深圳市中央空调冷却塔水军团菌AFLP分型研究
摘要:目的 了解深圳市中央空调冷却塔水中军团菌的多态性，分析优势种群和菌型分布，为建立军团菌分子型别库提供资料。 方法 运用The European Working Group for Legionella Infections(E.W.G.L.I)组织制定的扩增片断长度多态性分型(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)方法，对深圳市中央空调冷却塔水中军团菌进行分子分型。 结果 按照血清分型方法，将冷却塔水中军团菌分为Lp 1 、Lp 2～14 以及非嗜肺型，运用AFLP技术对50株军团菌菌株分型，结果将22株Lp 1 血清型分为7种AFLP型，分别记为AFLP1-7，以AFLP2型与AFLP5型为主要型别;20株Lp 2～14 血清型分为7种AFLP型，分别记为AFLPⅠ-AFLPⅦ，以AFLPⅠ、Ⅱ为主要型别;9株非嗜肺军团菌血清型分为5种AFLP图谱。 结论 AFLP分型技术能初步分析深圳市军团菌优势种群，为对军团菌监测及致病性军团菌型别的分析提供基本资料。
关键词:军团菌;AFLP分型;PCR;血清分型
Study on the typing of Legionella from cooling tower in Shenzhen City by using AFLP.
YUAN Meng，YU Mu-hua，WEN Qun-wen，et al.
(Nanshan District Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518054，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To understand the polymorphism of Legionella，the predominate colony，distribution of clones of Legionella from cooling towers in ShenZhen City and for set up preliminary typing data. Methods Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)made by the European Working Group for Legionella Infections was used for typing Legionella from cooling towers in ShenZhen. Results The Legionella was differentiated into three types:Lp 1 、Lp 2-14 and non-Legionella pneumophila.50strains of Legionella and the serogroup Lp 1 were differentiated into7types，the mianly types were AFLP1-7，AFLP2and AFLP5.The20strains of serogroup Lp 2-14 were differentiated into7types，the main types were AFLPⅠ-AFLPⅦ，AFLPⅠANDⅡ.The9serotypes of non-Legionella pneumophila were differentiated into5types. Conclusion The predomi-nate colony o Legionella can be preliminary discovered by use of AFLP in ShenZhen to have offered basic data for monitoring and dif-ferentiating study in the future.
Key words:Legionella;AFLP typing;PCR;serotype
1976年美国费城一种不明原因的传染性疾病在参加集会的退伍军人中暴发流行，221名受染者中有34名死亡，病死率高达15.38%。1978年正式将其命名为嗜肺军团菌(Legionella Pneumophila，Lp)。该菌存在于水和土壤中，尤其在供水系统、空调系统中较为常见，主要是通过气溶胶的方式进行传播。由于军团菌的营养要求较高，在水温较低、营养较贫乏的天然水体中不易繁殖。但如果供水温度较高，或者供水管道的管壁、冷却塔水池池壁上形成积垢和生物膜，就会为军团菌的大量增殖提供适宜的环境和营养条件。由于水温较高，冷却塔不常清洗，容易滋生藻类，冷却塔的循环水和空调的冷凝水为军团菌提供了良好的栖息和繁殖环境，使空调系统、冷却塔和供水系统成为军团菌的主要传播源。军团菌至今已定名的有46个种，70个血清型，其中至少19种可致肺炎 [1] 。但可引起人类肺炎的军团菌最多见的为嗜肺军团菌1、4、6血清型和米克戴德军团菌 [2] 。因此确定军团菌的型别，以区分致病型与非致病 型，为临床提供诊断依据以及病因溯源有着重大意义。
