腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因对血管内皮细胞的靶向杀伤作用
http://www.100md.com
《第四军医大学学报》
Selective killing of vascular endothelial cells based on adenovirusmediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transfection under the driving of KDR promoter
ZHU QianYuan, ZHOU YuMei, LI BaoJin, MAO MuHua, PENG CaiSheng， GUO Jian
Department of Otorhinolaryngology, Medical College, Jinggangshan University, Jian 343000，China, Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen Hospital, Peking University，Shenzhen 518036, China
【Abstract】 AIM: To investigate the target killing effect of adenovirusmediated herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSVtk) transfection under the driving of KDR promoter on the vascular endothelial cells in vitro. METHODS：By using AdEasy system, recombinant adenovirus plasmid containing KDR or cytomegalovirus (CMV) promotercontrolled HSVtk gene (AdKDRtk and AdCMVtk) was constructed. After packaging and amplification in 293 cells, the virus was used to infect KDRexpressed human umbilical venous endothelial cells (HUVEC) and KDRunexpressed CNE2. Following administration of ganciclovir (GCV), the survival rate of genetransfected HUVEC and CNE2 was evaluated by using MTT method. RESULTS：The AdEasy System produced a high titer of the recombinant adenovirus (1×1013 pfu/L). Under infection index of 100, with increasing GCV concentration from 0 up to 50 mg/L, the survival rates of AdKDRtktransfected HUVEC and CNE2 decreased from (89.4±4.6)% and (91.5±4.4)% to (22.9±4.7)% and (71.4±2.9)% at proper order respectively (P<0.01), while the survival rates of AdCMVtktransfected HUVEC and CNE2 declined from (89.9±6.2)% and (90.8±5.7)% to (12.8±2.6)% and (18.8±6.1)%, respectively (P>0.05). CONCLUSION：Adenovirusmediated HSVtk transfection under the driving of KDR promoter could yield the specific killing effect on vascular endothelial cells with treatment of GCV.
【Keywords】 endothelium, vascular; KDR promoter; simplex virus; thymidine kinase; adenoviridac
【摘要】 目的：体外实验评估腺病毒介导KDR启动子胸苷激酶系统(HSVtk)杀伤血管内皮细胞的作用. 方法：采用新型AdEasy系统，构建受KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSVtk基因的AdKDRtk和AdCMVtk，在293细胞中包装、扩增后，体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)和不表达KDR的人鼻咽癌细胞株CNE2，用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞，并以MTT法检测其细胞增殖情况. 结果：病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 在感染复数(MOI)为100的条件下，GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDRtk的HUVEC细胞和CNE2细胞存活率从(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%(P<0.01)，而感染AdCMVtk的HUVEC细胞和CNE2细胞存活率从(89.9±6.2)%和(90.8±5.7)%分别下降至(12.8±2.6 )%和(18.8±6.1)%(P>0.05). 结论：腺病毒介导KDR启动子胸苷激酶系统具有特异性杀伤血管内皮细胞作用.
【关键词】 内皮，血管；KDR启动子；单纯疱疹病毒属；胸苷激酶；腺病毒科
0引言
肿瘤生长有赖于血液营养和氧气供给，阻断肿瘤组织内血管生成和血管化是一个很有发展前景的灭瘤或阻止肿瘤转移有效的途径[1-2]. 随着分子生物学及基因工程技术的发展，基因治疗给恶性肿瘤的治疗提供了新方法. 研究表明胸苷激酶系统(HSVtk/GCV)能有效杀伤血管内皮细胞[3]，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前所发现血管生成相关因子中最重要的血管生长因子，其生物效应是通过其特异性受体(KDR)介导的. 我们研究以腺病毒介导的KDR启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶系统结合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对血管内皮细胞的杀伤作用，为进一步开展靶向鼻咽癌血管的自杀基因疗法奠定实验基础.
