亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T和A1298C多态与胃癌的遗传易感性
[摘要]目的：探讨代谢叶酸的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因单核苷酸多态与胃癌风险的关系。方法：以聚合酶链反应和限制性片段长度多态方法分析170例胃癌病人和性别、年龄配对的140例正常对照者的MTHFR基因C677T和A1298C基因型及其与胃癌风险的相关性。结果：在正常对照中，MTHFR基因677CC、CT、TT基因型频率分别为47.9%、40%和12.1%，而在胃癌病人中分别为35.9%、45.9%和18.2%。在病例组中677(CT+TT)变异型基因者占64.1%，显著高于对照组中的52.1%，差异具有显著意义(χ2=4.54，P <0.05)。与677CC基因型者相比,变异型基因者和TT型基因者发生胃癌的危险性分别高1.67倍(OR为1.67,95%CI为1.06~2.64)和2.67倍(OR为2.67,95%CI为1.382~5.341)。A1298C基因型在病例和对照中的分布差异无显著性意义。但进一步分析发现，1298变异基因型与677变异基因型之间有协同作用。携带MTHFR 677TT/1298AC基因型个体发生胃癌的风险是携带MTHFR 677CC/1298AA基因型个体的3.684倍 (95%CI为 0.829～25.776)。结论： MTHFR单核苷酸多态是胃癌的遗传易感性因素。
[关键词]胃癌；单核苷酸多态性；亚甲基四氢叶酸还原酶基因；疾病易感性
DNA 甲基化是基因表达，DNA 的稳定性、完整性和诱变的重要决定因素，染色体和DNA甲基化异常都是可遗传的，是导致基因组不稳定性而引发肿瘤的重要机制[1]。相关研究表明，细胞内低甲基化是胃癌形成的一个重要原因，亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多态会影响叶酸在体内的正常代谢，造成甲基不足，从而促进胃癌的产生，国内外刊物报道了此方面进行的一些研究。MTHFR基因在总的人群中呈高度多态性，在其编码区有2个常见的单核苷酸多态,即C677T 和A1298C，前者位于催化区而后者位于活性调节区 [2]。作者对江苏南京地区的170例胃癌病人和140例相匹配的正常对照者进行研究，分析MTHFR基因C677T 和A1298C多态性与胃癌发生的风险性的关系。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 标本来源 标本取自170例胃癌病人和140例正常对照者。病人分别来自东南大学附属中大医院、南京市鼓楼医院和江苏省人民医院，样品为肿瘤组织和外周血；年龄、性别相匹配的正常对照者来自东南大学校医院和东南大学附属中大医院，所取样品均为健康人的外周血。所有的病例和正常对照者均为江苏省南京市及其周边区域居住的汉族居民。病例组中男、女性分别为118例和52例，平均年龄为(52.05±10.67)岁；对照组男、女性分别为82例和58例，平均年龄为(50.87±7.69)岁。胃癌组和对照组性别、年龄分布差异无显著意义(P值分别为0.129和0.28)，基因组DNA的提取采用标准的苯酚/氯仿法。
1.1.2 主要试剂 蛋白酶K、EDTA、TrisCl和饱和酚均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品，限制性内切酶Hinf Ⅰ(10U·μl-1)和Mbo Ⅱ(10U·μl-1)为大连宝生物公司产品，所有的引物由上海博亚生物工程公司合成。
1.1.3 仪器 PTC225热循环仪(MJ Research, Watertown, MA)，紫外分光光度计(岛津公司)，凝胶成像系统(Syngene，Gene Genius)。
1.2 实验方法
1.2.1 MTHFR基因型分析 MTHFR基因分型按我们已报道的方法 [3]进行。扩增含C677TDNA片段的PCR引物序列为：F，5′TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA3′和R，5′AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG3′，扩增产物长度为198bp。 扩增含A1298CDNA片段的PCR引物序列为：F，5′CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C3′和R，5′CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG3′， 扩增产物长度为163bp。 30μl反应体系包括：200μg·ml-1DNA模板1μl ，双侧引物各1μl，10×缓冲液3μl，25mmol·L-1的Mg2+ 2μl，10mmol·L-1的dNTP 0.6μl, 1.25U的TaqDNA聚合酶(5U·μl-1)。反应条件：94℃预变性5min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸7min；C677T基因型和A1298C基因型可以分别由限制性核酸内切酶HinfⅠ或MboⅡ鉴别，677C→T突变后可被HinfⅠ识别。纯合变异基因型的PCR产物经酶切后产生175bp和23bp两个片段，杂合子产生198、175和23bp3个片段 ,而野生型基因型只有198bp 1个片段。含1298AA的PCR产物有4个MboⅡ酶切位点 ,产生56、31、30、28和18bp5个片段 ;A→C突变后失去1个酶切位点，因此，纯合突变型产生84、31、30和18bp4个片段，杂合子则含84、56、31、30、28和18bp6个片段(图 1)。取适量PCR 产物分别与足量的限制性内切酶于37℃温育过夜，酶切产物于3%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色。M1. 100bp梯度DNA分子质量标志；M2. DL2000型DNA分子质量标志；1、4.AC基因型；2、3、5.AA基因型；6.CC基因型图1 MTHFR基因A1298C多态扩增产物RFLP图谱