European Working Group on Legionella Infections(E.W.G.L.I)组织制定了用AFLP技术检测军团菌的标准方法。此方法经该组织证实具有高度重复性，并且操作简单。AFLP方法基本原理是对基因总DNA酶切后形成分子量大小不等的随机限制性片断，将特定的接头连在这些片断的两端，形成一个带接头的特异片断，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，对特异性片断进行选择性扩增 [3～6] 。本课题应用AFLP方法初步探索基因分型方法，初步了解深圳市公共场所中央空调冷却塔水中军团菌菌型分布。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 军团菌标准菌株Lp 1 (ATCC33152);Lp 3 (ATCC33155);Lp 4 (ATCC33156);Lp 5 (ATCC33216);Lp 7 (ATCC33823)(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室馈赠);血清型鉴定试剂Legionella pneumo group1(Lp 1 型)，Legionella pneumo group 2～14 (Lp 2～14 型)及Legionella species test kit(非嗜肺型)对所分离的军团菌菌株进行血清分型鉴定;BCYE分离培养基(英国OXOID公司);基因DNA提取试剂盒(sigma公司);PCR Beads(Amersham Pharmacia Biotech公司);Pst1内切酶(Roche公司);T4DNA连接酶，T4DNA ligase Buffer(Roche公司);1×TE Buffer(上海生工生物工程公司);PCR Marker(DNA marker DL2000与100bp DNA Ladder marker，购自大连宝生物有限公司);7.5mol/L醋酸氨;纯乙醇;70%乙醇;矿物油(sigma公司);琼脂糖，溴化乙锭(EB)，Tris碱(Promaga公司);耗材:0.2ml PCR反应管，1.5ml eppendoff管，10μl;100μl;1000μl吸头(均购自Axygen公司);基因扩增仪(美国PE公司2400型);32R台式高速冷冻离心机(德国HETTICH公司);1μl，10μl，100μl，1000μl微量加样器(法国Gilson公司);电泳仪，电泳槽(北京六一仪器厂);柯达120凝胶成像系统(美国柯达公司);电热恒温水槽(上海精密医疗器械厂);微型振荡器(仪科公司)。
1.2 PCR引物
引物1:AFLP-LG1:5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3';引物2:AFLP-LG2:5'-TGTACGCAGTCTAC-3';引物3:AFLP-Pst1-G:5'-GACTGCGTACATGCAGG-3'(均由上海宝生物工程有限公司合成)
1.3 方法
1.3.1 采集深圳市公共场所中央空调冷却塔水115份，按照ISO标准《Water quality-Detection and enumeration of Legionella》(ISO11731:1998) [10] 进行分离鉴定，分离到50株军团菌，经血清学分型，其中嗜肺军团菌血清型1型(Lp 1 )22株，嗜肺军团菌2-14型(Lp 2-14 )20株，非嗜肺型9株。
1.3.2 提取DNA并计算其含量 收集在BCYE培养基上生长48～72h纯菌落，菌量1×10 8 ～1×10 10 cfu/ml，由基因DNA试剂盒提取DNA。用紫外分光光度计测DNA吸光度值(OD)，根据公式，计算DNA含量，按照要求DNA含量需达到1.5μg以上。
1.3.3 限制酶切反应以及特定接头连接 [11] 1.5μg DNA中，加入Pst120units，T4ligase1unit，AFLP-LG1、AFLP-LG2各0.2μg，总体积20μl，37℃，酶切反应3h。将酶切产物提纯，溶于pH8.0TE。
1.3.4 以PCR为基础的AFLP反应 在进行PCR反应之前，将溶于TE产物按1:100稀释，吸取5μl作为PCR反应模板，加入PCR Beads。PCR反应体系:模板DNA5μl，AFLP-Pst1-G(42.9ng/μl)1.75μl;PCR Beads，灭菌蒸馏水18.75μl，总体积25μl。循环参数94℃预变性4min;94℃1min，60℃1min，72℃1min;33个循环;72℃，延伸5min。
