大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型的制作规范与评价
摘 要：通过对动物选择、麻醉剂选择、线栓制作、手术操作、观察指标等方面研究资料进行归纳、分析、比较，以期为建立大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型(MCAO)的基本制作规范提供理论指导。
关键词：大鼠；脑缺血模型；制作规范
随着社会环境因素和饮食结构的改变，人类脑血管病的发病率日益增加，其中缺血性脑血管病占80 %以上[1]，已成为危害人类健康的重大疾病。为了搞清楚该疾病的发病机理并寻找有效的治疗药物，近年来人们对脑缺血动物模型的制作方法做了大量的研究，建立了很多模拟人类各种脑缺血状态的动物模型，其中大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型(MCAO)已成为研究脑缺血发病机理和治疗药物的主要模型之一。笔者发现MCAO的制作缺乏统一规范，评价指标不稳定，重现性不好，故就近年来MCAO资料进行了归纳、分析、比较，以期建立一个基本的制作规范。
1 模型制作
1.1 线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型
1.1.1 实验大鼠的选择
(1) 品种与品系。在不同的大鼠品种之间，Fischer344大鼠的大脑中动脉(MCA)变异性小，梗死灶最大，MCA阻塞后形成的梗死体积一致性好；而Wistar大鼠的MCAO平均脑梗死体积最小，梗死灶变异最大；Sprague Dawley大鼠的模型效果居于两者之间[2]。所以主张选用Fischer344大鼠，可以制备较理想的MCAO模型。但因鼠源问题，目前多选用SD大鼠。另外，卒中病人常有高血压的危险因素存在，因此，自发性高血压大鼠也常被选用，并且发现自发性高血压大鼠MCAO平均脑梗死体积较正常血压大鼠大，且病变一致性好，同时发现雌性大鼠梗死体积较雄性大鼠小[3]。此外，由于沙土鼠基底动脉环结构的缺陷，左右两侧交通支缺乏，结扎一侧颈总动脉(CCA)就可引起明显的MCA缺血，缺血部位恒定而明显，也可被选用。但是只有大约2/3的沙土鼠有上述缺陷，故造模成功率低，约75 %[4]。
(2)年龄与身体质量。尽管脑梗塞多发于老年人群，但由于老年大鼠的MCA 发生了不同程度的迂曲、粥样硬化、管腔狭窄等解剖及病理上的改变，致使造模效果很差。因此，Wang[5]建议不宜盲目选择老年大鼠。目前仍以青壮年大鼠为优先选择。大鼠质量与其MCA 的粗细及长度呈正相关，线栓法MCAO 模型制作时大鼠质量与其栓线长度也呈正相关[6]。质量过大，颅内血管增粗，难以充分阻断MCA 血流；质量过小，有时栓线难以插入。目前认为，大鼠质量以250～350 g之间为宜[7-9]。
1.1.2 麻醉剂的选择全身麻醉直接或间接地影响血流、颅内压、脑代谢、神经递质的传递，甚至破坏细胞膜的结构[10]，所以麻醉剂的选择尤为重要。卜碧淘 [11]用Wistar 大鼠对常用的几种麻醉剂进行实验，结果表明，水合氯醛、苯巴比妥钠及乌拉坦对体温、呼吸、酸碱度有明显影响，而且术后复苏缓慢。建议常用2 %戊巴比妥钠40～45 mg/kg进行大鼠腹腔注射并保温，麻醉效果较好[12-13]。但也可以用10 %水合氯醛3~4 mL/kg腹腔注射麻醉[14]。国外常用盐酸氨胺酮等麻醉[15] 。在需要拔栓线进行再灌注时，可用乙醚进行短时间麻醉，术后并发证较少。
1.1.3 线栓的制作寻找一种内在性质均一，具有一定硬度和弹性的栓线是进一步提高线栓法大鼠MACO 模型成功率的关键。目前多用单尼龙线。在尼龙线大小方面，由于使用3-0尼龙线蛛网膜下腔出血(SAH)率明显高于4-0尼龙线，所以现多选用4-0尼龙线[16]。辛世萌等[7]在实验中找到最佳配伍方案为：大鼠质量250～330 g，线长17～18 mm，栓线直径0.28 mm。该方案制作的MCAO 模型成功率高、重复性好，对生理指标影响小。在栓线制备方面，Reglodi D 等[17]将Longa方法进行了改进，将4-0尼龙线烧成小的圆头，将圆头浸入0.1 %多聚赖氨酸溶液中，然后取出放在60 ℃条件下烤箱中干燥备用，结果全部成功阻塞，出现一致的梗死。还有采用固体石蜡经加热熔化后处理栓线，在栓线插入端5 mm处涂敷石蜡，取得了较好的栓塞效果，而且制作非常简便，它取代了Koizmi J涂硅树脂的方法[7，15，18]。栓线预先用肝素溶液浸泡处理，然后37 ℃烘干，可保证再灌注时血管的通畅[19]。