1.2.2 数据处理 在分型结果的统计分析中，病例组和对照组MTHFR基因型的频率差异以χ2检验确定，P<0.05为差异有显著意义。以比值比(odds ratio，OR)以及95%可信度(95% onfidence interval,95%CI)表示各种基因型与胃癌风险的相关性。OR值以非条件的Logistic回归模型计算，并经过年龄、性别等混杂因子校正。所有统计分析均用Statistical Analysis System 软件(6.1版，SAS公司)计算。
2 结 果
表1为胃癌与健康对照者的MTHFR基因多态性分布及其与胃癌的风险关系。对表1中胃癌组和对照组的MTHFR基因C677T和A1298C的基因型频率进行了遗传平衡检测，均符合HardyWeinberg平衡比例(均P>0.05)，样本具有群体代表性。表1 MTHFR基因型频率在病例组和对照组中的 分布及其与胃癌风险的关系注：OR经过性别和年龄校对从表1中可以看到在140例正常对照组中，MTHFR基因677CC、CT 和TT 基因型频率分别为47.9%、40.0%和12.1%。而在胃癌患者中这3 种基因型频率分别为35.9%、45.9%和18.2%。比较病例组中变异基因型拥有者(CT+TT)占64.1%，显著高于对照组中的52.1%，差异具有显著意义(χ2 =4.54，P<0.05)。与MTHFR基因677CC基因型者相比，变异型基因者发生胃癌的危险性为1.67倍(OR为1.67，95%CI为1.06~2.64)。可以推断MTHFR基因C677T多态是胃癌的危险因素。以胃癌677CC基因型的OR为1.00，CT基因型的OR为1.60(95%CI为0.928~2.639)，CT基因型的危险性是CC的1.60倍，经统计学分析差异没有显著性意义(χ2 =2.92，P>0.05)。TT基因型的OR为2.67(95%CI为1.382~5.341)，TT基因型的危险性是CC的2.67倍，经统计学分析差异有显著性意义(χ2 =4.01，P<0.05)。OR值的上升趋势明显，这提示MTHFR基因C677T的多态与胃癌风险呈等位基因计量效应关系。对照组中MTHFR第1 298 位基因型的频率为AA 69.2%、AC 29.3%和CC 1.4%；病例组1298AA、AC 和CC 基因型频率分别是74.1%、24.7%和1.2%。1298CC基因型频率在病例组和对照组中都很低，分别只有1.2%和1.4%，与1298AA基因型比较对胃癌风险没有明显的影响(OR为1.61，95%CI为0.309~1.834)。两组的MTHFR基因1298AC基因型频率差异也无显著意义。因此，可以推断MTHFR基因A1298C多态不是胃癌发生的危险因素。我们进一步分析发现，MTHFR基因677和1298多态可能存在着联合作用。例如，携带677TT/1298AA基因型个体的OR为2.035 (95%CI为0.957~4.425)，而携带677TT/1298AC基因型个体的OR增高到3.684(95%CI为0.829~25.776)。我们还发现在这些研究对象中，677TT/ 1298AC或677CT/1298CC变异基因型非常罕见，更没有人携带677TT/1298CC基因型 (表2)，可能两位点均为突变型时可能有致死作用。这一结论与Song等[4]研究结果相一致。表2 MTHFR基因677和1298基因型联合与胃癌风险的关系
3 讨 论
MTHFR基因677C→T和1298A→C突变使控制叶酸代谢的MTHFR活性显著下降，研究表明，MTHFR基因变异型纯合子与血浆中同型半胱氨酸水平的升高和5甲基四氢叶酸水平的降低有关[5]。体外实验也证实,MTHFR变异型纯合子的DNA接受甲基能力显著高于野生型纯合子[6]。说明MTHFR基因变异导致了作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍，进而导致了DNA的低甲基化。细胞基因组DNA的去甲基化可能与细胞的过度增殖有关，研究证明细胞DNA的甲基化水平，特别是有关基因表达控制点的甲基化水平对基因表达起调节作用，甲基化水平降低，相关基因的转录水平就增高。提示MTHFR基因多态性可能与癌症的发生有关。本实验中我们研究了在叶酸代谢中起关键作用的MTHFR基因C677T和A1298C多态与胃癌遗传易感性的关系，结果表明MTHFR基因单核苷酸多态是胃癌的遗传易感因素。特别是C677T多态，拥有变异型基因的人数在病例组中的比例显著高于对照组，其变异型基因显著增加了发生胃癌的危险性。A1298C多态虽然其基因型频率与胃癌的发生没有显著意义，但其多态与MTHFR677多态可能存在联合作用。这一结果不仅表明MTHFR基因多态性与胃癌的发生有关，同时也提示胃癌的发生可能与DNA的低甲基化有关。本研究证明MTHFR基因单核苷酸多态与胃癌风险增高显著相关，为叶酸摄入低和(或)叶酸代谢障碍可能在胃癌变中起重要作用的假说提供了遗传学基础。为了证实MTHFR基因多态在胃癌病因学中的作用，有必要进一步研究MTHFR基因多态与叶酸摄入量之间的基因营养素交互作用以及其他因素如饮酒、吸烟的影响，同时还要对MTHFR基因多态与不同部位胃癌的遗传易感性进行研究。这需要在完善病例和对照资料，扩大样本数量的基础上进行。进一步进行这方面的研究对于经济有效地开展胃癌的预防工作具有重要意义。