1.3.5 凝胶电泳成像 电泳缓冲液采用0.5×TBE，配1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)，吸7μl PCR产物与2μl3×Loading Dye混合，在3.45V/cm电压下电泳4h，用凝胶成像系统拍照，分析电泳结果。
2 结果
AFLP将三种血清型分型的军团菌进行分子分型，不同的 型别之间每一条带分子量大小不同，而相同型别则每一条带分子量大小均相同。具体分型结果见表1～3。
2.1 血清型Lp 1 军团菌的AFLP图谱分型 从表1可知Lp 1 型军团菌共有7种不同的AFLP图谱，分别记为AFLP1-7，AFLP2(7株)与AFLP5(6株)为主要型别。AFLP1、6、7型条带数目相同，但是条带的分子量则完全不同。
表1 血清型Lp 1 AFLP图谱分型AFLP(略)
2.2 血清型Lp 2-14 军团菌AFLP图谱分型 从表2可知Lp 2-14 型军团菌共有7种不同的AFLP图谱，分别记为AFLPⅠ-Ⅶ，AFLPⅠ(7株)与AFLPⅡ(5株)为主要型别。AFLPⅡ、Ⅵ、Ⅶ型条带数目均为8条，AFLPⅠ与Ⅲ型条带数目均为9条，AFLPⅣ与Ⅴ条带数目均为11条，但从分子量来看各不相同，故为不同的型别。
表2 血清型Lp 2-14 军团菌AFLP图谱分型AFLP(略)
2.3 血清型非嗜肺军团菌AFLP图谱分型 从表3可知非嗜肺军团菌共有5种不同的AFLP图谱，分别记为AFLPa-e。AFLPb与AFLPc的条带数目一致，分子量大小不同。
3 讨论
3.1 随着分子生物学的发展，已经有多种分型方法应用于军团菌的分型，如脉冲场电泳限制性内切酶分析(PFGE) [7] ，单克隆抗体(MAb)等。但其分析、辨别力、操作标准化及判断不尽相同，理想的基因分型技术应能在各实验室之间产生恒定的、可比较分析的结果和建立可靠的数据资料库 [8，9] 。
3.2 AFLP分型技术参照《Standard European Working Group on Legionella Infections Amplified Fragment Length Polymorphism Protocol1.2》标准 [10] 。12个欧洲国家的13家中心实验室对此方法进行了评估，结果表明此方法可以作为流行病学分型的快速筛查，并且此方法具有高度的重复性。E.W.G.L.I已经将此方法作为军团菌分型方法的第一个区域性标准 [11] 。
表3 血清型非嗜肺军团菌AFLP图谱分型AFLP(略)
3.3 AFLP技术可以确定流行菌株，识别地理优势株，对军团菌进行AFLP分型能够更好的理解其流行病学特征。暴发流行时，不同的菌株可以同时感染同一机体，尽管其表现形态一致，但基因型可能不一致，仅靠传统分离方法以及血清学方法无法对其进行鉴定，因此对军团菌进行基因分型，以确认分子型别，对更好的掌握军团菌流行病学特征，很有必要。
3.4 从表1～3可以看出，扩增的DNA片段分为多种型别，不同菌株之间存在着差异，说明不同菌种之间存在着较为丰富的多态性。
3.5 本研究共调查深圳市公共场所中央空调冷却塔115个，38个冷却塔分离出军团菌，冷却塔军团菌污染率为33.0%。通过军团菌的诊断血清学分型，深圳市公共场所中央空调冷却塔分离50株嗜肺军团菌菌株主要包括Lp 1 、Lp 2-14 和非嗜肺血清型，其中血清分型为Lp 1 型共22株，AFLP分型分为7种不同图谱，以AFLP2与AFLP5为主要型别;血清分型为Lp 2-14 共20株，AFLP分型分为7种不同图谱，以AFLPⅠ、AFLPⅡ为主要型别;血清分型为非嗜肺军团菌的共9株，AFLP分型分为5种不同图谱。Harrison报道 [12] ，军团菌Lp1血清型可分为不同得血清亚型，本研究通过AFLP方法将22株嗜肺军团菌菌株分为7 种不同基因型，与该报道相符。本次实验中，由于Lp 2-14 型与非嗜肺型血清为混合血清，不能进行具体的血清型区分，采用AFLP方法，将20株Lp 2-14 血清型分为7种不同型别，非嗜肺型分为5种不同型别，显然AFLP分型方法比常规血清分型方法能够更好区分不同型之间差异。本研究采用AFLP方法进行分子分型，在普通琼脂糖凝胶电泳检测下就获得了多态性丰富和重复性好的DNA指纹图谱，掌握初步的分型资料。但因为采样量有限和各区采样量之间的差异对取得深圳市公共场所中央空调水中优势菌种、菌型分布资料存在一定局限，因此需全面掌握深圳市公共场所中央空调水中优势种群、菌型分布资料，分析菌种之间的同源性关系还需进一步研究。
参考文献:
[1]O'Connell WA，Ohand L，Ciandiotto NP.et al.Infection of mscrophage-like cills by legionella species that have not been associated with disease[J].Infect Immun，1996，64:4381.
