人骨髓间质干细胞向成骨细胞诱导分化条件的建立
摘要：目的：探讨体外诱导培养人骨髓间质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的方法和技术，为骨组织工程研究提供理想的种子细胞。方法：抽取无系统疾病自愿捐献骨髓患者的骨髓，体外分离诱导培养BMSCs，按照诱导条件加入时间的先后次序分为早期诱导组(A组)和延迟诱导组(B组)，镜下观察2组细胞形态学变化，计算倍增时间，并测定2组骨钙素的含量和Ⅰ型胶原的表达，研究该细胞生物学特性及其体外成骨能力。结果：(1) 镜下观察：A组细胞贴壁，呈菱形，5～7 d融合，成纤维细胞集落样生长;B组细胞贴壁，呈梭形，3~5 d融合，呈指纹状生长方式。(2) 倍增时间：A组第1、2、3、4代倍增时间分别为18.86、17.45、18.71、20.99 h；B组第1、2、3代倍增时间分别为17.54、19.59、25.46 h，第4代停止生长，2组各代倍增时间差异均有统计学意义(P<0.05)。(3) 骨钙素:A组各代均可检测到骨钙素，Ⅰ型胶原自原代就有阳性表达，第3、4代细胞达到最强；B组原代、第1代细胞中未检测到骨钙素，诱导后才分泌骨钙素，I型胶原各代均有阳性表达，但不均匀，第4代细胞停止增殖，无阳性表达。结论：应用成骨细胞条件培养液在体外能够促进人BMSCs向成骨细胞分化，验证了BMSCs是一种比较理想的骨组织工程种子细胞。早期诱导是较为完善的体外诱导培养条件和方法。
关键词： 组织工程；种子细胞；人骨髓间质干细胞
The foundation of the conditions of inducing human BMSCs into osteoblasts
LI Jing, HE Huiyu, ZHANG Baowei
(Depantment of Orthodontics, School of Stomatology, Ninth People′s Hospital, Shanghai Jiao Tong University. Shanghai 200011, China)
Abstract: Objective: To investigate the techniques of inducing human bone marrow mesenchmal stem cells (BMSCs) into osteoblasts, in order to provide ideal seed cells for tissue engineering. Methods: Bone marrow was aspirated from volunteer without systematic disease. Which was separated and induced into osteoblasts in vitro according to the sequence of adding the inducible media, two groups were divided: the early induced group and later induced group. To observe their changes of morphology cytokinetics and measuring type I collagen immunology chemistry Von Kcossa, etc. And the BMSCs were respectively term of their cytobiological properties and osteogeneic activity. Results: Observing the early induced group on the microscope, the BMSCs were composed of diamondshaped cells and approached nearly confluence in 5~7 days formed characteristic colonies of fibroblast unit formation. With the same way observing the later induced group on the microscope, the BMSCs were composed of spindleshaped cells and approached nearly confluence in 3~5 days formed characteristic colonies of finger print shape. The doubling time of group A from generation Ⅰ to Ⅳ were 18.86 h, 17.45 h, 18.71 h and 20.99h respectively. The doubling time of group B from generation Ⅰ to Ⅲ were 17.54 h, 19.59 h, 25.46 h respectively. The passage Ⅳ ceased to growing. There was different obviously in doubling time of the every passage of two groups, osteocacin could be detected in every passage. Type Ⅰ collagen had positive expression on the primary passage Ⅲ and passage Ⅳ access to the climax. Osteocacin could not be detected in the primary and passage Ⅰ, but could be detected after being induced. Type Ⅰ collagen expressed in each passage but uneven. The passage Ⅳ ceased to generation without positive expressed. Conclusion: The usage of inducible media can promote the BMSCs differentiation of osteoblasts and indicates that BMSCs is a kind of ideal seed cells for boning tissue engineering. Inducing earlier is a consummate condition and method of culturing and inducing in vitro.
