三种诱导骨再生膜的构建及其诱导成骨能力的比较
摘要:目的 制备PLGA-bBMP，PLGA-bBMP-IGF-Ⅱ，PLGA-bBMP-IGF-Ⅱ-bFGF三种诱导骨再生膜并比较其修复兔桡骨骨缺损的效果，探讨其作用机制。 方法 将IGF-Ⅱ，bFGF和bBMP，分别与PLGA复合成具有生物活性的三种诱导骨再生膜，用其修复兔桡骨骨缺损，以单纯PLGA膜作为对照组，分别在2、4、8周进行大体、组织形态学、四环素示踪和组织形态计量学观察骨缺损的修复情况，并作统计学分析;免疫组织化学检测三种生长因子存在时间。 结果 提取的小牛骨bBMP能诱导成骨，三种诱导骨再生膜均能在体内诱导新骨的形成，明显优于PLGA(对照组)，其诱导效果呈现PLGA/bBMP(B组)
关键词: 诱导骨再生膜;聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物;生长因子;桡骨骨缺损;诱导成骨
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Construction of Three Kinds of Membrane Guided Bone Regeneration and Comparison of Their Osteogenesis Capability in Vivo
JING Wen-xue，CAO Xian-lin，XU Dong-ming，HU Mao-zhong，YOU Jia，SUN Hong-fan
(Department of Orthopaedics，the First Central Hospital of Tianjin，Tianjin300192，China;Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC，Tianjin300192，China)
Abstract:Objective To construct three kinds of artificial periosteum with PLGA/bBMP(bovine bone morpho-genetic protein)，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ(Isulin-like Growth Factor-Ⅱ)，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bBFGF(fibroblast growth factor-2)and compare their effects of inductive ostegogenesis in repairing the rabbit′s radius defect，so as to study the mechanism.Methods The Artificial Periosteums were constructed by attaching bBMP、IGF-Ⅱand b FGF on the PLGA membrane and were implanted into the defects of radius in18rabbits models，gross，histological and im-munohistochemical examination was studied and tetracycline labelling，metrical histological analysis were studied at2，4，8，weeks.Results The bBMP could induce bone regeneration in muscle and three kinds of artificial periosteum was superior to the control group(A组)，The osteogenic ability of three kinds of artificial periosteum was superior to the control group(A组)，The osteogenic ability of three kinds of Artificial Periosteum was PLGA/bBMP(B)
Key words:artificial periosteum;polylacticl-glycolic acid copolymer;growth factor;radius defect;induced os-teogenesis
膜引导骨再生(membrane guided bone regeneration，MGBR)是利用生物相容性良好的膜材料植入骨缺损周围，隔绝和保护骨缺损，并引导和调动组织自身的愈合能力，通过骨组织再生来修复缺损[1～3] 。实验证明，聚乳酸-聚羟基乙酸(polylacticl-glycolic acid copolymer，PLGA)膜具有良好的骨引导作用，但其本身无骨诱导作用。近年来，很多学者倡导将MGBR技术与骨生长因子联合应用，以促进骨再生，获得了比单纯使用MGBR技术更好的效果[4] 。本实验将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factar，bFGF)、胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factors-Ⅱ，IGF-Ⅱ)和牛骨形态发生蛋白(bovine bone morphogenetic pro-tein，bBMP)与PLGA膜复合，制备三种诱导骨再生膜，通过其修复兔桡骨缺损的实验，观察MGBR作用、降解特性、生长因子的缓释作用及诱导成骨作用，旨在研制具有骨引导和骨诱导双重成骨作用的可降解性诱导骨再生膜。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明小鼠10只(北京动物所)，鼠龄1.5个月，体重25～28g。日本大耳白兔27只(天津实验动物中心)，兔龄5个月，体重2.0～3.0kg。