1材料和方法
1.1材料带有HSVtk基因的由CMV启动子驱动的重组腺病毒(AdCMVtk)和带有HSV tk基因的由KDR启动子驱动的重组腺病毒(AdKDRtk)由北京大学深圳医院博士后工作站构建并提供[4]. GCV购自Roche公司，胎牛血清、DMEM培养基购于GIBCO BRL公司. MTT, DMSO为Sigma公司产品. 6孔板、96孔板为Corning公司产品. 人鼻咽癌细胞株CNE2(中山大学肿瘤医院赠送). 人胚胎肾细胞系293细胞，表达KDR的脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)由北京大学深圳医院博士后工作站李宝金博士赠送.
1.2方法
1.2.1重组腺病毒载体AdKDRtk和AdCMVtk的包装与扩增293细胞在T25培养瓶中培养至汇合度为50%～70%时，分别用线性化(经PacI酶切)重组腺病毒AdKDRtk和AdCMVtk载体转染，操作步骤按Lipofectamine2000产品说明书进行. 转染后第10日，收集细胞，反复冻融3次. 取1/3病毒上清再感染293细胞大量扩增，3 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融3次. 最后，CsCl梯度离心纯化.
1.2.2病毒滴度测定测定前1 d，在24孔板中接种293细胞(2×105个/孔)，第2日依次加入按10倍倍比稀释的待检病毒悬液400 μL. 37℃感染60 min后，吸去400 μL上清，加入1 mL完全培养液继续培养，48 h后观察GFP阳性细胞数，并按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度(pfu/mL)=(GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数)/0.4 mL.
1.2.3细胞培养将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC和人鼻咽癌细胞珠CNE2在DMEM培养液(含100 mL/L胎牛血清)于37℃,50 mL/L CO2的孵箱中培养.
1.2.4体外GCV敏感实验在96孔板中分别接种HUVEC或人鼻咽癌细胞珠CNE2 (2×103个/孔)，次日加入不同感染复数(multiplicity of infection，MOI) (0, 1, 10, 100)的AdKDRtk或AdCMVtk病毒系列稀释溶液. 培养16 h后,吸尽培养液，实验孔换之以含0，1，10或50 mg/L GCV的新鲜培养液，而对照孔换之以不含GCV的新鲜培养液，37℃继续培养5 d. 每孔重复3次. 采用MTT法检测细胞增殖指数.
统计学处理：实验结果以x±s表示，采用t检验比较组间均数差异，以双侧P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1重组腺病毒的产生及浓度测定重组腺病毒质粒转染293细胞后荧光显微镜下可见细胞有GFP表达. 经3次293细胞内的扩增、CsCl梯度离心后，测定病毒滴度为1×1013 pfu/L.
2.2体外GCV敏感试验以不同MOI的AdKDRtk分别转染的HUVEC和CNE2细胞对GCV有不同的敏感性，以MOI=100时最为敏感. 此时，GCV浓度由0增至50 mg/L，感染的HUVEC细胞和CNE2细胞存活率由(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%. 随GCV的浓度增加，两细胞的存活率不同. 随着GVC的浓度增加，感染的HUVEC细胞与CNE2细胞存活率有明显差异(P<0.01， 表1).
表1pAdKDRtk MOI和pAdCMVtk MOI为100时，不同浓度GCV下细胞生存率(略)
bP<0.01 vs CNE2.
以不同MOI的AdCMVtk感染的HUVEC和CNE2细胞对GCV均有相似的敏感性. 随着MOI和GCV浓度增加，细胞存活率均呈现明显下降趋势. 当MOI为100时，GCV浓度由0增至50 mg/L时，HUVEC和CNE2细胞存活率分别变为(12.8±2.6)%和(18.8±6.1)%(P>0.05,表1).