Key words: tissue engineering; seed cells; human bone marrow mesenchymal stem cells
实验表明骨髓中存在的骨髓间质干细胞(BMSCs)是一类具有多向分化潜能的细胞，在不同的条件诱导下可以分化为成骨系细胞、成纤维系细胞、脂肪细胞、网状细胞、肌细胞和神经细胞等多种细胞，通过选择合适的培养条件，BMSCs经过体外培养诱导可分化为确定性骨祖细胞[1~3]。但由于所采用的培养方法存在差异，尚不能证明所分离出的细胞是否为相同细胞，细胞的分离和克隆、体外培养条件等诸多因素均可能导致这些细胞失去原先存在的多向分化特性[4]。本实验采用不同培养方法在体外对人BMSCs进行培养，并进行比较，以探讨较为完善的体外诱导培养BMSCs条件和方法。
1材料与方法
1.1主要试剂(1)基础培养基：低糖DMEM培养基(Gibco公司)，10%FBS(HyClone公司)，100U/ml青链霉素；放免试剂盒(BGP RIA Kit，解放军总医院科技开发中心放免所)；Percoll分离液，比重1.13(Sigma公司)；ABC试剂盒(上海华美生物工程公司)。(2)条件培养基：基础培养基中加入10-8 mol/L地塞米松(Phoenix公司)、2.16g/L β磷酸甘油(Sigma公司)、10-8 mol/L 1,25二羟维生素D3 (Sigma公司)。
1.2方法
1.2.1骨髓单核细胞的分离骨髓来源于上海交通大学附属第九人民医院整形外科自愿捐献骨髓并无系统疾病患者20例，性别不限。常规消毒铺巾，2.5%利多卡因局部麻醉后自髂前上棘缓慢抽取2～5 ml骨髓，立即注入15 ml离心管中(离心管中预置10 ml无血清DMEM肝素液，浓度为100 U/ml)。将骨髓DMEM混合液沿管壁缓慢滴加入预置Percoll分离液的离心管中，骨髓与分离液的比例为1∶2，离心15～20 min，吸取中间层云雾状细胞层，PBS清洗3次，离心后弃上清获取有核细胞。
1.2.2细胞培养的实验分组设计将分离得到的有核细胞计数，以1×106/cm2的密度接种于直径100 mm培养皿中，细胞培养根据诱导条件加入的时间不同分为2组。A组为早期诱导组，原代培养就加入条件培养基(含有地塞米松的成骨细胞条件培养液)；B组为延迟诱导组，先用基础培养基培养，待培养至第2代时再换成条件培养基培养。细胞均置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天换液1次，当细胞在培养皿中生长达到70%~80%融合时，用0.25%胰酶消化，以1∶3比例传代，继续培养。
1.2.3倍增时间的计算随机选取3个细胞样本，以相同的骨髓抽取量、初始接种密度、培养条件(包括培养皿、培养液、培养箱)同时进行体外的诱导培养，分别记录第1~4代细胞的生长时间、传代前的细胞总量，计算出每代细胞的倍增时间(TD)，并且对各代细胞的倍增时间进行统计学分析，TD=t·log2/(logNt-logNo)，其中t代表培养时间，No及Nt分别代表接种后及培养t小时后的细胞数，根据公式得出细胞的倍增时间TD。
1.2.4骨钙素及Ⅰ型胶原的测定(1)骨钙素:分别收集第1~4代细胞的培养液，按照放免试剂盒的测定方法测定骨钙素的含量。(2)Ⅰ型胶原：细胞接种于预制盖玻片，细胞贴附生长后3 d，95%丙酮固定，按ABC试剂盒的操作程序,采用免疫组化法测定经诱导的BMSCs的Ⅰ型胶原表达，以人皮肤的成纤维细胞作为阳性对照。
1.3统计学处理采用方差分析比较2组的细胞各代倍增时间及骨钙素含量，检验水准α=0.05。
2结果
2.1倒置相差显微镜观察A组接种后8 h左右，细胞开始贴壁，呈菱形，散在分布。B组接种后4～6 h细胞开始贴壁，呈梭形，2组细胞大小相似，细胞核均可见，核仁不明显。3 d后，A组可见细胞呈成纤维细胞样集落生长(CFUF)(图1)，B组细胞生长呈现“指纹状”趋势(图2)。A组5～7 d达到80%融合，B组3～5 d达到80%融合。B组第2代细胞达到一定数量时加入条件培养液后，细胞的扩增速度明显比A组慢，同时细胞体积变大，形态变为多边形。A组细胞生长密集处可见叠层生长现象，其第2代细胞分裂逐渐活跃，细胞外基质分泌旺盛，局部细胞相互连接成膜状；第3、4代细胞局部呈叠层生长状态，出现钙结节(图3)；第5、6代细胞体积增大，核浆比例增大，死亡细胞增多。