1.2 bBMP提取及肌袋诱导成骨试验 参照Urist方法[5] 提取新鲜小牛长骨的bBMP，将提取bBMP冻干粉埋植于12只小鼠左下肢肌肉内，5mg/只;右下肢为对照侧，模拟手术注射生理盐水。于植入术后1、2、3周切取局部组织，HE染色观察。
1.3 三种诱导骨再生膜的制备 将90mg/mL的PLGA三氯甲烷溶液，在载玻片上流沿成膜，室温挥发15min，得到PLGA膜;用一定方法分别依次将5mg的bBMP，40活性单位IGF-Ⅱ和5μg bFGF吸附在PLGA膜上，室温挥发24h至干燥，得到PLGA/bBMP，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ，PLGA/BMP+IGF-Ⅱ+bFGF三种膜，塑料袋封装，环氧乙烷消毒备用。扫描电镜观察膜表面微观结构。
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1.4 建立动物模型和实验分组 27只日本大耳白兔，随机分3组，每组9只，按文献方法[6] 建立双前肢桡骨10mm节段性骨缺损模型，植入三种诱导骨再生膜(见图1)，一侧为实验组，另一侧为对照组。单纯PLGA膜作为对照组(A组)，实验组分为B组:PLGA/bBMP;C组:PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ;D组:PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF。分别于2、4及8周处死，通过大体观察、Giemsa组织学染色、四环素荧光标记[7] 及组织计量学分析[8] ，结果采用方差分析。
图1 诱导骨再生膜管安放位置(略)
1.5 外源性生长因子的免疫组化检测 免疫组化采用SP法，DAB方法显色，苏木精复染，中性树胶封固。PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。兔抗人IGF-Ⅱ抗体(Sigma)工作浓度为1∶125，兔抗牛BMP(Sigma)工作浓度为1∶300，兔抗人bFGF(Sigma)工作浓度为1∶500。2、4、8周时，分别对PL-GA组和PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组的组织切片经二 甲苯脱脂，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色，呈棕褐色颗粒为阳性。
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2 结果
2.1 PLGA/bBMP膜的表面微结构观察 扫描电镜观察结果显示，PLGA/bBMP膜未见孔隙，表面粘附了生长因子后，膜的一侧形成珊瑚状粗糙面(见图2)，另一侧呈光滑面。
图2 诱导骨再生膜扫描电镜(略)
2.2 bBMP的骨诱导活性 局部解剖观察:bBMP植入后1周时植入区出现小结节团块，质稍硬;2周时植入区内结节渐增大，淡黄色，质较硬，与周围肌肉组织界限不清;3周时结节处骨化，形成硬质骨，有白色骨皮质和少许红色似骨髓样物质，与股骨不连，新生骨体积大约0.5cm×0.4cm×0.3cm。对照侧均未发现新骨形成。
组织学观察:bBMP植入7d时植入区可见大量间充质细胞和成纤维细胞增生，并向其周肌间隙浸润性生长，肌纤维被分割成条索状，间充质细胞肥大，胞核增大，并开始向软骨细胞分化，软骨细胞从周围向中央逐渐成熟，部分区域可见孤立的软骨岛，可见未成熟的前软骨细胞;第14天植入区包块内出现陷窝样特征的软骨细胞和新生骨，细胞周围形成软骨基质，新生软骨为弹性软骨样特征，肌肉组织中新骨明显可见，钙化的骨样组织呈蓝色，见髓腔形成;第21天可见骨基质形成和不规则的骨髓腔出现，新骨增多，有骨小梁及骨髓形成。
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2.3 诱导骨再生膜的骨修复功能
2.3.1 PLGA诱导骨再生膜(A组) Giemsa染色:术后2周PLGA膜完整，膜管外结缔组织大量增生，对膜管形成严密包裹(见图3a);4周时缺损区内间充质细胞保持增殖活跃状态，形成条状软骨(见图3b);8周时膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂，但生长方向紊乱(见图3c)。荧光镜下:术后2周缺损区内骨小梁表面可见模糊的荧光线(见图4a);4周可见连续的双标记线(见图4b);8周缺损区内可见多条粗大的双标记荧光线，骨小梁增多(见图4c)。
图3 PLGA组的Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:术后2周PLGA膜完整，膜管外结缔组织大量增生;b:4周时缺损区内间充质细胞保持增殖活跃状态，形成条状软骨;c:8周时膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂，但生长方向紊乱。
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图4 PLGA组的四环素荧光观察(HE，×200)