1.1.4 术前准备近几年的研究结果证实，局灶性或全脑性脑缺血时动物血糖轻度升高，而高血糖本身就可使脑梗死的面积明显增加。为了控制动物血糖水平，在实验前禁食12～24 h，但不禁水[12]。在实验室准备方面，将室温控制在25～30 ℃为宜。并尽可能准备好术中、术后实验动物的保暖或降温设备以及相关的生理机能监测装置。
1.1.5 手术操作改进Bederson[20]，Zea Longa[21]等方法。大鼠全身麻醉后，在颈正中部切开，手术显微镜下分离一侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)以及ECA 和ICA 的分支，并仔细分离迷走神经(神经节的刺激和损伤会引起大鼠呼吸骤停)，然后，有以下三种插线方法。
(1)剪断ECA 经其断端插线[22-23]。结扎并剪断ECA 分支，用动脉夹暂时阻断CCA，在距CCA 分叉0.8~1.0 cm处用双重丝线结扎ECA，结扎后从中间剪断。在ECA近心端剪一小口，将制备好的尼龙线从小口轻轻插入，经分叉处轻轻推入ICA ，当将尼龙线插入距CCA 分叉1.8～2.0 cm 处，并有轻微阻力时，表明尼龙线已插至Willie’s环大脑前动脉起始部位，阻塞了大脑中动脉主干的起始部。若同时应用激光多普勒微循环血流分析仪监测脑皮质血流量，当插到MCA时可出现微循环血流量的突然下降，出现微循环血流量下降后，再向内穿入约1 mm即可。随后在ECA 尼龙线插入的近心端用丝线结扎，这时，尼龙线插入的深度为17～18 mm。(2)从CCA插线[24-25]。用0号线结扎CCA和ECA，ICA挂线备用，在CCA扎线上端即ECA、ICA分叉膨大处下方剪一小口，将尼龙线球端插入小口中，缓慢送入ICA，当插入约(18.5±0.5)mm时停止插线，这个过程应提拉ICA的挂线，阻断血从ICA颅内段流出，插线完毕后，将ICA和尼龙线一起结扎，消毒，缝合皮肤后留1 cm尼龙线在皮肤外面。再灌注时轻轻外拉尼龙线，使球端退回CCA，实行再灌注。
(3)从ICA插线。张成英等[26]从ICA 的第一分支即翼腭动脉的根部插线，结果表明，定位准确、简便、易行、创伤小，可缩短栓线长度(3.61±0.4)mm，也相应缩短手术操作时间，减少对血管壁的刺激。但是，Zarow G J等[27]研究了280～320 g的SD大鼠，发现从ICA起始处进入深度22 mm 比进入18 mm产生神经功能障碍和缺血损害更可靠。
1.1.6 术后护理及并发证防治术后动物可放入笼中，监测体温，并注意保暖。笼中应保持干燥，没有积水及粉尘，防止动物误吸而窒息。术后动物可能会出现一些干扰实验的并发证，主要有蛛网膜下腔出血(SAH)，这与尼龙线的选择和操作手法有关。为了减少SAH发生率，应选用4-0尼龙线[28]；实验操作应轻柔，进线勿用力过度。另外尼龙线直接插入血管可以引起血管内皮的损害从而导致血栓的形成。所以，一些学者[29]使用肝素处理栓线避免血栓形成。Li F等[30]证实线栓法MCAO≥2 h可导致自发性高热。高热与下丘脑损害有关，所以建议术后保持麻醉和体温调控2 h，就能避免自发性高热[31]。Relodi研究发现MCAO后24 h内个别实验大鼠出现癫痫症状。Traystman[32]发现非药物治疗组大鼠出现抑郁、自发性活动减少。
1.2 FeCl3诱导大鼠大脑中动脉血栓栓塞模型[14，33]大鼠腹腔注射10 %水合氯醛溶液(0.35 g/kg)麻醉后侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点做一弧形切口，长约1.5 cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，于实体显微镜下在颞骨与颞鳞骨结合处靠近口侧1 mm处做一直径2.5 mm的骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。将吸有10 μL 50 % FeCl3溶液的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30 min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。室温控制在24 ℃左右。