[参考文献]
[1]HOLLIDAY R, GRIGG G W. DNA methylation and mutation[J]. Mutation Research, 1993, 285:6167.
[2]van der PUT N M, GABREELS F, STEVENS E M, et al. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neuraltube defects[J]. Am J Hum Genet, 1998 ,62:10441051.
[3]FROSST P, BLOM H J, MILOS R, et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase[J].Nat Genet, 1995,10:111113.
[4]SONG C, XING D, TAN W,et al. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms increase risk of esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population[J].Cancer Res, 2001, 61:32723275.
[5]GEBHARDT G S,SCHOLTZ C L,HILLERMANN R,et al. Combined heterozygosity for methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)mutations C677T and A1298C is associated with abruptio placentae but not with intrauterine growth restriction [J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2001,97:174177.
[6]STERN L L, MASON J B,SELHUB J, et al. Genomic DNA hypomethylation, a charcteristeristic of most cancers, is present in peripheral leukocytes of individuals who are homozygous for the C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene[J]. Cancer Epideniol Biomark Prev, 2000, 9:849853.
(东南大学 生物科学与医学工程系, 江苏 南京 210096), http://www.100md.com(李松, 祭美菊, 侯鹏, 何农跃)
[关键词]胃癌；单核苷酸多态性；亚甲基四氢叶酸还原酶基因；疾病易感性
DNA 甲基化是基因表达，DNA 的稳定性、完整性和诱变的重要决定因素，染色体和DNA甲基化异常都是可遗传的，是导致基因组不稳定性而引发肿瘤的重要机制[1]。相关研究表明，细胞内低甲基化是胃癌形成的一个重要原因，亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多态会影响叶酸在体内的正常代谢，造成甲基不足，从而促进胃癌的产生，国内外刊物报道了此方面进行的一些研究。MTHFR基因在总的人群中呈高度多态性，在其编码区有2个常见的单核苷酸多态,即C677T 和A1298C，前者位于催化区而后者位于活性调节区 [2]。作者对江苏南京地区的170例胃癌病人和140例相匹配的正常对照者进行研究，分析MTHFR基因C677T 和A1298C多态性与胃癌发生的风险性的关系。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 标本来源 标本取自170例胃癌病人和140例正常对照者。病人分别来自东南大学附属中大医院、南京市鼓楼医院和江苏省人民医院，样品为肿瘤组织和外周血；年龄、性别相匹配的正常对照者来自东南大学校医院和东南大学附属中大医院，所取样品均为健康人的外周血。所有的病例和正常对照者均为江苏省南京市及其周边区域居住的汉族居民。病例组中男、女性分别为118例和52例，平均年龄为(52.05±10.67)岁；对照组男、女性分别为82例和58例，平均年龄为(50.87±7.69)岁。胃癌组和对照组性别、年龄分布差异无显著意义(P值分别为0.129和0.28)，基因组DNA的提取采用标准的苯酚/氯仿法。
1.1.2 主要试剂 蛋白酶K、EDTA、TrisCl和饱和酚均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品，限制性内切酶Hinf Ⅰ(10U·μl-1)和Mbo Ⅱ(10U·μl-1)为大连宝生物公司产品，所有的引物由上海博亚生物工程公司合成。