a:术后2周，缺损区内骨小梁表面可见模糊的荧光线;b:术后4周可见连续的双标记线;c:8周缺损区内可见多条粗大的双标记荧光线，骨小梁增多。
2.3.2 PLGA/bBMP实验组观察(B组) Giemsa染色:术后2周PLGA/bBMP膜完整，膜管外结缔组织大量增生，可见来自骨端的间充质细胞长入，缺损区断端少许骨皮质坏死，缺损区有少量新骨形成(见图5a);4周缺损区内形成较多新骨，成骨细胞和成软骨细胞增殖较活跃(见图5b);8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂(见图5c)。荧光镜下:术后2周缺损区内可见稀疏的骨小梁，骨小梁表面可见双标记荧光线(见图6a);4周骨小梁增多，骨小梁表面荧光带增宽，骨的矿化和改建较活跃(见图6b);8周缺损区内骨小梁连接较密，骨小梁表面有宽的双标记荧光线，骨的矿化和改建较活跃(见图6c)。
, http://www.100md.com 图5 PLGA/bBMP组Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:术后2周PLGA/bBMP膜完整，膜管外结缔组织大量增生，缺损区有少量新骨形成;b:4周缺损区内形成较多新骨，成骨细胞和成软骨细胞增殖较活跃;c:8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂。
图6 PLGA/bBMP组四环素免疫荧光(HE，×200)(略)
a:术后2周缺损区内可见稀疏的骨小梁，骨小梁表面可见双标记荧光线;b:4周骨小梁增多，骨小梁表面荧光带增宽;c:8周缺损区内骨小梁连接较密，骨小梁表面有宽的双标记荧光线。
2.3.3 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ实验组观察(C组) Giemsa染色:术后2周PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ膜完整，膜管外结缔组织大量增生，对膜管形成严密包裹(见图7a);4周缺损区内新骨形成活跃，形成较多软骨，部分骨矿化和改建(见图7b);8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，骨小梁间连接呈网，排列有序，膜外形成少量骨痂(见图7c)。荧光镜下:术后2周缺损区内可见少量的骨小梁，骨小梁表面形成较窄的双标记线(见图8a);4周缺损区骨小梁增多，其表面可见连续的双标记荧光线，骨的矿化和改建较活跃(见图8b);8周缺损区内骨小梁增粗并互相连接，双标记荧光线间距增宽(见图8c)。
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图7 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ组Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:术后2周PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ膜完整，膜管外结缔组织大量增生;b:4周缺损区内新骨形成活跃，形成较多软骨;c:8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，骨小梁间连接呈网，排列有序，膜外形成少量骨痂。
图8 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ组四环素免疫荧光(HE，×200)(略)
a:术后2周缺损区内可见少量的骨小梁，骨小梁表面形成较窄的双标记线;b:4周缺损区骨小梁增多，其表面可见连续的双标记荧光线;c:8周缺损区内骨小梁增粗并互相连接，双标记荧光线间距增宽。
2.3.4 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF实验组观察(D组) Giemsa染色:术后2周PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF膜完整，膜管封闭完整，膜管内间充质细胞大量聚集，膜管内有少量新骨形成(见图9a);4周缺损区内间充质细胞仍然保持增殖活跃状态，形成条状软骨(见图9b);8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，骨小梁较致密，骨矿化和改建活跃，膜外 形成少量骨痂(见图9c)。
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荧光镜下:术后2周缺损区内骨小梁较多，骨小梁表面形成较窄的双标记线(见图10a);4周缺损区内可见连续的双标记线，骨的矿化和改建较活跃(见图10b);8周缺损区内骨小梁密集，双标记荧光线增宽(见图10c)。
图9 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF实验组Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:膜管封闭完整，膜管内间充质细胞大量聚集，有少量新骨形成;b:4周缺损区内间充质细胞仍然保持增殖活跃状态，形成条状软骨;c:8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂。
图10 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组四环素免疫荧光(HE，×200)(略)