3讨论
血管生成是肿瘤生长和转移的先决条件之一，瘤组织内血管内皮细胞和肿瘤细胞的比例约为1∶100，毁损相对较少量的血管内皮细胞就可使供血区内大量的肿瘤细胞发生缺血坏死，这是肿瘤治疗的一个新策略，比直接针对肿瘤细胞的治疗具有更确切的疗效[5]. 已有不少研究表明，利用重组腺病毒介导的自杀基因系统HSVtk/GCV5FC可在体外有效地杀伤血管内皮细胞[6]. 由于腺病毒可广泛感染肿瘤细胞与正常细胞，目前所采用自杀基因系统一般以CMV作为启动子，但它缺乏特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞的能力. 因而，基因治疗的靶向性调控已成为决定基因治疗效果及可行性的关键因素.
KDR具有在肿瘤组织新生血管内皮细胞特异性地高表达，并且与肿瘤生长和转移密切相关，而其他正常血管内皮细胞很低表达或不表达的性质，使KDR可成为一个高度特异性和效率的靶向肿瘤血管肿瘤自杀基因治疗系统的启动子. 本实验我们分别采用表达KDR的人脐静脉内皮细胞系和不表达KDR的鼻咽癌细胞系CNE2[7]，研究了腺病毒介导的、分别以KDR为启动子和以CMV为启动子驱动的HSVTK自杀基因系统对这两个细胞系的杀伤作用. 结果CMV为启动子驱动的HSVtk可将两种细胞系大大杀伤, 表明以CMV为启动子驱动的HSVtk在两个细胞系中都表达，并且将药物前体大量地转化为细胞敏感的毒性物质而杀伤细胞. 而以KDR启动子调控的HSVtk，只将人脐静脉血管内皮细胞杀伤，而鼻咽癌细胞系CNE2仍保持很高的生存率, 说明以KDR启动子调控的HSVtk只在表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞特异性表达，并将GCV比较彻底地转化为血管内皮细胞的敏感毒性产物杀伤细胞. 但在CNE2 细胞中，由于CNE2细胞不表达KDR，故HSVtk不能在CNE2细胞表达，GCV不能被磷酸化而转变为细胞毒性产物，细胞也不被杀灭.
本结果表明，由于CMV缺乏特异性，导致其调控的自杀基因系统也缺乏特异性杀伤的能力. 而KDR启动子驱动的HSVtk自杀基因系统，只在具有KDR表达的血管内皮细胞发挥杀灭作用，具有高度的特异性, 提示腺病毒介导的、KDR启动子驱动的HSVtk自杀基因系统可在以肿瘤血管为靶点的肿瘤自杀基因治疗策略中发挥作用.
【参考文献】
[1] Shahin R, David L, Robert B, et al. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for antiangiogenesis therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2002,10(2):826-835.
[2] Napoleone F. VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor[J]. Nat Rev Cancer, 2002,10(2):795-803.
[3] Hall SJ, Mutchnik SE, Chen SH, et al. Adenovinusmediated HSVtk gene and GCV therapy lead to systemic activity against spontaneous and induced metastasis in an orthotopic mouse model of prostate cancer [J].Int J Cancer,1997,70(2):183-187.
[4] 刘晓平，李宝金，张超. HSVtk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析[J]. 癌症，2006,25(2):179-184.
[5] Kong HL, Crystal RG. Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis[J]. Natl Cancer Inst,1998,90:273-286.
[6] 潘雪，李兆申，许国铭,等.CD/5FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨[J].中华肝胆外科杂志,2002,8(12):717-720.
[7] 邱前辉，陈少华，李添应.血管内皮生长因子受体2(KDR)在鼻咽癌细胞系(CNE2)中表达的研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2006，27(1)：7-9.