[2]施毅.非典型性肺炎[J].山东医药，2000，4(19):51～52.
[3]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP:a newtechnique for DNA finger-printing[J].Nucleic Acids Res，1995，23(21):4407～4414.
[4]梁智勇，史景泉.AFLP技术研究进展[J].第三军医大学学报，2001，23(6):S136～138.
[5]翁跃进.AFLP—一种DNA分子标记新技术[J].遗传，1996，18(6):29～31.
[6]Sanelkoul P HM.Aarts H JM，Haas J D，et al.Amplified-fragment Length Polymorphism Analysis:the state of an Art[J].J Clin Micorbiol，1999，37(10):3083～3091.
[7]JANET M.PRUCKLER，LEONARD A.MERMEL，et al.Comparison of Le-gionella pueumophila Isolates by Arbitrarily Primed PCR and Pulsed-Field Gel Electrophoresis:Analysis from Seven Epidemic Investigatons[J].Jounal of Clinical Microbiology，1995，33(11):2872～2875.
[8]O.PEROLA，J.KAUPPINEN，et al.Nosocomial Legionella pneumophila ser-group5outbreak associated with persistent colonization of a hospital water system[J].APMIS，2002，110:863～868.
[9] CALUDIO VALSANGIACOMO，FRANCA BAGGI，et al.Use of Amplified Fragment Length Polymorphism in Molecular Typing of Legionella pneu-mophila and Application to Epidemiological Studies[J].Journal of Clinical Microbiology，1995，33(7):1716～1719.
[10]www.ewgli.org.The European Working Group for Legionella Infections.Standard European Working Group on Legionella Infections Amplified Fragment Length Polymorphism Protocol(Version1.2).
[11] N.K.Fry，J.M.Bangsborg，etc.Assessment of Intercentre Reprocucibility and Epidemiological Concordance of Legionella pneumophila Serogroup1Genotying by Amplifed Fragment Length Polymorphism Analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2000，19:773～780.
[12]HarrisonT.G.，N.A.Saunders，A.Haththotuwa，N.Doshi，et al.Further evidence that genotypically closely related strains of Legionella pneumophi-la can express different sergroup specific antigens[J].J.Med.Microbiol，1992，37:155～161., http://www.100md.com(袁梦，俞慕华，温群文，段永翔)
关键词:军团菌;AFLP分型;PCR;血清分型
Study on the typing of Legionella from cooling tower in Shenzhen City by using AFLP.
YUAN Meng，YU Mu-hua，WEN Qun-wen，et al.
(Nanshan District Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518054，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To understand the polymorphism of Legionella，the predominate colony，distribution of clones of Legionella from cooling towers in ShenZhen City and for set up preliminary typing data. Methods Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)made by the European Working Group for Legionella Infections was used for typing Legionella from cooling towers in ShenZhen. Results The Legionella was differentiated into three types:Lp 1 、Lp 2-14 and non-Legionella pneumophila.50strains of Legionella and the serogroup Lp 1 were differentiated into7types，the mianly types were AFLP1-7，AFLP2and AFLP5.The20strains of serogroup Lp 2-14 were differentiated into7types，the main types were AFLPⅠ-AFLPⅦ，AFLPⅠANDⅡ.The9serotypes of non-Legionella pneumophila were differentiated into5types. Conclusion The predomi-nate colony o Legionella can be preliminary discovered by use of AFLP in ShenZhen to have offered basic data for monitoring and dif-ferentiating study in the future.