a:术后2周缺损区内骨小梁较多，骨小梁表面形成较窄的双标记线;b:4周缺损区内可见连续的双标记线;c:8周缺损区内骨小梁密集，双标记荧光线增宽。
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2.4 组织形态计量学观察及统计学分析 术后各时间点组织形态计量学观察及统计学分析结果显示，三种诱导骨再生膜均能在体内诱导新骨的形成，明显优于对照组，其诱导成骨效果呈PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF>PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ>PLGA/bBMP(见表1)。
2.5 外源性生长因子的免疫组化 免疫组化结果显示，2、4、8周时，对照组PLGA膜管内bBMP、IGF-Ⅱ和bFGF均显示阴性;实验D组，2周时膜管内BMP显示阳性(见图11a)，IGF-Ⅱ和bFGF显示弱阳性(见图11b，c);4周和8周时bBMP显示弱阳性，而IGF-Ⅱ和bFGF均显示阴性。表明，bBMP在2～8周时间内均有持续的释放，而IGF-Ⅱ和bFGF在2周内有效释放。
图11 外源性生长因子的免疫组化结果(略)
a:术后2周，BMP显示阳性(HE，×200);b:术后2周，IGF-Ⅱ显示弱阳性(HE，×200);c:术后2周，b FGF显示弱阳性(HE，×100)。
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3 讨论
3.1 诱导骨再生膜中多种生长因子的协同诱导成骨作用
表1 不同时间实验D组与其他组之间骨组织形态计量学比较(略)
MGBR技术在骨缺损修复中为骨细胞生长创造良好的环境，但它缺乏诱导新骨形成功能[1] 。骨诱导和骨形成是一个多种生长因子参与并调节的过程。BMP和bFGF是近年来研究较深入的两种生长因子，BMP的高效诱导成活性已被许多实验和临床研究证实[2] ，而bFGF能促进BMP诱导成骨和毛细血管生长。IGF-Ⅱ是对成骨细胞增殖和骨基质形成起重要调节作用的生长因子。研究表明，IGF-Ⅱ具有促进人和兔骨细胞有丝分裂和骨基质中胶原的合成。研究表明，骨折愈合和骨缺损修复期，BMP、bFGF和IGF-Ⅱ等生长因子可以通过自分泌或从骨基质中释放出来共同调节成骨细胞的活性[3] 。另外，bFGF和IGF-Ⅱ及IGF-Ⅱ与BMP之间在促进细胞分裂方面有协同作用[4] 。
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因此，本实验将bBMP、bFGF和IGF-Ⅱ等多种生长因子吸附在PLGA膜上，旨在制备具有骨诱导和骨引导双重成骨作用的新型诱导骨再生膜。实验结果表明，复合bBMP、bFGF和IGF-Ⅱ的PLGA膜的骨缺损修复效果明显优于单纯PLGA膜和其他一种或两种生长因子复合膜，说明bBMP、bFGF和IGF-Ⅱ对PLGA膜的MGBR过程中具有协同诱导成骨作用。
研究表明，膜管内保持多种生长因子的高含量是MGBR成功的关键，而多种生长因子在MGBR过程中的协同作用机制尚不明确。BMP能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化成软骨细胞和骨细胞，但它仅是骨生成的启动因子，对已分化的成骨细胞、骨细胞及软骨细胞无进一步促进其增殖作用，甚至有抑制作用。而bFGF可促进成熟骨和软骨细胞增殖及成熟[5] ，刺激其他内源性生长因子的分泌，同时，bFGF又是一种强大的血管生长因子，能够刺激新生血管长入软骨内而加速骨化过程[6] 。因此，这两种生长因子联合应用后，bFGF刺激BMP诱导的骨和软骨细胞增殖分化，从而使这两种生长因子在生物学功能上形成互补，进而加速骨诱导和骨形成过程[9] ，生物效应更全面，而不只限于增加其作用的强度。IGF是骨基质中的生长因子之一，分为IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，人骨基质中IGF-Ⅱ含量是IGF-Ⅰ的10～15倍。研究表明，IGF在体外促进破骨细胞的形成，刺激成骨细胞的功能活性，调节骨吸收，参与骨改建。本实验结果表明，PL-GA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组的大部分骨计量学指标均显著高于其他各组，尤其2周时明显。说明这三种生长因子在PLGA膜引导骨再生过程中的各时期起到良好的协同生物效应。本研究结果预示着具有协同作用的多种生长因子的联合应用，将可能是研究开发MGBR膜的重要途径。
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3.2 PLGA膜对多种生长因子的缓释效应 良好的MGBR膜除了具有机械屏障和骨传导作用以外，还应是良好的生长因子载体，并能缓慢释放外援性生长因子促进新骨生长。PL-GA具有可控制的降解性能和物理、力学性能以及可靠的生物安全性，同时它又是良好的生长因子缓释载体[7] 。本实验采用物理方法制备PLGA膜，并根据需要表面吸附多种生长因子，电镜下观察到膜表面呈珊瑚状粗糙面，有利于骨细胞整合及稳定血凝块[8] ，而表面吸附的生长因子在骨形成早期能够及时释放。膜的另一侧呈光滑面，朝向软组织阻挡结缔组织长入。这种膜结构可使多种生长因子只向膜管内的骨缺损区一侧释放，既提高膜管内生长因子的浓度，又减少了外 源性生长因子的用量。