2.2细胞倍增时间A组第1、2、3、4代细胞倍增时间分别为18.86、17.45、18.71、20.99 h；B组第1、2、3代细胞倍增时间分别为17.54、19.59、25.46 h，至第4代时，细胞停止生长。2组细胞各代倍增时间差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表12组细胞各代倍增时间的比较(略)
2.3细胞骨钙素的测定A组自第1代即有骨钙素的分泌，各代间差异无统计学意义(F=-0.445, P>0.05);B组在原代和第1代未经诱导时无骨钙素分泌，自第2代开始诱导后可检测到骨钙素的分泌,各代间差异有统计学意义(F=93.645, P<0.05)。2组各代细胞骨钙素含量差异均有统计学意义(F=8.587, P<0.05)(表2)。
2.4Ⅰ型胶原的表达A组自原代开始逐渐有I型胶原表达(图4～6)，第3、4代细胞达到最强，出现钙结节(图7)，到第6代逐渐减弱。B组在第1、2代时，部分细胞有阳性表达，但不均匀(图8)，第3代细胞仍有阳性表达，至第4代细胞停止增殖，无阳性表达。
表22组各代细胞骨钙素含量的比较(略)
图1A组细胞初贴壁CFUF(4×10)(略)
图2B组细胞初贴壁呈“指纹状”(4×10)(略)
图3A组第3、4代细胞出现钙结节(4×10)(略)
图4A组免疫组化的空白对照(4×10)(略)
图5A组成纤维细胞I型胶原阳性对照(4×10)(略)
图6A组第1代细胞Ⅰ型胶原阳性表达(4×10)(略)
图7A组第3、4代细胞I型胶原阳性表达(4×10)(略)
图8B组第1代细胞I型胶原阳性表达(4×10)(略)
3讨论
到目前为止，骨组织工程中种子细胞来源一直是该领域研究关注的焦点。1976年，Friedenstein[5]将骨祖细胞分为确定性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC)和诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursor cells,IOPC)，其中DOPC主要存在于骨髓基质、骨内膜、骨外膜及骨骺板中，不需要任何诱导因子的参与，可以适应机体生长发育和再生修复的需要，并能自动分化为成骨细胞；而IOPC是非生骨区的间充质细胞，广泛分布于体内的许多组织，包括骨髓淋巴生成器官中的基质细胞、毛细血管周细胞、内皮细胞、成纤维细胞及星状细胞等，不能自发向成骨细胞转化，只有施加一定的诱导因素后，才能向成骨细胞转化[6]。体外分离培养成骨细胞多以DOPC所在部位为主要取材处，如骨髓、骨膜、胚胎细胞或新生骨等，其中自骨髓中取材创伤最小。骨髓分造血系细胞和基质系细胞两大系统，其成骨能力主要来源于基质细胞系。存在于基质细胞中的BMSCs是一类具有多向分化潜能的细胞，通过选择合适的培养条件，BMSCs在体外经过诱导培养后可分化为DOPC。体外培养BMSCs使其增殖并向成骨细胞分化，主要依赖于一定的培养条件,因此控制好培养条件就成为体外诱导分化为成骨细胞的关键[7]。本实验分别采用早期诱导与延迟诱导的方法，比较2种条件对BMSCs向成骨细胞分化的影响，目的在于优化培养条件，探索出最佳的诱导培养方法。研究结果表明，A组在分离出骨髓中的单核细胞后，如果仅在基础培养基的条件下，存在培养细胞间细胞污染问题[8]：体外培养获得的骨髓基质细胞集落由多种细胞群体组成，即间质干细胞和各种祖细胞，具有多种分化潜能，可向成骨细胞系、成纤维细胞系、成脂肪细胞系等分化，仍需进一步纯化。B组细胞贴壁早，增殖较快，但从倒置显微镜下观察到细胞呈“指纹状”生长，这是成纤维细胞的典型生长方式，Ⅰ型胶原的检测结果提示，细胞在快速分裂增殖的同时，分泌功能较为旺盛。但是当第2代细胞达一定的数量加入条件培养液后，细胞形态由梭形变为多角形，在细胞体积变大的同时，增殖速度减慢，并且出现较多的死亡细胞。分析其原因，可能是诱导因素对细胞的选择作用使不适应的细胞无法维持生存，同时诱导作用使细胞向成骨细胞方向分化。