Key words:Legionella;AFLP typing;PCR;serotype
1976年美国费城一种不明原因的传染性疾病在参加集会的退伍军人中暴发流行，221名受染者中有34名死亡，病死率高达15.38%。1978年正式将其命名为嗜肺军团菌(Legionella Pneumophila，Lp)。该菌存在于水和土壤中，尤其在供水系统、空调系统中较为常见，主要是通过气溶胶的方式进行传播。由于军团菌的营养要求较高，在水温较低、营养较贫乏的天然水体中不易繁殖。但如果供水温度较高，或者供水管道的管壁、冷却塔水池池壁上形成积垢和生物膜，就会为军团菌的大量增殖提供适宜的环境和营养条件。由于水温较高，冷却塔不常清洗，容易滋生藻类，冷却塔的循环水和空调的冷凝水为军团菌提供了良好的栖息和繁殖环境，使空调系统、冷却塔和供水系统成为军团菌的主要传播源。军团菌至今已定名的有46个种，70个血清型，其中至少19种可致肺炎 [1] 。但可引起人类肺炎的军团菌最多见的为嗜肺军团菌1、4、6血清型和米克戴德军团菌 [2] 。因此确定军团菌的型别，以区分致病型与非致病 型，为临床提供诊断依据以及病因溯源有着重大意义。
European Working Group on Legionella Infections(E.W.G.L.I)组织制定了用AFLP技术检测军团菌的标准方法。此方法经该组织证实具有高度重复性，并且操作简单。AFLP方法基本原理是对基因总DNA酶切后形成分子量大小不等的随机限制性片断，将特定的接头连在这些片断的两端，形成一个带接头的特异片断，通过接头序列和PCR引物3'端的识别，对特异性片断进行选择性扩增 [3～6] 。本课题应用AFLP方法初步探索基因分型方法，初步了解深圳市公共场所中央空调冷却塔水中军团菌菌型分布。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 军团菌标准菌株Lp 1 (ATCC33152);Lp 3 (ATCC33155);Lp 4 (ATCC33156);Lp 5 (ATCC33216);Lp 7 (ATCC33823)(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室馈赠);血清型鉴定试剂Legionella pneumo group1(Lp 1 型)，Legionella pneumo group 2～14 (Lp 2～14 型)及Legionella species test kit(非嗜肺型)对所分离的军团菌菌株进行血清分型鉴定;BCYE分离培养基(英国OXOID公司);基因DNA提取试剂盒(sigma公司);PCR Beads(Amersham Pharmacia Biotech公司);Pst1内切酶(Roche公司);T4DNA连接酶，T4DNA ligase Buffer(Roche公司);1×TE Buffer(上海生工生物工程公司);PCR Marker(DNA marker DL2000与100bp DNA Ladder marker，购自大连宝生物有限公司);7.5mol/L醋酸氨;纯乙醇;70%乙醇;矿物油(sigma公司);琼脂糖，溴化乙锭(EB)，Tris碱(Promaga公司);耗材:0.2ml PCR反应管，1.5ml eppendoff管，10μl;100μl;1000μl吸头(均购自Axygen公司);基因扩增仪(美国PE公司2400型);32R台式高速冷冻离心机(德国HETTICH公司);1μl，10μl，100μl，1000μl微量加样器(法国Gilson公司);电泳仪，电泳槽(北京六一仪器厂);柯达120凝胶成像系统(美国柯达公司);电热恒温水槽(上海精密医疗器械厂);微型振荡器(仪科公司)。
1.2 PCR引物
引物1:AFLP-LG1:5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3';引物2:AFLP-LG2:5'-TGTACGCAGTCTAC-3';引物3:AFLP-Pst1-G:5'-GACTGCGTACATGCAGG-3'(均由上海宝生物工程有限公司合成)
1.3 方法
1.3.1 采集深圳市公共场所中央空调冷却塔水115份，按照ISO标准《Water quality-Detection and enumeration of Legionella》(ISO11731:1998) [10] 进行分离鉴定，分离到50株军团菌，经血清学分型，其中嗜肺军团菌血清型1型(Lp 1 )22株，嗜肺军团菌2-14型(Lp 2-14 )20株，非嗜肺型9株。