1.3 其他杨渊等[34]建立了老年大鼠光化学诱导局灶性脑梗塞模型，王世军等[35]直接暴露大脑中动脉电凝或结扎制作局灶性脑梗塞模型，都取得了一定的效果，但技术规范性和稳定性还有待于用更多的实验研究来探讨。
2 评价指标
2.1 大鼠症状及体征的评价参照Bederson等[20]、Zeal longa等[21]的五级4分评分方法并改进。0分：未见神经病学征象，即无神经功能缺损症状，大鼠被提尾悬空时两前肢向地面伸直，置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm ，手感左右推动的阻力相等。1分：轻微的神经功能缺损，大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直。置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm ，手感左右推动的阻力相等。2分：中度局灶性神经功能缺损，有向瘫痪侧旋转征象，大鼠被提尾悬空时脑缺血对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直。置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm，手感左右推动的阻力不等，病灶对侧的侧向推动阻力明显减低。3分：重度局灶性神经功能缺损，有向病灶对侧跌倒征象。4分：无自发活动及意识水平下降。
2.2 脑电图特征分别在大鼠冠状缝前相当于皮层感觉运动区(额顶区) 部位和顶叶后部(顶枕区) 的左右两侧对称地放置脑电极各一个，电极尖端穿过颅骨接触硬脑膜，用牙科黏合剂固定，参考电极安置在鼻骨正中，八道生理记录仪记录。可以反映阻断侧大脑中动脉供血区、非供血区以及对侧相应部位的脑电变化。若应用脑电图仪，可放置更多的电极，能更准确地反映脑缺血的范围以及程度。缺血区脑电图出现波幅降低，频率减慢[36]。
2.3 软脑膜微循环观察可直接观察软脑膜微循环血液的灌流状况，结合专用的微循环图像处理系统，直接测量微血管的管径及血流速度。一般先在大鼠的颞顶部制作一颅窗，再进行观察。颅窗制作方法如下，脑立体定位仪固定头部，在一侧顶骨中央钻开一颅窗(4 mm×8 mm)。用骨蜡及电热烧灼器彻底止血，无菌生理盐水冲洗，待无任何出血点后，方可剪开硬脑膜。剪开硬脑膜之前，将1 mm 厚的玻片制成颅窗的大小及形状备用。将硬脑膜轻轻挑起，眼科剪小心剪开硬脑膜，此时即有脑脊液流出，迅速将颅窗处硬脑膜剪去，出血处可用血管钳钳夹止血。之后迅速将玻片覆盖于颅窗上，并避免出现气泡。牙科黏合剂封闭周围间隙，待变硬后，用手术刀将多余的部分切去。观察玻片周围是否有脑脊液渗出以及颅窗内是否有出血渗出。若颅窗周围无渗出，颅窗内无气泡及出血，脑血管无异常出现即表示颅窗制作成功[37]。颅窗制备完成后，将实验动物置于微循环观测仪下，可观察到清晰的软脑膜微血管图像。找到易于观察微动脉及微静脉管径符合观察要求的部位，通过摄像、录像或照相记录实验过程的微循环变化。连接计算机微循环图像处理系统，可较准确地测量微循环的各项指标。也可应用激光多普勒微循环血流分析仪，可将激光探头固定于颅窗上，只要保证激光探头在整个实验过程中无位置移动及转动， 即可准确地测定该部位的微循环血流量[38]。
2.4 微透析结合高效液相色谱观测应用微透析仪可在活体状态下，将动物置于立体定向仪上，在前囟右侧、前侧各1.5 mm 处插入微透析探针，深度3.5 mm(或感兴趣局域)。用灌流液灌流，速度2 μL/min ，基础灌流60 min 后收集微透析液。与高效液相色谱或毛细血管电泳仪连用，动态观测脑组织神经递质、神经内分泌激素等活性物质的动态变化[39]。
2.5 脑毛细血管通透性的评价大鼠尾静脉注射1 %依文斯蓝(50 mg/kg)之后结扎大鼠双侧颈总动脉。结扎后3 h ，断头取脑。然后将脑放入盛有5 mL 甲酸胺溶液试管中浸泡，并置于45 ℃恒温箱中温育72 h。取出后用7220或721分光光度计620 nm进行浸出液比色，测定光密度(A值)。再以标准曲线查出5 mL甲酸液中依文斯蓝含量，继而计算出单位脑重的依文斯蓝含量。以此评价毛细血管通透性。