1.1.3 仪器 PTC225热循环仪(MJ Research, Watertown, MA)，紫外分光光度计(岛津公司)，凝胶成像系统(Syngene，Gene Genius)。
1.2 实验方法
1.2.1 MTHFR基因型分析 MTHFR基因分型按我们已报道的方法 [3]进行。扩增含C677TDNA片段的PCR引物序列为：F，5′TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA3′和R，5′AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG3′，扩增产物长度为198bp。 扩增含A1298CDNA片段的PCR引物序列为：F，5′CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C3′和R，5′CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG3′， 扩增产物长度为163bp。 30μl反应体系包括：200μg·ml-1DNA模板1μl ，双侧引物各1μl，10×缓冲液3μl，25mmol·L-1的Mg2+ 2μl，10mmol·L-1的dNTP 0.6μl, 1.25U的TaqDNA聚合酶(5U·μl-1)。反应条件：94℃预变性5min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸7min；C677T基因型和A1298C基因型可以分别由限制性核酸内切酶HinfⅠ或MboⅡ鉴别，677C→T突变后可被HinfⅠ识别。纯合变异基因型的PCR产物经酶切后产生175bp和23bp两个片段，杂合子产生198、175和23bp3个片段 ,而野生型基因型只有198bp 1个片段。含1298AA的PCR产物有4个MboⅡ酶切位点 ,产生56、31、30、28和18bp5个片段 ;A→C突变后失去1个酶切位点，因此，纯合突变型产生84、31、30和18bp4个片段，杂合子则含84、56、31、30、28和18bp6个片段(图 1)。取适量PCR 产物分别与足量的限制性内切酶于37℃温育过夜，酶切产物于3%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色。M1. 100bp梯度DNA分子质量标志；M2. DL2000型DNA分子质量标志；1、4.AC基因型；2、3、5.AA基因型；6.CC基因型图1 MTHFR基因A1298C多态扩增产物RFLP图谱
1.2.2 数据处理 在分型结果的统计分析中，病例组和对照组MTHFR基因型的频率差异以χ2检验确定，P<0.05为差异有显著意义。以比值比(odds ratio，OR)以及95%可信度(95% onfidence interval,95%CI)表示各种基因型与胃癌风险的相关性。OR值以非条件的Logistic回归模型计算，并经过年龄、性别等混杂因子校正。所有统计分析均用Statistical Analysis System 软件(6.1版，SAS公司)计算。
2 结 果
表1为胃癌与健康对照者的MTHFR基因多态性分布及其与胃癌的风险关系。对表1中胃癌组和对照组的MTHFR基因C677T和A1298C的基因型频率进行了遗传平衡检测，均符合HardyWeinberg平衡比例(均P>0.05)，样本具有群体代表性。表1 MTHFR基因型频率在病例组和对照组中的 分布及其与胃癌风险的关系注：OR经过性别和年龄校对从表1中可以看到在140例正常对照组中，MTHFR基因677CC、CT 和TT 基因型频率分别为47.9%、40.0%和12.1%。而在胃癌患者中这3 种基因型频率分别为35.9%、45.9%和18.2%。比较病例组中变异基因型拥有者(CT+TT)占64.1%，显著高于对照组中的52.1%，差异具有显著意义(χ2 =4.54，P<0.05)。与MTHFR基因677CC基因型者相比，变异型基因者发生胃癌的危险性为1.67倍(OR为1.67，95%CI为1.06~2.64)。可以推断MTHFR基因C677T多态是胃癌的危险因素。以胃癌677CC基因型的OR为1.00，CT基因型的OR为1.60(95%CI为0.928~2.639)，CT基因型的危险性是CC的1.60倍，经统计学分析差异没有显著性意义(χ2 =2.92，P>0.05)。TT基因型的OR为2.67(95%CI为1.382~5.341)，TT基因型的危险性是CC的2.67倍，经统计学分析差异有显著性意义(χ2 =4.01，P<0.05)。OR值的上升趋势明显，这提示MTHFR基因C677T的多态与胃癌风险呈等位基因计量效应关系。对照组中MTHFR第1 298 位基因型的频率为AA 69.2%、AC 29.3%和CC 1.4%；病例组1298AA、AC 和CC 基因型频率分别是74.1%、24.7%和1.2%。1298CC基因型频率在病例组和对照组中都很低，分别只有1.2%和1.4%，与1298AA基因型比较对胃癌风险没有明显的影响(OR为1.61，95%CI为0.309~1.834)。两组的MTHFR基因1298AC基因型频率差异也无显著意义。因此，可以推断MTHFR基因A1298C多态不是胃癌发生的危险因素。我们进一步分析发现，MTHFR基因677和1298多态可能存在着联合作用。例如，携带677TT/1298AA基因型个体的OR为2.035 (95%CI为0.957~4.425)，而携带677TT/1298AC基因型个体的OR增高到3.684(95%CI为0.829~25.776)。我们还发现在这些研究对象中，677TT/ 1298AC或677CT/1298CC变异基因型非常罕见，更没有人携带677TT/1298CC基因型 (表2)，可能两位点均为突变型时可能有致死作用。这一结论与Song等[4]研究结果相一致。表2 MTHFR基因677和1298基因型联合与胃癌风险的关系