1.3.2 提取DNA并计算其含量 收集在BCYE培养基上生长48～72h纯菌落，菌量1×10 8 ～1×10 10 cfu/ml，由基因DNA试剂盒提取DNA。用紫外分光光度计测DNA吸光度值(OD)，根据公式，计算DNA含量，按照要求DNA含量需达到1.5μg以上。
1.3.3 限制酶切反应以及特定接头连接 [11] 1.5μg DNA中，加入Pst120units，T4ligase1unit，AFLP-LG1、AFLP-LG2各0.2μg，总体积20μl，37℃，酶切反应3h。将酶切产物提纯，溶于pH8.0TE。
1.3.4 以PCR为基础的AFLP反应 在进行PCR反应之前，将溶于TE产物按1:100稀释，吸取5μl作为PCR反应模板，加入PCR Beads。PCR反应体系:模板DNA5μl，AFLP-Pst1-G(42.9ng/μl)1.75μl;PCR Beads，灭菌蒸馏水18.75μl，总体积25μl。循环参数94℃预变性4min;94℃1min，60℃1min，72℃1min;33个循环;72℃，延伸5min。
1.3.5 凝胶电泳成像 电泳缓冲液采用0.5×TBE，配1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)，吸7μl PCR产物与2μl3×Loading Dye混合，在3.45V/cm电压下电泳4h，用凝胶成像系统拍照，分析电泳结果。
2 结果
AFLP将三种血清型分型的军团菌进行分子分型，不同的 型别之间每一条带分子量大小不同，而相同型别则每一条带分子量大小均相同。具体分型结果见表1～3。
2.1 血清型Lp 1 军团菌的AFLP图谱分型 从表1可知Lp 1 型军团菌共有7种不同的AFLP图谱，分别记为AFLP1-7，AFLP2(7株)与AFLP5(6株)为主要型别。AFLP1、6、7型条带数目相同，但是条带的分子量则完全不同。
表1 血清型Lp 1 AFLP图谱分型AFLP(略)
2.2 血清型Lp 2-14 军团菌AFLP图谱分型 从表2可知Lp 2-14 型军团菌共有7种不同的AFLP图谱，分别记为AFLPⅠ-Ⅶ，AFLPⅠ(7株)与AFLPⅡ(5株)为主要型别。AFLPⅡ、Ⅵ、Ⅶ型条带数目均为8条，AFLPⅠ与Ⅲ型条带数目均为9条，AFLPⅣ与Ⅴ条带数目均为11条，但从分子量来看各不相同，故为不同的型别。
表2 血清型Lp 2-14 军团菌AFLP图谱分型AFLP(略)
2.3 血清型非嗜肺军团菌AFLP图谱分型 从表3可知非嗜肺军团菌共有5种不同的AFLP图谱，分别记为AFLPa-e。AFLPb与AFLPc的条带数目一致，分子量大小不同。
3 讨论
3.1 随着分子生物学的发展，已经有多种分型方法应用于军团菌的分型，如脉冲场电泳限制性内切酶分析(PFGE) [7] ，单克隆抗体(MAb)等。但其分析、辨别力、操作标准化及判断不尽相同，理想的基因分型技术应能在各实验室之间产生恒定的、可比较分析的结果和建立可靠的数据资料库 [8，9] 。
3.2 AFLP分型技术参照《Standard European Working Group on Legionella Infections Amplified Fragment Length Polymorphism Protocol1.2》标准 [10] 。12个欧洲国家的13家中心实验室对此方法进行了评估，结果表明此方法可以作为流行病学分型的快速筛查，并且此方法具有高度的重复性。E.W.G.L.I已经将此方法作为军团菌分型方法的第一个区域性标准 [11] 。
表3 血清型非嗜肺军团菌AFLP图谱分型AFLP(略)
3.3 AFLP技术可以确定流行菌株，识别地理优势株，对军团菌进行AFLP分型能够更好的理解其流行病学特征。暴发流行时，不同的菌株可以同时感染同一机体，尽管其表现形态一致，但基因型可能不一致，仅靠传统分离方法以及血清学方法无法对其进行鉴定，因此对军团菌进行基因分型，以确认分子型别，对更好的掌握军团菌流行病学特征，很有必要。
3.4 从表1～3可以看出，扩增的DNA片段分为多种型别，不同菌株之间存在着差异，说明不同菌种之间存在着较为丰富的多态性。