免疫组化结果表明，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组在2、4、8周时bBMP均显示阳性，而IGF-Ⅱ和bFGF在2周时显示弱阳性，但4周和8周时显示阴性，说明本实验制备的骨诱导再生膜在2周内对多种生长因子有良好的释放效应。8周时仍有bBMP表达，这可能与膜表面吸附其剂量较多有关，说明生长因子的缓释时间与其吸附量呈正相关。
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参考文献:
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天津市卫生局科技基金(局99KY050)
(天津市第一中心医院骨科，天津 300192;中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192), http://www.100md.com(姜文学，曹现林，徐东明，胡茂忠，尤佳，孙洪范)
关键词: 诱导骨再生膜;聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物;生长因子;桡骨骨缺损;诱导成骨
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Construction of Three Kinds of Membrane Guided Bone Regeneration and Comparison of Their Osteogenesis Capability in Vivo
JING Wen-xue，CAO Xian-lin，XU Dong-ming，HU Mao-zhong，YOU Jia，SUN Hong-fan
(Department of Orthopaedics，the First Central Hospital of Tianjin，Tianjin300192，China;Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC，Tianjin300192，China)
Abstract:Objective To construct three kinds of artificial periosteum with PLGA/bBMP(bovine bone morpho-genetic protein)，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ(Isulin-like Growth Factor-Ⅱ)，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bBFGF(fibroblast growth factor-2)and compare their effects of inductive ostegogenesis in repairing the rabbit′s radius defect，so as to study the mechanism.Methods The Artificial Periosteums were constructed by attaching bBMP、IGF-Ⅱand b FGF on the PLGA membrane and were implanted into the defects of radius in18rabbits models，gross，histological and im-munohistochemical examination was studied and tetracycline labelling，metrical histological analysis were studied at2，4，8，weeks.Results The bBMP could induce bone regeneration in muscle and three kinds of artificial periosteum was superior to the control group(A组)，The osteogenic ability of three kinds of artificial periosteum was superior to the control group(A组)，The osteogenic ability of three kinds of Artificial Periosteum was PLGA/bBMP(B)
Key words:artificial periosteum;polylacticl-glycolic acid copolymer;growth factor;radius defect;induced os-teogenesis
膜引导骨再生(membrane guided bone regeneration，MGBR)是利用生物相容性良好的膜材料植入骨缺损周围，隔绝和保护骨缺损，并引导和调动组织自身的愈合能力，通过骨组织再生来修复缺损[1～3] 。实验证明，聚乳酸-聚羟基乙酸(polylacticl-glycolic acid copolymer，PLGA)膜具有良好的骨引导作用，但其本身无骨诱导作用。近年来，很多学者倡导将MGBR技术与骨生长因子联合应用，以促进骨再生，获得了比单纯使用MGBR技术更好的效果[4] 。本实验将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factar，bFGF)、胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factors-Ⅱ，IGF-Ⅱ)和牛骨形态发生蛋白(bovine bone morphogenetic pro-tein，bBMP)与PLGA膜复合，制备三种诱导骨再生膜，通过其修复兔桡骨缺损的实验，观察MGBR作用、降解特性、生长因子的缓释作用及诱导成骨作用，旨在研制具有骨引导和骨诱导双重成骨作用的可降解性诱导骨再生膜。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明小鼠10只(北京动物所)，鼠龄1.5个月，体重25～28g。日本大耳白兔27只(天津实验动物中心)，兔龄5个月，体重2.0～3.0kg。