2.6 脑组织含水量测定用以观察脑缺血损伤后脑组织水肿情况。一般在缺血模型复制后24 h ，快速剥出鼠脑，将左右大脑半球分别称重，然后置90～100 ℃烤箱内烤干至恒重(5 d后两次检查)。分别称量大脑半球干重，按以下公式计算大脑半球的含水量。含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100 %
2.7 脑组织内神经递质、血管活性物质及其他生物活性物质的测定取脑组织称重，以pH 7.0 PBS 缓冲液制成匀浆，4 ℃ 3000 r/min 离心30 min ，取上清液采用相应的方法，检测各项指标。如测定NO2和(或)NO3、SOD、MDA 等。
2.8 组织形态学观察动物断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4 ℃以下冠状切成5片，迅速将脑片置于TTC(2，4 ，5-三苯基四氮唑)染液中(每5 mL染液中含4 %TTC 1.5 mL，1 M K2HPO4 0.1 mL，其余加蒸馏水定容)，37 ℃避光温孵30 min，取出后置于10 %甲醛中避光保存24 h，经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量及患侧脑重量的百分比作为脑梗塞范围(%)。也可以对脑片染色并进行计算机图像分析，观察大鼠脑梗塞灶的范围。另外，可采用光学显微镜、电子显微镜研究镜下的组织细胞形态学改变；应用免疫组化检测脑内基因产物等重要功能蛋白的含量；采用原位PCR结合原位杂交，可观察基因的表达[40]。
3 小结
建立重复性好，生理指标控制严格的标准化脑缺血动物模型是研究缺血性脑损伤必不可少的工具，也是研究人员追求的目标。所以，重视并严格操作实验中的每一个步骤，对每一次实验结果都认真分析，不断总结经验，模型制作的成功率就一定会提高。
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(甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000), http://www.100md.com(吴国泰，王瑞琼，曾立斌，夏仁福 任远)
关键词：大鼠；脑缺血模型；制作规范
随着社会环境因素和饮食结构的改变，人类脑血管病的发病率日益增加，其中缺血性脑血管病占80 %以上[1]，已成为危害人类健康的重大疾病。为了搞清楚该疾病的发病机理并寻找有效的治疗药物，近年来人们对脑缺血动物模型的制作方法做了大量的研究，建立了很多模拟人类各种脑缺血状态的动物模型，其中大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型(MCAO)已成为研究脑缺血发病机理和治疗药物的主要模型之一。笔者发现MCAO的制作缺乏统一规范，评价指标不稳定，重现性不好，故就近年来MCAO资料进行了归纳、分析、比较，以期建立一个基本的制作规范。
1 模型制作
1.1 线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型
1.1.1 实验大鼠的选择
(1) 品种与品系。在不同的大鼠品种之间，Fischer344大鼠的大脑中动脉(MCA)变异性小，梗死灶最大，MCA阻塞后形成的梗死体积一致性好；而Wistar大鼠的MCAO平均脑梗死体积最小，梗死灶变异最大；Sprague Dawley大鼠的模型效果居于两者之间[2]。所以主张选用Fischer344大鼠，可以制备较理想的MCAO模型。但因鼠源问题，目前多选用SD大鼠。另外，卒中病人常有高血压的危险因素存在，因此，自发性高血压大鼠也常被选用，并且发现自发性高血压大鼠MCAO平均脑梗死体积较正常血压大鼠大，且病变一致性好，同时发现雌性大鼠梗死体积较雄性大鼠小[3]。此外，由于沙土鼠基底动脉环结构的缺陷，左右两侧交通支缺乏，结扎一侧颈总动脉(CCA)就可引起明显的MCA缺血，缺血部位恒定而明显，也可被选用。但是只有大约2/3的沙土鼠有上述缺陷，故造模成功率低，约75 %[4]。