本实验所采用的成骨细胞条件培养液主要由以下成分组成：10%胎牛血清、低糖的DMEM培养基、地塞米松、维生素C(VitC)、β磷酸甘油、1,25(OH)2维生素D3(VitD3)等，每种成分对BMSCs的增殖分化都起到一定的作用：血清对促进细胞生长与抑制生长活性是相对平衡的，但是对大多数细胞，血清并不是原始组织接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触，在此情况下，血清可促进成纤维细胞生长而抑制表皮角质细胞的生长[9]；地塞米松可促进BMSCs向成骨细胞分化，刺激其碱性磷酸酶活性，使骨钙素、骨涎蛋白和骨桥蛋白的合成明显增加，但是地塞米松还能激活BMSCs表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，从而会减少向DOPC分化的相对比例；β磷酸甘油可提供磷离子作为碱性磷酸酶的底物，促进有机磷向无机磷转化，加速生理性钙盐沉积，使钙结节增多；VitC不仅可以促进细胞贴壁，还可促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，也能调节三磷酸腺苷(ATP)和碱性磷酸酶(ALP)活性，并影响其合成；成骨细胞有1,25(OH)2 VitD3的受体，1,25(OH)2 VitD3的主要作用是直接作用于细胞膜的受体，调节细胞对钙离子的转运，促进钙磷代谢，在诱导培养液中加入1,25(OH)2 VitD3能促进BMSCs向成骨细胞转化，同时抑制软骨细胞的分化，并维持成骨细胞的分泌与代谢活动，这是重要的诱导条件之一[10]。由于BMSCs仅占骨髓有核细胞的1/20,000～1/30,000[11]，从骨髓中直接得到的BMSCs数量较少，进行体外培养的目的是希望模拟体内细胞生存环境，促使细胞大量扩增。A组细胞早期加入诱导条件，细胞所处环境由体内骨髓腔到体外明显改变，原代细胞增殖较慢，第2代细胞增殖最快，第3代与第1代增殖速率相近，随着代次增加，细胞的增殖有逐渐变慢的趋势。镜下观察到在第3代以后的A组细胞集落中呈现出强反射的透亮区和肉眼可见的白色斑块，提示有钙结节形成，由于在体细胞中除了成牙本质细胞、牙骨质细胞外，只有成骨细胞具有分泌钙质的能力[12] ，表明经诱导后，细胞具有了一定的成骨细胞特性。B组细胞贴壁早于A组，原代细胞增殖较A组快，第2代细胞加入诱导条件后，细胞的扩增速度明显比A组慢，第4代细胞逐渐停止增殖。B组未经诱导的细胞中未检测到骨钙素的分泌，加入诱导因素后，其检测到的骨钙素含量明显低于A组细胞。2组各代细胞的倍增时间、骨钙素含量差异有统计学意义。综上所述，A组的培养方法能将骨髓间质干细胞经过一段时间的体外培养，达到骨组织工程的需要，是相对较为理想的培养方法。
参考文献：
[1]Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering[J]. Science,1993,260(14):920926.
[2]Flaming JE, Cornell CN, Muschler GF. Bone cells and materices in orthopedic tissue engineering[J]. Orthop Clin North Am,2000,31(3):357374.
[3]Kon E, Muraglia A, Corsi A, et al. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelarated bone repair in criticalsize defects of sheep long bones[J]. Biomed Mater Res,2000,49:328337.
[4]成令忠. 组织学[M].第2版. 北京: 人民卫生出版社，1993.296313.
[5]Friedenstein A. Precursor cells of mechonocytes[J]. In Rev Cytol,1976,47(3):327.
[6]Tencate AR. 张国成译. 口腔组织学发育构造功能[M]. 台湾:合记图书出版社,1976.109128.
[7]李秀森，郭子宽，杨靖清, 等. 骨髓间充质干细胞的生物学特性[J]. 解放军医学杂志，2000，25(5)：346348.
[8]Long MW, Robinson JA, Ashcraft EA, et al. Regulation of human bone marrowderived osteoprogenitor cells by osteogenic growth factors[J]. J Clin Invest, 1995, 95(2):881.
[9]弗雷什尼 RI. 潘李珍译. 实用动物细胞培养技术[M]. 北京: 世界图书出版公司, 1996.3537.