编辑袁天峰
基金项目：江西省卫生厅科技资助(20052041)
(井冈山学院医学院耳鼻喉科，江西 吉安 343000，北京大学深圳医院肝胆胰外科，广东 深圳 518036), 百拇医药(朱欠元，周玉梅，李宝金，毛慕华，彭才圣，郭剑)
ZHU QianYuan, ZHOU YuMei, LI BaoJin, MAO MuHua, PENG CaiSheng， GUO Jian
Department of Otorhinolaryngology, Medical College, Jinggangshan University, Jian 343000，China, Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen Hospital, Peking University，Shenzhen 518036, China
【Abstract】 AIM: To investigate the target killing effect of adenovirusmediated herpes simplex virus thymidine kinase gene (HSVtk) transfection under the driving of KDR promoter on the vascular endothelial cells in vitro. METHODS：By using AdEasy system, recombinant adenovirus plasmid containing KDR or cytomegalovirus (CMV) promotercontrolled HSVtk gene (AdKDRtk and AdCMVtk) was constructed. After packaging and amplification in 293 cells, the virus was used to infect KDRexpressed human umbilical venous endothelial cells (HUVEC) and KDRunexpressed CNE2. Following administration of ganciclovir (GCV), the survival rate of genetransfected HUVEC and CNE2 was evaluated by using MTT method. RESULTS：The AdEasy System produced a high titer of the recombinant adenovirus (1×1013 pfu/L). Under infection index of 100, with increasing GCV concentration from 0 up to 50 mg/L, the survival rates of AdKDRtktransfected HUVEC and CNE2 decreased from (89.4±4.6)% and (91.5±4.4)% to (22.9±4.7)% and (71.4±2.9)% at proper order respectively (P<0.01), while the survival rates of AdCMVtktransfected HUVEC and CNE2 declined from (89.9±6.2)% and (90.8±5.7)% to (12.8±2.6)% and (18.8±6.1)%, respectively (P>0.05). CONCLUSION：Adenovirusmediated HSVtk transfection under the driving of KDR promoter could yield the specific killing effect on vascular endothelial cells with treatment of GCV.
【Keywords】 endothelium, vascular; KDR promoter; simplex virus; thymidine kinase; adenoviridac
【摘要】 目的：体外实验评估腺病毒介导KDR启动子胸苷激酶系统(HSVtk)杀伤血管内皮细胞的作用. 方法：采用新型AdEasy系统，构建受KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSVtk基因的AdKDRtk和AdCMVtk，在293细胞中包装、扩增后，体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)和不表达KDR的人鼻咽癌细胞株CNE2，用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞，并以MTT法检测其细胞增殖情况. 结果：病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 在感染复数(MOI)为100的条件下，GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDRtk的HUVEC细胞和CNE2细胞存活率从(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%(P<0.01)，而感染AdCMVtk的HUVEC细胞和CNE2细胞存活率从(89.9±6.2)%和(90.8±5.7)%分别下降至(12.8±2.6 )%和(18.8±6.1)%(P>0.05). 结论：腺病毒介导KDR启动子胸苷激酶系统具有特异性杀伤血管内皮细胞作用.
【关键词】 内皮，血管；KDR启动子；单纯疱疹病毒属；胸苷激酶；腺病毒科
0引言
肿瘤生长有赖于血液营养和氧气供给，阻断肿瘤组织内血管生成和血管化是一个很有发展前景的灭瘤或阻止肿瘤转移有效的途径[1-2]. 随着分子生物学及基因工程技术的发展，基因治疗给恶性肿瘤的治疗提供了新方法. 研究表明胸苷激酶系统(HSVtk/GCV)能有效杀伤血管内皮细胞[3]，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前所发现血管生成相关因子中最重要的血管生长因子，其生物效应是通过其特异性受体(KDR)介导的. 我们研究以腺病毒介导的KDR启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶系统结合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对血管内皮细胞的杀伤作用，为进一步开展靶向鼻咽癌血管的自杀基因疗法奠定实验基础.