(2)年龄与身体质量。尽管脑梗塞多发于老年人群，但由于老年大鼠的MCA 发生了不同程度的迂曲、粥样硬化、管腔狭窄等解剖及病理上的改变，致使造模效果很差。因此，Wang[5]建议不宜盲目选择老年大鼠。目前仍以青壮年大鼠为优先选择。大鼠质量与其MCA 的粗细及长度呈正相关，线栓法MCAO 模型制作时大鼠质量与其栓线长度也呈正相关[6]。质量过大，颅内血管增粗，难以充分阻断MCA 血流；质量过小，有时栓线难以插入。目前认为，大鼠质量以250～350 g之间为宜[7-9]。
1.1.2 麻醉剂的选择全身麻醉直接或间接地影响血流、颅内压、脑代谢、神经递质的传递，甚至破坏细胞膜的结构[10]，所以麻醉剂的选择尤为重要。卜碧淘 [11]用Wistar 大鼠对常用的几种麻醉剂进行实验，结果表明，水合氯醛、苯巴比妥钠及乌拉坦对体温、呼吸、酸碱度有明显影响，而且术后复苏缓慢。建议常用2 %戊巴比妥钠40～45 mg/kg进行大鼠腹腔注射并保温，麻醉效果较好[12-13]。但也可以用10 %水合氯醛3~4 mL/kg腹腔注射麻醉[14]。国外常用盐酸氨胺酮等麻醉[15] 。在需要拔栓线进行再灌注时，可用乙醚进行短时间麻醉，术后并发证较少。
1.1.3 线栓的制作寻找一种内在性质均一，具有一定硬度和弹性的栓线是进一步提高线栓法大鼠MACO 模型成功率的关键。目前多用单尼龙线。在尼龙线大小方面，由于使用3-0尼龙线蛛网膜下腔出血(SAH)率明显高于4-0尼龙线，所以现多选用4-0尼龙线[16]。辛世萌等[7]在实验中找到最佳配伍方案为：大鼠质量250～330 g，线长17～18 mm，栓线直径0.28 mm。该方案制作的MCAO 模型成功率高、重复性好，对生理指标影响小。在栓线制备方面，Reglodi D 等[17]将Longa方法进行了改进，将4-0尼龙线烧成小的圆头，将圆头浸入0.1 %多聚赖氨酸溶液中，然后取出放在60 ℃条件下烤箱中干燥备用，结果全部成功阻塞，出现一致的梗死。还有采用固体石蜡经加热熔化后处理栓线，在栓线插入端5 mm处涂敷石蜡，取得了较好的栓塞效果，而且制作非常简便，它取代了Koizmi J涂硅树脂的方法[7，15，18]。栓线预先用肝素溶液浸泡处理，然后37 ℃烘干，可保证再灌注时血管的通畅[19]。
1.1.4 术前准备近几年的研究结果证实，局灶性或全脑性脑缺血时动物血糖轻度升高，而高血糖本身就可使脑梗死的面积明显增加。为了控制动物血糖水平，在实验前禁食12～24 h，但不禁水[12]。在实验室准备方面，将室温控制在25～30 ℃为宜。并尽可能准备好术中、术后实验动物的保暖或降温设备以及相关的生理机能监测装置。
1.1.5 手术操作改进Bederson[20]，Zea Longa[21]等方法。大鼠全身麻醉后，在颈正中部切开，手术显微镜下分离一侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)以及ECA 和ICA 的分支，并仔细分离迷走神经(神经节的刺激和损伤会引起大鼠呼吸骤停)，然后，有以下三种插线方法。
(1)剪断ECA 经其断端插线[22-23]。结扎并剪断ECA 分支，用动脉夹暂时阻断CCA，在距CCA 分叉0.8~1.0 cm处用双重丝线结扎ECA，结扎后从中间剪断。在ECA近心端剪一小口，将制备好的尼龙线从小口轻轻插入，经分叉处轻轻推入ICA ，当将尼龙线插入距CCA 分叉1.8～2.0 cm 处，并有轻微阻力时，表明尼龙线已插至Willie’s环大脑前动脉起始部位，阻塞了大脑中动脉主干的起始部。若同时应用激光多普勒微循环血流分析仪监测脑皮质血流量，当插到MCA时可出现微循环血流量的突然下降，出现微循环血流量下降后，再向内穿入约1 mm即可。随后在ECA 尼龙线插入的近心端用丝线结扎，这时，尼龙线插入的深度为17～18 mm。(2)从CCA插线[24-25]。用0号线结扎CCA和ECA，ICA挂线备用，在CCA扎线上端即ECA、ICA分叉膨大处下方剪一小口，将尼龙线球端插入小口中，缓慢送入ICA，当插入约(18.5±0.5)mm时停止插线，这个过程应提拉ICA的挂线，阻断血从ICA颅内段流出，插线完毕后，将ICA和尼龙线一起结扎，消毒，缝合皮肤后留1 cm尼龙线在皮肤外面。再灌注时轻轻外拉尼龙线，使球端退回CCA，实行再灌注。