[10]Jensen SS, Aaboe M, Pinholt EM, et al. Tissue reaction and material characteristics of four bone substitutes[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 1996,11:5566.
[11]Kassem M, Risteli L, Mosekilde L, et al. Formation of osteoblastlike cells from human mononuclear bone marrow cultures[J]. APMIS，1991, 99(3):269274.
[12]Gartner LP, Hiatt JL. Color Atlas of Histology[M]. 3rd ed. Lippincott: Williams & Wilkins,2000. 8082.
基金项目：上海市重点学科(特色学科)建设项目资助(T0202)
(上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海200011; 新疆医科大学第一附属医院口腔科， 新疆乌鲁木齐830054), http://www.100md.com(李静, 何惠宇， 张保卫)
关键词： 组织工程；种子细胞；人骨髓间质干细胞
The foundation of the conditions of inducing human BMSCs into osteoblasts
LI Jing, HE Huiyu, ZHANG Baowei
(Depantment of Orthodontics, School of Stomatology, Ninth People′s Hospital, Shanghai Jiao Tong University. Shanghai 200011, China)
Abstract: Objective: To investigate the techniques of inducing human bone marrow mesenchmal stem cells (BMSCs) into osteoblasts, in order to provide ideal seed cells for tissue engineering. Methods: Bone marrow was aspirated from volunteer without systematic disease. Which was separated and induced into osteoblasts in vitro according to the sequence of adding the inducible media, two groups were divided: the early induced group and later induced group. To observe their changes of morphology cytokinetics and measuring type I collagen immunology chemistry Von Kcossa, etc. And the BMSCs were respectively term of their cytobiological properties and osteogeneic activity. Results: Observing the early induced group on the microscope, the BMSCs were composed of diamondshaped cells and approached nearly confluence in 5~7 days formed characteristic colonies of fibroblast unit formation. With the same way observing the later induced group on the microscope, the BMSCs were composed of spindleshaped cells and approached nearly confluence in 3~5 days formed characteristic colonies of finger print shape. The doubling time of group A from generation Ⅰ to Ⅳ were 18.86 h, 17.45 h, 18.71 h and 20.99h respectively. The doubling time of group B from generation Ⅰ to Ⅲ were 17.54 h, 19.59 h, 25.46 h respectively. The passage Ⅳ ceased to growing. There was different obviously in doubling time of the every passage of two groups, osteocacin