1材料和方法
1.1材料带有HSVtk基因的由CMV启动子驱动的重组腺病毒(AdCMVtk)和带有HSV tk基因的由KDR启动子驱动的重组腺病毒(AdKDRtk)由北京大学深圳医院博士后工作站构建并提供[4]. GCV购自Roche公司，胎牛血清、DMEM培养基购于GIBCO BRL公司. MTT, DMSO为Sigma公司产品. 6孔板、96孔板为Corning公司产品. 人鼻咽癌细胞株CNE2(中山大学肿瘤医院赠送). 人胚胎肾细胞系293细胞，表达KDR的脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)由北京大学深圳医院博士后工作站李宝金博士赠送.
1.2方法
1.2.1重组腺病毒载体AdKDRtk和AdCMVtk的包装与扩增293细胞在T25培养瓶中培养至汇合度为50%～70%时，分别用线性化(经PacI酶切)重组腺病毒AdKDRtk和AdCMVtk载体转染，操作步骤按Lipofectamine2000产品说明书进行. 转染后第10日，收集细胞，反复冻融3次. 取1/3病毒上清再感染293细胞大量扩增，3 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融3次. 最后，CsCl梯度离心纯化.
1.2.2病毒滴度测定测定前1 d，在24孔板中接种293细胞(2×105个/孔)，第2日依次加入按10倍倍比稀释的待检病毒悬液400 μL. 37℃感染60 min后，吸去400 μL上清，加入1 mL完全培养液继续培养，48 h后观察GFP阳性细胞数，并按下列公式计算病毒滴度：病毒滴度(pfu/mL)=(GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数)/0.4 mL.
1.2.3细胞培养将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC和人鼻咽癌细胞珠CNE2在DMEM培养液(含100 mL/L胎牛血清)于37℃,50 mL/L CO2的孵箱中培养.
1.2.4体外GCV敏感实验在96孔板中分别接种HUVEC或人鼻咽癌细胞珠CNE2 (2×103个/孔)，次日加入不同感染复数(multiplicity of infection，MOI) (0, 1, 10, 100)的AdKDRtk或AdCMVtk病毒系列稀释溶液. 培养16 h后,吸尽培养液，实验孔换之以含0，1，10或50 mg/L GCV的新鲜培养液，而对照孔换之以不含GCV的新鲜培养液，37℃继续培养5 d. 每孔重复3次. 采用MTT法检测细胞增殖指数.
统计学处理：实验结果以x±s表示，采用t检验比较组间均数差异，以双侧P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1重组腺病毒的产生及浓度测定重组腺病毒质粒转染293细胞后荧光显微镜下可见细胞有GFP表达. 经3次293细胞内的扩增、CsCl梯度离心后，测定病毒滴度为1×1013 pfu/L.
2.2体外GCV敏感试验以不同MOI的AdKDRtk分别转染的HUVEC和CNE2细胞对GCV有不同的敏感性，以MOI=100时最为敏感. 此时，GCV浓度由0增至50 mg/L，感染的HUVEC细胞和CNE2细胞存活率由(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%. 随GCV的浓度增加，两细胞的存活率不同. 随着GVC的浓度增加，感染的HUVEC细胞与CNE2细胞存活率有明显差异(P<0.01， 表1).
表1pAdKDRtk MOI和pAdCMVtk MOI为100时，不同浓度GCV下细胞生存率(略)
bP<0.01 vs CNE2.
以不同MOI的AdCMVtk感染的HUVEC和CNE2细胞对GCV均有相似的敏感性. 随着MOI和GCV浓度增加，细胞存活率均呈现明显下降趋势. 当MOI为100时，GCV浓度由0增至50 mg/L时，HUVEC和CNE2细胞存活率分别变为(12.8±2.6)%和(18.8±6.1)%(P>0.05,表1).