(3)从ICA插线。张成英等[26]从ICA 的第一分支即翼腭动脉的根部插线，结果表明，定位准确、简便、易行、创伤小，可缩短栓线长度(3.61±0.4)mm，也相应缩短手术操作时间，减少对血管壁的刺激。但是，Zarow G J等[27]研究了280～320 g的SD大鼠，发现从ICA起始处进入深度22 mm 比进入18 mm产生神经功能障碍和缺血损害更可靠。
1.1.6 术后护理及并发证防治术后动物可放入笼中，监测体温，并注意保暖。笼中应保持干燥，没有积水及粉尘，防止动物误吸而窒息。术后动物可能会出现一些干扰实验的并发证，主要有蛛网膜下腔出血(SAH)，这与尼龙线的选择和操作手法有关。为了减少SAH发生率，应选用4-0尼龙线[28]；实验操作应轻柔，进线勿用力过度。另外尼龙线直接插入血管可以引起血管内皮的损害从而导致血栓的形成。所以，一些学者[29]使用肝素处理栓线避免血栓形成。Li F等[30]证实线栓法MCAO≥2 h可导致自发性高热。高热与下丘脑损害有关，所以建议术后保持麻醉和体温调控2 h，就能避免自发性高热[31]。Relodi研究发现MCAO后24 h内个别实验大鼠出现癫痫症状。Traystman[32]发现非药物治疗组大鼠出现抑郁、自发性活动减少。
1.2 FeCl3诱导大鼠大脑中动脉血栓栓塞模型[14，33]大鼠腹腔注射10 %水合氯醛溶液(0.35 g/kg)麻醉后侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点做一弧形切口，长约1.5 cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，于实体显微镜下在颞骨与颞鳞骨结合处靠近口侧1 mm处做一直径2.5 mm的骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。将吸有10 μL 50 % FeCl3溶液的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30 min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。室温控制在24 ℃左右。
1.3 其他杨渊等[34]建立了老年大鼠光化学诱导局灶性脑梗塞模型，王世军等[35]直接暴露大脑中动脉电凝或结扎制作局灶性脑梗塞模型，都取得了一定的效果，但技术规范性和稳定性还有待于用更多的实验研究来探讨。
2 评价指标
2.1 大鼠症状及体征的评价参照Bederson等[20]、Zeal longa等[21]的五级4分评分方法并改进。0分：未见神经病学征象，即无神经功能缺损症状，大鼠被提尾悬空时两前肢向地面伸直，置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm ，手感左右推动的阻力相等。1分：轻微的神经功能缺损，大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直。置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm ，手感左右推动的阻力相等。2分：中度局灶性神经功能缺损，有向瘫痪侧旋转征象，大鼠被提尾悬空时脑缺血对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直。置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm，手感左右推动的阻力不等，病灶对侧的侧向推动阻力明显减低。3分：重度局灶性神经功能缺损，有向病灶对侧跌倒征象。4分：无自发活动及意识水平下降。
2.2 脑电图特征分别在大鼠冠状缝前相当于皮层感觉运动区(额顶区) 部位和顶叶后部(顶枕区) 的左右两侧对称地放置脑电极各一个，电极尖端穿过颅骨接触硬脑膜，用牙科黏合剂固定，参考电极安置在鼻骨正中，八道生理记录仪记录。可以反映阻断侧大脑中动脉供血区、非供血区以及对侧相应部位的脑电变化。若应用脑电图仪，可放置更多的电极，能更准确地反映脑缺血的范围以及程度。缺血区脑电图出现波幅降低，频率减慢[36]。