could be detected in every passage. Type Ⅰ collagen had positive expression on the primary passage Ⅲ and passage Ⅳ access to the climax. Osteocacin could not be detected in the primary and passage Ⅰ, but could be detected after being induced. Type Ⅰ collagen expressed in each passage but uneven. The passage Ⅳ ceased to generation without positive expressed. Conclusion: The usage of inducible media can promote the BMSCs differentiation of osteoblasts and indicates that BMSCs is a kind of ideal seed cells for boning tissue engineering. Inducing earlier is a consummate condition and method of culturing and inducing in vitro.
Key words: tissue engineering; seed cells; human bone marrow mesenchymal stem cells
实验表明骨髓中存在的骨髓间质干细胞(BMSCs)是一类具有多向分化潜能的细胞，在不同的条件诱导下可以分化为成骨系细胞、成纤维系细胞、脂肪细胞、网状细胞、肌细胞和神经细胞等多种细胞，通过选择合适的培养条件，BMSCs经过体外培养诱导可分化为确定性骨祖细胞[1~3]。但由于所采用的培养方法存在差异，尚不能证明所分离出的细胞是否为相同细胞，细胞的分离和克隆、体外培养条件等诸多因素均可能导致这些细胞失去原先存在的多向分化特性[4]。本实验采用不同培养方法在体外对人BMSCs进行培养，并进行比较，以探讨较为完善的体外诱导培养BMSCs条件和方法。
1材料与方法
1.1主要试剂(1)基础培养基：低糖DMEM培养基(Gibco公司)，10%FBS(HyClone公司)，100U/ml青链霉素；放免试剂盒(BGP RIA Kit，解放军总医院科技开发中心放免所)；Percoll分离液，比重1.13(Sigma公司)；ABC试剂盒(上海华美生物工程公司)。(2)条件培养基：基础培养基中加入10-8 mol/L地塞米松(Phoenix公司)、2.16g/L β磷酸甘油(Sigma公司)、10-8 mol/L 1,25二羟维生素D3 (Sigma公司)。
1.2方法
1.2.1骨髓单核细胞的分离骨髓来源于上海交通大学附属第九人民医院整形外科自愿捐献骨髓并无系统疾病患者20例，性别不限。常规消毒铺巾，2.5%利多卡因局部麻醉后自髂前上棘缓慢抽取2～5 ml骨髓，立即注入15 ml离心管中(离心管中预置10 ml无血清DMEM肝素液，浓度为100 U/ml)。将骨髓DMEM混合液沿管壁缓慢滴加入预置Percoll分离液的离心管中，骨髓与分离液的比例为1∶2，离心15～20 min，吸取中间层云雾状细胞层，PBS清洗3次，离心后弃上清获取有核细胞。
1.2.2细胞培养的实验分组设计将分离得到的有核细胞计数，以1×106/cm2的密度接种于直径100 mm培养皿中，细胞培养根据诱导条件加入的时间不同分为2组。A组为早期诱导组，原代培养就加入条件培养基(含有地塞米松的成骨细胞条件培养液)；B组为延迟诱导组，先用基础培养基培养，待培养至第2代时再换成条件培养基培养。细胞均置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天换液1次，当细胞在培养皿中生长达到70%~80%融合时，用0.25%胰酶消化，以1∶3比例传代，继续培养。
1.2.3倍增时间的计算随机选取3个细胞样本，以相同的骨髓抽取量、初始接种密度、培养条件(包括培养皿、培养液、培养箱)同时进行体外的诱导培养，分别记录第1~4代细胞的生长时间、传代前的细胞总量，计算出每代细胞的倍增时间(TD)，并且对各代细胞的倍增时间进行统计学分析，TD=t·log2/(logNt-logNo)，其中t代表培养时间，No及Nt分别代表接种后及培养t小时后的细胞数，根据公式得出细胞的倍增时间TD。
1.2.4骨钙素及Ⅰ型胶原的测定(1)骨钙素:分别收集第1~4代细胞的培养液，按照放免试剂盒的测定方法测定骨钙素的含量。(2)Ⅰ型胶原：细胞接种于预制盖玻片，细胞贴附生长后3 d，95%丙酮固定，按ABC试剂盒的操作程序,采用免疫组化法测定经诱导的BMSCs的Ⅰ型胶原表达，以人皮肤的成纤维细胞作为阳性对照。
1.3统计学处理采用方差分析比较2组的细胞各代倍增时间及骨钙素含量，检验水准α=0.05。
2结果
