 T 细胞中获得足够数量的 CTL 用于治疗。所以，如何获得足够数量白血病抗原特异 CTL 是更为主要的问题。通过转导能够识别白血病、肿瘤或病毒抗原的 TCR 基因至正常 T 细胞中，使其强制性表达这种独特性 TCR ，改变 T 细胞内源性 TCR 识别抗原的原有模式，经过大量扩增后，有可能成为具备分泌细胞因子或特异杀伤靶细胞的功能，完成机体对抗原的免疫应答，可产生足够用于治疗的特异性 CTL 。
实际上，早在 1986 年已经报道第一个受鼠 T 细胞转导 MHC 限制性 TCRα 和 TCRβ 基因技术，但直到 1999 年才开始明确转导 TCR 基因的应用性：转导病毒或肿瘤抗原特异 TCR 基因，形成病毒或抗原特异 CTL 用于相应的免疫治疗。通过 T 细胞克隆性分析确定与肿瘤抗原相关的 T 细胞克隆所属的 TCR Vα 或 TCR Vβ 亚家族，序列分析确定其 CDR3 序列后，经各种转基因手段将此肿瘤抗原相关的 TCR Vα 或 TCR Vβ 基因( HLA 限制性)转导至外周血 T 细胞中，已有报道多种特异性 TCRα 和 TCRβ 基因的有效基因转导系统，目前绝大多数 TCR 转导技术均通过逆转录病毒载体而实现的 ......
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