1.2 bBMP提取及肌袋诱导成骨试验 参照Urist方法[5] 提取新鲜小牛长骨的bBMP，将提取bBMP冻干粉埋植于12只小鼠左下肢肌肉内，5mg/只;右下肢为对照侧，模拟手术注射生理盐水。于植入术后1、2、3周切取局部组织，HE染色观察。
1.3 三种诱导骨再生膜的制备 将90mg/mL的PLGA三氯甲烷溶液，在载玻片上流沿成膜，室温挥发15min，得到PLGA膜;用一定方法分别依次将5mg的bBMP，40活性单位IGF-Ⅱ和5μg bFGF吸附在PLGA膜上，室温挥发24h至干燥，得到PLGA/bBMP，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ，PLGA/BMP+IGF-Ⅱ+bFGF三种膜，塑料袋封装，环氧乙烷消毒备用。扫描电镜观察膜表面微观结构。
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1.4 建立动物模型和实验分组 27只日本大耳白兔，随机分3组，每组9只，按文献方法[6] 建立双前肢桡骨10mm节段性骨缺损模型，植入三种诱导骨再生膜(见图1)，一侧为实验组，另一侧为对照组。单纯PLGA膜作为对照组(A组)，实验组分为B组:PLGA/bBMP;C组:PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ;D组:PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF。分别于2、4及8周处死，通过大体观察、Giemsa组织学染色、四环素荧光标记[7] 及组织计量学分析[8] ，结果采用方差分析。
图1 诱导骨再生膜管安放位置(略)
1.5 外源性生长因子的免疫组化检测 免疫组化采用SP法，DAB方法显色，苏木精复染，中性树胶封固。PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。兔抗人IGF-Ⅱ抗体(Sigma)工作浓度为1∶125，兔抗牛BMP(Sigma)工作浓度为1∶300，兔抗人bFGF(Sigma)工作浓度为1∶500。2、4、8周时，分别对PL-GA组和PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组的组织切片经二 甲苯脱脂，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色，呈棕褐色颗粒为阳性。
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2 结果
2.1 PLGA/bBMP膜的表面微结构观察 扫描电镜观察结果显示，PLGA/bBMP膜未见孔隙，表面粘附了生长因子后，膜的一侧形成珊瑚状粗糙面(见图2)，另一侧呈光滑面。
图2 诱导骨再生膜扫描电镜(略)
2.2 bBMP的骨诱导活性 局部解剖观察:bBMP植入后1周时植入区出现小结节团块，质稍硬;2周时植入区内结节渐增大，淡黄色，质较硬，与周围肌肉组织界限不清;3周时结节处骨化，形成硬质骨，有白色骨皮质和少许红色似骨髓样物质，与股骨不连，新生骨体积大约0.5cm×0.4cm×0.3cm。对照侧均未发现新骨形成。
组织学观察:bBMP植入7d时植入区可见大量间充质细胞和成纤维细胞增生，并向其周肌间隙浸润性生长，肌纤维被分割成条索状，间充质细胞肥大，胞核增大，并开始向软骨细胞分化，软骨细胞从周围向中央逐渐成熟，部分区域可见孤立的软骨岛，可见未成熟的前软骨细胞;第14天植入区包块内出现陷窝样特征的软骨细胞和新生骨，细胞周围形成软骨基质，新生软骨为弹性软骨样特征，肌肉组织中新骨明显可见，钙化的骨样组织呈蓝色，见髓腔形成;第21天可见骨基质形成和不规则的骨髓腔出现，新骨增多，有骨小梁及骨髓形成。
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2.3 诱导骨再生膜的骨修复功能
2.3.1 PLGA诱导骨再生膜(A组) Giemsa染色:术后2周PLGA膜完整，膜管外结缔组织大量增生，对膜管形成严密包裹(见图3a);4周时缺损区内间充质细胞保持增殖活跃状态，形成条状软骨(见图3b);8周时膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂，但生长方向紊乱(见图3c)。荧光镜下:术后2周缺损区内骨小梁表面可见模糊的荧光线(见图4a);4周可见连续的双标记线(见图4b);8周缺损区内可见多条粗大的双标记荧光线，骨小梁增多(见图4c)。
图3 PLGA组的Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:术后2周PLGA膜完整，膜管外结缔组织大量增生;b:4周时缺损区内间充质细胞保持增殖活跃状态，形成条状软骨;c:8周时膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂，但生长方向紊乱。