3.5 本研究共调查深圳市公共场所中央空调冷却塔115个，38个冷却塔分离出军团菌，冷却塔军团菌污染率为33.0%。通过军团菌的诊断血清学分型，深圳市公共场所中央空调冷却塔分离50株嗜肺军团菌菌株主要包括Lp 1 、Lp 2-14 和非嗜肺血清型，其中血清分型为Lp 1 型共22株，AFLP分型分为7种不同图谱，以AFLP2与AFLP5为主要型别;血清分型为Lp 2-14 共20株，AFLP分型分为7种不同图谱，以AFLPⅠ、AFLPⅡ为主要型别;血清分型为非嗜肺军团菌的共9株，AFLP分型分为5种不同图谱。Harrison报道 [12] ，军团菌Lp1血清型可分为不同得血清亚型，本研究通过AFLP方法将22株嗜肺军团菌菌株分为7 种不同基因型，与该报道相符。本次实验中，由于Lp 2-14 型与非嗜肺型血清为混合血清，不能进行具体的血清型区分，采用AFLP方法，将20株Lp 2-14 血清型分为7种不同型别，非嗜肺型分为5种不同型别，显然AFLP分型方法比常规血清分型方法能够更好区分不同型之间差异。本研究采用AFLP方法进行分子分型，在普通琼脂糖凝胶电泳检测下就获得了多态性丰富和重复性好的DNA指纹图谱，掌握初步的分型资料。但因为采样量有限和各区采样量之间的差异对取得深圳市公共场所中央空调水中优势菌种、菌型分布资料存在一定局限，因此需全面掌握深圳市公共场所中央空调水中优势种群、菌型分布资料，分析菌种之间的同源性关系还需进一步研究。
参考文献:
[1]O'Connell WA，Ohand L，Ciandiotto NP.et al.Infection of mscrophage-like cills by legionella species that have not been associated with disease[J].Infect Immun，1996，64:4381.
[2]施毅.非典型性肺炎[J].山东医药，2000，4(19):51～52.
[3]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP:a newtechnique for DNA finger-printing[J].Nucleic Acids Res，1995，23(21):4407～4414.
[4]梁智勇，史景泉.AFLP技术研究进展[J].第三军医大学学报，2001，23(6):S136～138.
[5]翁跃进.AFLP—一种DNA分子标记新技术[J].遗传，1996，18(6):29～31.
[6]Sanelkoul P HM.Aarts H JM，Haas J D，et al.Amplified-fragment Length Polymorphism Analysis:the state of an Art[J].J Clin Micorbiol，1999，37(10):3083～3091.
[7]JANET M.PRUCKLER，LEONARD A.MERMEL，et al.Comparison of Le-gionella pueumophila Isolates by Arbitrarily Primed PCR and Pulsed-Field Gel Electrophoresis:Analysis from Seven Epidemic Investigatons[J].Jounal of Clinical Microbiology，1995，33(11):2872～2875.
[8]O.PEROLA，J.KAUPPINEN，et al.Nosocomial Legionella pneumophila ser-group5outbreak associated with persistent colonization of a hospital water system[J].APMIS，2002，110:863～868.
[9] CALUDIO VALSANGIACOMO，FRANCA BAGGI，et al.Use of Amplified Fragment Length Polymorphism in Molecular Typing of Legionella pneu-mophila and Application to Epidemiological Studies[J].Journal of Clinical Microbiology，1995，33(7):1716～1719.
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