2.3 软脑膜微循环观察可直接观察软脑膜微循环血液的灌流状况，结合专用的微循环图像处理系统，直接测量微血管的管径及血流速度。一般先在大鼠的颞顶部制作一颅窗，再进行观察。颅窗制作方法如下，脑立体定位仪固定头部，在一侧顶骨中央钻开一颅窗(4 mm×8 mm)。用骨蜡及电热烧灼器彻底止血，无菌生理盐水冲洗，待无任何出血点后，方可剪开硬脑膜。剪开硬脑膜之前，将1 mm 厚的玻片制成颅窗的大小及形状备用。将硬脑膜轻轻挑起，眼科剪小心剪开硬脑膜，此时即有脑脊液流出，迅速将颅窗处硬脑膜剪去，出血处可用血管钳钳夹止血。之后迅速将玻片覆盖于颅窗上，并避免出现气泡。牙科黏合剂封闭周围间隙，待变硬后，用手术刀将多余的部分切去。观察玻片周围是否有脑脊液渗出以及颅窗内是否有出血渗出。若颅窗周围无渗出，颅窗内无气泡及出血，脑血管无异常出现即表示颅窗制作成功[37]。颅窗制备完成后，将实验动物置于微循环观测仪下，可观察到清晰的软脑膜微血管图像。找到易于观察微动脉及微静脉管径符合观察要求的部位，通过摄像、录像或照相记录实验过程的微循环变化。连接计算机微循环图像处理系统，可较准确地测量微循环的各项指标。也可应用激光多普勒微循环血流分析仪，可将激光探头固定于颅窗上，只要保证激光探头在整个实验过程中无位置移动及转动， 即可准确地测定该部位的微循环血流量[38]。
2.4 微透析结合高效液相色谱观测应用微透析仪可在活体状态下，将动物置于立体定向仪上，在前囟右侧、前侧各1.5 mm 处插入微透析探针，深度3.5 mm(或感兴趣局域)。用灌流液灌流，速度2 μL/min ，基础灌流60 min 后收集微透析液。与高效液相色谱或毛细血管电泳仪连用，动态观测脑组织神经递质、神经内分泌激素等活性物质的动态变化[39]。
2.5 脑毛细血管通透性的评价大鼠尾静脉注射1 %依文斯蓝(50 mg/kg)之后结扎大鼠双侧颈总动脉。结扎后3 h ，断头取脑。然后将脑放入盛有5 mL 甲酸胺溶液试管中浸泡，并置于45 ℃恒温箱中温育72 h。取出后用7220或721分光光度计620 nm进行浸出液比色，测定光密度(A值)。再以标准曲线查出5 mL甲酸液中依文斯蓝含量，继而计算出单位脑重的依文斯蓝含量。以此评价毛细血管通透性。
2.6 脑组织含水量测定用以观察脑缺血损伤后脑组织水肿情况。一般在缺血模型复制后24 h ，快速剥出鼠脑，将左右大脑半球分别称重，然后置90～100 ℃烤箱内烤干至恒重(5 d后两次检查)。分别称量大脑半球干重，按以下公式计算大脑半球的含水量。含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100 %
2.7 脑组织内神经递质、血管活性物质及其他生物活性物质的测定取脑组织称重，以pH 7.0 PBS 缓冲液制成匀浆，4 ℃ 3000 r/min 离心30 min ，取上清液采用相应的方法，检测各项指标。如测定NO2和(或)NO3、SOD、MDA 等。
2.8 组织形态学观察动物断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在4 ℃以下冠状切成5片，迅速将脑片置于TTC(2，4 ，5-三苯基四氮唑)染液中(每5 mL染液中含4 %TTC 1.5 mL，1 M K2HPO4 0.1 mL，其余加蒸馏水定容)，37 ℃避光温孵30 min，取出后置于10 %甲醛中避光保存24 h，经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量及患侧脑重量的百分比作为脑梗塞范围(%)。也可以对脑片染色并进行计算机图像分析，观察大鼠脑梗塞灶的范围。另外，可采用光学显微镜、电子显微镜研究镜下的组织细胞形态学改变；应用免疫组化检测脑内基因产物等重要功能蛋白的含量；采用原位PCR结合原位杂交，可观察基因的表达[40]。
3 小结
建立重复性好，生理指标控制严格的标准化脑缺血动物模型是研究缺血性脑损伤必不可少的工具，也是研究人员追求的目标。所以，重视并严格操作实验中的每一个步骤，对每一次实验结果都认真分析，不断总结经验，模型制作的成功率就一定会提高。
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(甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000), http://www.100md.com(吴国泰，王瑞琼，曾立斌，夏仁福 任远)