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图4 PLGA组的四环素荧光观察(HE，×200)
a:术后2周，缺损区内骨小梁表面可见模糊的荧光线;b:术后4周可见连续的双标记线;c:8周缺损区内可见多条粗大的双标记荧光线，骨小梁增多。
2.3.2 PLGA/bBMP实验组观察(B组) Giemsa染色:术后2周PLGA/bBMP膜完整，膜管外结缔组织大量增生，可见来自骨端的间充质细胞长入，缺损区断端少许骨皮质坏死，缺损区有少量新骨形成(见图5a);4周缺损区内形成较多新骨，成骨细胞和成软骨细胞增殖较活跃(见图5b);8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂(见图5c)。荧光镜下:术后2周缺损区内可见稀疏的骨小梁，骨小梁表面可见双标记荧光线(见图6a);4周骨小梁增多，骨小梁表面荧光带增宽，骨的矿化和改建较活跃(见图6b);8周缺损区内骨小梁连接较密，骨小梁表面有宽的双标记荧光线，骨的矿化和改建较活跃(见图6c)。
, http://www.100md.com 图5 PLGA/bBMP组Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:术后2周PLGA/bBMP膜完整，膜管外结缔组织大量增生，缺损区有少量新骨形成;b:4周缺损区内形成较多新骨，成骨细胞和成软骨细胞增殖较活跃;c:8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂。
图6 PLGA/bBMP组四环素免疫荧光(HE，×200)(略)
a:术后2周缺损区内可见稀疏的骨小梁，骨小梁表面可见双标记荧光线;b:4周骨小梁增多，骨小梁表面荧光带增宽;c:8周缺损区内骨小梁连接较密，骨小梁表面有宽的双标记荧光线。
2.3.3 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ实验组观察(C组) Giemsa染色:术后2周PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ膜完整，膜管外结缔组织大量增生，对膜管形成严密包裹(见图7a);4周缺损区内新骨形成活跃，形成较多软骨，部分骨矿化和改建(见图7b);8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，骨小梁间连接呈网，排列有序，膜外形成少量骨痂(见图7c)。荧光镜下:术后2周缺损区内可见少量的骨小梁，骨小梁表面形成较窄的双标记线(见图8a);4周缺损区骨小梁增多，其表面可见连续的双标记荧光线，骨的矿化和改建较活跃(见图8b);8周缺损区内骨小梁增粗并互相连接，双标记荧光线间距增宽(见图8c)。
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图7 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ组Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:术后2周PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ膜完整，膜管外结缔组织大量增生;b:4周缺损区内新骨形成活跃，形成较多软骨;c:8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，骨小梁间连接呈网，排列有序，膜外形成少量骨痂。
图8 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ组四环素免疫荧光(HE，×200)(略)
a:术后2周缺损区内可见少量的骨小梁，骨小梁表面形成较窄的双标记线;b:4周缺损区骨小梁增多，其表面可见连续的双标记荧光线;c:8周缺损区内骨小梁增粗并互相连接，双标记荧光线间距增宽。
2.3.4 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF实验组观察(D组) Giemsa染色:术后2周PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF膜完整，膜管封闭完整，膜管内间充质细胞大量聚集，膜管内有少量新骨形成(见图9a);4周缺损区内间充质细胞仍然保持增殖活跃状态，形成条状软骨(见图9b);8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，骨小梁较致密，骨矿化和改建活跃，膜外 形成少量骨痂(见图9c)。
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荧光镜下:术后2周缺损区内骨小梁较多，骨小梁表面形成较窄的双标记线(见图10a);4周缺损区内可见连续的双标记线，骨的矿化和改建较活跃(见图10b);8周缺损区内骨小梁密集，双标记荧光线增宽(见图10c)。
图9 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF实验组Giemsa染色(HE，×200)(略)
a:膜管封闭完整，膜管内间充质细胞大量聚集，有少量新骨形成;b:4周缺损区内间充质细胞仍然保持增殖活跃状态，形成条状软骨;c:8周膜管内骨缺损已被新生骨所连接，膜外形成少量骨痂。
图10 PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组四环素免疫荧光(HE，×200)(略)