2.1倒置相差显微镜观察A组接种后8 h左右，细胞开始贴壁，呈菱形，散在分布。B组接种后4～6 h细胞开始贴壁，呈梭形，2组细胞大小相似，细胞核均可见，核仁不明显。3 d后，A组可见细胞呈成纤维细胞样集落生长(CFUF)(图1)，B组细胞生长呈现“指纹状”趋势(图2)。A组5～7 d达到80%融合，B组3～5 d达到80%融合。B组第2代细胞达到一定数量时加入条件培养液后，细胞的扩增速度明显比A组慢，同时细胞体积变大，形态变为多边形。A组细胞生长密集处可见叠层生长现象，其第2代细胞分裂逐渐活跃，细胞外基质分泌旺盛，局部细胞相互连接成膜状；第3、4代细胞局部呈叠层生长状态，出现钙结节(图3)；第5、6代细胞体积增大，核浆比例增大，死亡细胞增多。
2.2细胞倍增时间A组第1、2、3、4代细胞倍增时间分别为18.86、17.45、18.71、20.99 h；B组第1、2、3代细胞倍增时间分别为17.54、19.59、25.46 h，至第4代时，细胞停止生长。2组细胞各代倍增时间差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表12组细胞各代倍增时间的比较(略)
2.3细胞骨钙素的测定A组自第1代即有骨钙素的分泌，各代间差异无统计学意义(F=-0.445, P>0.05);B组在原代和第1代未经诱导时无骨钙素分泌，自第2代开始诱导后可检测到骨钙素的分泌,各代间差异有统计学意义(F=93.645, P<0.05)。2组各代细胞骨钙素含量差异均有统计学意义(F=8.587, P<0.05)(表2)。
2.4Ⅰ型胶原的表达A组自原代开始逐渐有I型胶原表达(图4～6)，第3、4代细胞达到最强，出现钙结节(图7)，到第6代逐渐减弱。B组在第1、2代时，部分细胞有阳性表达，但不均匀(图8)，第3代细胞仍有阳性表达，至第4代细胞停止增殖，无阳性表达。
表22组各代细胞骨钙素含量的比较(略)
图1A组细胞初贴壁CFUF(4×10)(略)
图2B组细胞初贴壁呈“指纹状”(4×10)(略)
图3A组第3、4代细胞出现钙结节(4×10)(略)
图4A组免疫组化的空白对照(4×10)(略)
图5A组成纤维细胞I型胶原阳性对照(4×10)(略)
图6A组第1代细胞Ⅰ型胶原阳性表达(4×10)(略)
图7A组第3、4代细胞I型胶原阳性表达(4×10)(略)
图8B组第1代细胞I型胶原阳性表达(4×10)(略)
3讨论
到目前为止，骨组织工程中种子细胞来源一直是该领域研究关注的焦点。1976年，Friedenstein[5]将骨祖细胞分为确定性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC)和诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursor cells,IOPC)，其中DOPC主要存在于骨髓基质、骨内膜、骨外膜及骨骺板中，不需要任何诱导因子的参与，可以适应机体生长发育和再生修复的需要，并能自动分化为成骨细胞；而IOPC是非生骨区的间充质细胞，广泛分布于体内的许多组织，包括骨髓淋巴生成器官中的基质细胞、毛细血管周细胞、内皮细胞、成纤维细胞及星状细胞等，不能自发向成骨细胞转化，只有施加一定的诱导因素后，才能向成骨细胞转化[6]。体外分离培养成骨细胞多以DOPC所在部位为主要取材处，如骨髓、骨膜、胚胎细胞或新生骨等，其中自骨髓中取材创伤最小。骨髓分造血系细胞和基质系细胞两大系统，其成骨能力主要来源于基质细胞系。存在于基质细胞中的BMSCs是一类具有多向分化潜能的细胞，通过选择合适的培养条件，BMSCs在体外经过诱导培养后可分化为DOPC。体外培养BMSCs使其增殖并向成骨细胞分化，主要依赖于一定的培养条件,因此控制好培养条件就成为体外诱导分化为成骨细胞的关键[7]。本实验分别采用早期诱导与延迟诱导的方法，比较2种条件对BMSCs向成骨细胞分化的影响，目的在于优化培养条件，探索出最佳的诱导培养方法。研究结果表明，A组在分离出骨髓中的单核细胞后，如果仅在基础培养基的条件下，存在培养细胞间细胞污染问题[8]：体外培养获得的骨髓基质细胞集落由多种细胞群体组成，即间质干细胞和各种祖细胞，具有多种分化潜能，可向成骨细胞系、成纤维细胞系、成脂肪细胞系等分化，仍需进一步纯化。B组细胞贴壁早，增殖较快，但从倒置显微镜下观察到细胞呈“指纹状”生长，这是成纤维细胞的典型生长方式，Ⅰ型胶原的检测结果提示，细胞在快速分裂增殖的同时，分泌功能较为旺盛。但是当第2代细胞达一定的数量加入条件培养液后，细胞形态由梭形变为多角形，在细胞体积变大的同时，增殖速度减慢，并且出现较多的死亡细胞。分析其原因，可能是诱导因素对细胞的选择作用使不适应的细胞无法维持生存，同时诱导作用使细胞向成骨细胞方向分化。本实验所采用的成骨细胞条件培养液主要由以下成分组成：10%胎牛血清、低糖的DMEM培养基、地塞米松、维生素C(VitC)、β磷酸甘油、1,25(OH)2维生素D3(VitD3)等，每种成分对BMSCs的增殖分化都起到一定的作用：血清对促进细胞生长与抑制生长活性是相对平衡的，但是对大多数细胞，血清并不是原始组织接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触，在此情况下，血清可促进成纤维细胞生长而抑制表皮角质细胞的生长[9]；地塞米松可促进BMSCs向成骨细胞分化，刺激其碱性磷酸酶活性，使骨钙素、骨涎蛋白和骨桥蛋白的合成明显增加，但是地塞米松还能激活BMSCs表面的糖皮质激素受体，使其向脂肪细胞分化，从而会减少向DOPC分化的相对比例；β磷酸甘油可提供磷离子作为碱性磷酸酶的底物，促进有机磷向无机磷转化，加速生理性钙盐沉积，使钙结节增多；VitC不仅可以促进细胞贴壁，还可促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，也能调节三磷酸腺苷(ATP)和碱性磷酸酶(ALP)活性，并影响其合成；成骨细胞有1,25(OH)2 VitD3的受体，1,25(OH)2 VitD3的主要作用是直接作用于细胞膜的受体，调节细胞对钙离子的转运，促进钙磷代谢，在诱导培养液中加入1,25(OH)2 VitD3能促进BMSCs向成骨细胞转化，同时抑制软骨细胞的分化，并维持成骨细胞的分泌与代谢活动，这是重要的诱导条件之一[10]。