3讨论
血管生成是肿瘤生长和转移的先决条件之一，瘤组织内血管内皮细胞和肿瘤细胞的比例约为1∶100，毁损相对较少量的血管内皮细胞就可使供血区内大量的肿瘤细胞发生缺血坏死，这是肿瘤治疗的一个新策略，比直接针对肿瘤细胞的治疗具有更确切的疗效[5]. 已有不少研究表明，利用重组腺病毒介导的自杀基因系统HSVtk/GCV5FC可在体外有效地杀伤血管内皮细胞[6]. 由于腺病毒可广泛感染肿瘤细胞与正常细胞，目前所采用自杀基因系统一般以CMV作为启动子，但它缺乏特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞的能力. 因而，基因治疗的靶向性调控已成为决定基因治疗效果及可行性的关键因素.
KDR具有在肿瘤组织新生血管内皮细胞特异性地高表达，并且与肿瘤生长和转移密切相关，而其他正常血管内皮细胞很低表达或不表达的性质，使KDR可成为一个高度特异性和效率的靶向肿瘤血管肿瘤自杀基因治疗系统的启动子. 本实验我们分别采用表达KDR的人脐静脉内皮细胞系和不表达KDR的鼻咽癌细胞系CNE2[7]，研究了腺病毒介导的、分别以KDR为启动子和以CMV为启动子驱动的HSVTK自杀基因系统对这两个细胞系的杀伤作用. 结果CMV为启动子驱动的HSVtk可将两种细胞系大大杀伤, 表明以CMV为启动子驱动的HSVtk在两个细胞系中都表达，并且将药物前体大量地转化为细胞敏感的毒性物质而杀伤细胞. 而以KDR启动子调控的HSVtk，只将人脐静脉血管内皮细胞杀伤，而鼻咽癌细胞系CNE2仍保持很高的生存率, 说明以KDR启动子调控的HSVtk只在表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞特异性表达，并将GCV比较彻底地转化为血管内皮细胞的敏感毒性产物杀伤细胞. 但在CNE2 细胞中，由于CNE2细胞不表达KDR，故HSVtk不能在CNE2细胞表达，GCV不能被磷酸化而转变为细胞毒性产物，细胞也不被杀灭.
本结果表明，由于CMV缺乏特异性，导致其调控的自杀基因系统也缺乏特异性杀伤的能力. 而KDR启动子驱动的HSVtk自杀基因系统，只在具有KDR表达的血管内皮细胞发挥杀灭作用，具有高度的特异性, 提示腺病毒介导的、KDR启动子驱动的HSVtk自杀基因系统可在以肿瘤血管为靶点的肿瘤自杀基因治疗策略中发挥作用.
【参考文献】
[1] Shahin R, David L, Robert B, et al. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for antiangiogenesis therapy[J]. Nat Rev Cancer, 2002,10(2):826-835.
[2] Napoleone F. VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor[J]. Nat Rev Cancer, 2002,10(2):795-803.
[3] Hall SJ, Mutchnik SE, Chen SH, et al. Adenovinusmediated HSVtk gene and GCV therapy lead to systemic activity against spontaneous and induced metastasis in an orthotopic mouse model of prostate cancer [J].Int J Cancer,1997,70(2):183-187.
[4] 刘晓平，李宝金，张超. HSVtk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析[J]. 癌症，2006,25(2):179-184.
[5] Kong HL, Crystal RG. Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis[J]. Natl Cancer Inst,1998,90:273-286.
[6] 潘雪，李兆申，许国铭,等.CD/5FC系统对胰腺癌裸鼠移植瘤的抗血管形成作用的初步探讨[J].中华肝胆外科杂志,2002,8(12):717-720.
[7] 邱前辉，陈少华，李添应.血管内皮生长因子受体2(KDR)在鼻咽癌细胞系(CNE2)中表达的研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2006，27(1)：7-9.
编辑袁天峰
基金项目：江西省卫生厅科技资助(20052041)
(井冈山学院医学院耳鼻喉科，江西 吉安 343000，北京大学深圳医院肝胆胰外科，广东 深圳 518036), 百拇医药(朱欠元，周玉梅，李宝金，毛慕华，彭才圣，郭剑)