3 讨 论
MTHFR基因677C→T和1298A→C突变使控制叶酸代谢的MTHFR活性显著下降，研究表明，MTHFR基因变异型纯合子与血浆中同型半胱氨酸水平的升高和5甲基四氢叶酸水平的降低有关[5]。体外实验也证实,MTHFR变异型纯合子的DNA接受甲基能力显著高于野生型纯合子[6]。说明MTHFR基因变异导致了作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍，进而导致了DNA的低甲基化。细胞基因组DNA的去甲基化可能与细胞的过度增殖有关，研究证明细胞DNA的甲基化水平，特别是有关基因表达控制点的甲基化水平对基因表达起调节作用，甲基化水平降低，相关基因的转录水平就增高。提示MTHFR基因多态性可能与癌症的发生有关。本实验中我们研究了在叶酸代谢中起关键作用的MTHFR基因C677T和A1298C多态与胃癌遗传易感性的关系，结果表明MTHFR基因单核苷酸多态是胃癌的遗传易感因素。特别是C677T多态，拥有变异型基因的人数在病例组中的比例显著高于对照组，其变异型基因显著增加了发生胃癌的危险性。A1298C多态虽然其基因型频率与胃癌的发生没有显著意义，但其多态与MTHFR677多态可能存在联合作用。这一结果不仅表明MTHFR基因多态性与胃癌的发生有关，同时也提示胃癌的发生可能与DNA的低甲基化有关。本研究证明MTHFR基因单核苷酸多态与胃癌风险增高显著相关，为叶酸摄入低和(或)叶酸代谢障碍可能在胃癌变中起重要作用的假说提供了遗传学基础。为了证实MTHFR基因多态在胃癌病因学中的作用，有必要进一步研究MTHFR基因多态与叶酸摄入量之间的基因营养素交互作用以及其他因素如饮酒、吸烟的影响，同时还要对MTHFR基因多态与不同部位胃癌的遗传易感性进行研究。这需要在完善病例和对照资料，扩大样本数量的基础上进行。进一步进行这方面的研究对于经济有效地开展胃癌的预防工作具有重要意义。
[参考文献]
[1]HOLLIDAY R, GRIGG G W. DNA methylation and mutation[J]. Mutation Research, 1993, 285:6167.
[2]van der PUT N M, GABREELS F, STEVENS E M, et al. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neuraltube defects[J]. Am J Hum Genet, 1998 ,62:10441051.
[3]FROSST P, BLOM H J, MILOS R, et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase[J].Nat Genet, 1995,10:111113.
[4]SONG C, XING D, TAN W,et al. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms increase risk of esophageal squamous cell carcinoma in a Chinese population[J].Cancer Res, 2001, 61:32723275.
[5]GEBHARDT G S,SCHOLTZ C L,HILLERMANN R,et al. Combined heterozygosity for methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)mutations C677T and A1298C is associated with abruptio placentae but not with intrauterine growth restriction [J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2001,97:174177.
[6]STERN L L, MASON J B,SELHUB J, et al. Genomic DNA hypomethylation, a charcteristeristic of most cancers, is present in peripheral leukocytes of individuals who are homozygous for the C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene[J]. Cancer Epideniol Biomark Prev, 2000, 9:849853.
(东南大学 生物科学与医学工程系, 江苏 南京 210096), http://www.100md.com(李松, 祭美菊, 侯鹏, 何农跃)