由于BMSCs仅占骨髓有核细胞的1/20,000～1/30,000[11]，从骨髓中直接得到的BMSCs数量较少，进行体外培养的目的是希望模拟体内细胞生存环境，促使细胞大量扩增。A组细胞早期加入诱导条件，细胞所处环境由体内骨髓腔到体外明显改变，原代细胞增殖较慢，第2代细胞增殖最快，第3代与第1代增殖速率相近，随着代次增加，细胞的增殖有逐渐变慢的趋势。镜下观察到在第3代以后的A组细胞集落中呈现出强反射的透亮区和肉眼可见的白色斑块，提示有钙结节形成，由于在体细胞中除了成牙本质细胞、牙骨质细胞外，只有成骨细胞具有分泌钙质的能力[12] ，表明经诱导后，细胞具有了一定的成骨细胞特性。B组细胞贴壁早于A组，原代细胞增殖较A组快，第2代细胞加入诱导条件后，细胞的扩增速度明显比A组慢，第4代细胞逐渐停止增殖。B组未经诱导的细胞中未检测到骨钙素的分泌，加入诱导因素后，其检测到的骨钙素含量明显低于A组细胞。2组各代细胞的倍增时间、骨钙素含量差异有统计学意义。综上所述，A组的培养方法能将骨髓间质干细胞经过一段时间的体外培养，达到骨组织工程的需要，是相对较为理想的培养方法。
参考文献：
[1]Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering[J]. Science,1993,260(14):920926.
[2]Flaming JE, Cornell CN, Muschler GF. Bone cells and materices in orthopedic tissue engineering[J]. Orthop Clin North Am,2000,31(3):357374.
[3]Kon E, Muraglia A, Corsi A, et al. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelarated bone repair in criticalsize defects of sheep long bones[J]. Biomed Mater Res,2000,49:328337.
[4]成令忠. 组织学[M].第2版. 北京: 人民卫生出版社，1993.296313.
[5]Friedenstein A. Precursor cells of mechonocytes[J]. In Rev Cytol,1976,47(3):327.
[6]Tencate AR. 张国成译. 口腔组织学发育构造功能[M]. 台湾:合记图书出版社,1976.109128.
[7]李秀森，郭子宽，杨靖清, 等. 骨髓间充质干细胞的生物学特性[J]. 解放军医学杂志，2000，25(5)：346348.
[8]Long MW, Robinson JA, Ashcraft EA, et al. Regulation of human bone marrowderived osteoprogenitor cells by osteogenic growth factors[J]. J Clin Invest, 1995, 95(2):881.
[9]弗雷什尼 RI. 潘李珍译. 实用动物细胞培养技术[M]. 北京: 世界图书出版公司, 1996.3537.
[10]Jensen SS, Aaboe M, Pinholt EM, et al. Tissue reaction and material characteristics of four bone substitutes[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 1996,11:5566.
[11]Kassem M, Risteli L, Mosekilde L, et al. Formation of osteoblastlike cells from human mononuclear bone marrow cultures[J]. APMIS，1991, 99(3):269274.
[12]Gartner LP, Hiatt JL. Color Atlas of Histology[M]. 3rd ed. Lippincott: Williams & Wilkins,2000. 8082.
基金项目：上海市重点学科(特色学科)建设项目资助(T0202)
(上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海200011; 新疆医科大学第一附属医院口腔科， 新疆乌鲁木齐830054), http://www.100md.com(李静, 何惠宇， 张保卫)