a:术后2周缺损区内骨小梁较多，骨小梁表面形成较窄的双标记线;b:4周缺损区内可见连续的双标记线;c:8周缺损区内骨小梁密集，双标记荧光线增宽。
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2.4 组织形态计量学观察及统计学分析 术后各时间点组织形态计量学观察及统计学分析结果显示，三种诱导骨再生膜均能在体内诱导新骨的形成，明显优于对照组，其诱导成骨效果呈PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF>PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ>PLGA/bBMP(见表1)。
2.5 外源性生长因子的免疫组化 免疫组化结果显示，2、4、8周时，对照组PLGA膜管内bBMP、IGF-Ⅱ和bFGF均显示阴性;实验D组，2周时膜管内BMP显示阳性(见图11a)，IGF-Ⅱ和bFGF显示弱阳性(见图11b，c);4周和8周时bBMP显示弱阳性，而IGF-Ⅱ和bFGF均显示阴性。表明，bBMP在2～8周时间内均有持续的释放，而IGF-Ⅱ和bFGF在2周内有效释放。
图11 外源性生长因子的免疫组化结果(略)
a:术后2周，BMP显示阳性(HE，×200);b:术后2周，IGF-Ⅱ显示弱阳性(HE，×200);c:术后2周，b FGF显示弱阳性(HE，×100)。
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3 讨论
3.1 诱导骨再生膜中多种生长因子的协同诱导成骨作用
表1 不同时间实验D组与其他组之间骨组织形态计量学比较(略)
MGBR技术在骨缺损修复中为骨细胞生长创造良好的环境，但它缺乏诱导新骨形成功能[1] 。骨诱导和骨形成是一个多种生长因子参与并调节的过程。BMP和bFGF是近年来研究较深入的两种生长因子，BMP的高效诱导成活性已被许多实验和临床研究证实[2] ，而bFGF能促进BMP诱导成骨和毛细血管生长。IGF-Ⅱ是对成骨细胞增殖和骨基质形成起重要调节作用的生长因子。研究表明，IGF-Ⅱ具有促进人和兔骨细胞有丝分裂和骨基质中胶原的合成。研究表明，骨折愈合和骨缺损修复期，BMP、bFGF和IGF-Ⅱ等生长因子可以通过自分泌或从骨基质中释放出来共同调节成骨细胞的活性[3] 。另外，bFGF和IGF-Ⅱ及IGF-Ⅱ与BMP之间在促进细胞分裂方面有协同作用[4] 。
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因此，本实验将bBMP、bFGF和IGF-Ⅱ等多种生长因子吸附在PLGA膜上，旨在制备具有骨诱导和骨引导双重成骨作用的新型诱导骨再生膜。实验结果表明，复合bBMP、bFGF和IGF-Ⅱ的PLGA膜的骨缺损修复效果明显优于单纯PLGA膜和其他一种或两种生长因子复合膜，说明bBMP、bFGF和IGF-Ⅱ对PLGA膜的MGBR过程中具有协同诱导成骨作用。
研究表明，膜管内保持多种生长因子的高含量是MGBR成功的关键，而多种生长因子在MGBR过程中的协同作用机制尚不明确。BMP能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化成软骨细胞和骨细胞，但它仅是骨生成的启动因子，对已分化的成骨细胞、骨细胞及软骨细胞无进一步促进其增殖作用，甚至有抑制作用。而bFGF可促进成熟骨和软骨细胞增殖及成熟[5] ，刺激其他内源性生长因子的分泌，同时，bFGF又是一种强大的血管生长因子，能够刺激新生血管长入软骨内而加速骨化过程[6] 。因此，这两种生长因子联合应用后，bFGF刺激BMP诱导的骨和软骨细胞增殖分化，从而使这两种生长因子在生物学功能上形成互补，进而加速骨诱导和骨形成过程[9] ，生物效应更全面，而不只限于增加其作用的强度。IGF是骨基质中的生长因子之一，分为IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，人骨基质中IGF-Ⅱ含量是IGF-Ⅰ的10～15倍。研究表明，IGF在体外促进破骨细胞的形成，刺激成骨细胞的功能活性，调节骨吸收，参与骨改建。本实验结果表明，PL-GA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组的大部分骨计量学指标均显著高于其他各组，尤其2周时明显。说明这三种生长因子在PLGA膜引导骨再生过程中的各时期起到良好的协同生物效应。本研究结果预示着具有协同作用的多种生长因子的联合应用，将可能是研究开发MGBR膜的重要途径。
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3.2 PLGA膜对多种生长因子的缓释效应 良好的MGBR膜除了具有机械屏障和骨传导作用以外，还应是良好的生长因子载体，并能缓慢释放外援性生长因子促进新骨生长。PL-GA具有可控制的降解性能和物理、力学性能以及可靠的生物安全性，同时它又是良好的生长因子缓释载体[7] 。本实验采用物理方法制备PLGA膜，并根据需要表面吸附多种生长因子，电镜下观察到膜表面呈珊瑚状粗糙面，有利于骨细胞整合及稳定血凝块[8] ，而表面吸附的生长因子在骨形成早期能够及时释放。膜的另一侧呈光滑面，朝向软组织阻挡结缔组织长入。这种膜结构可使多种生长因子只向膜管内的骨缺损区一侧释放，既提高膜管内生长因子的浓度，又减少了外 源性生长因子的用量。
免疫组化结果表明，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF组在2、4、8周时bBMP均显示阳性，而IGF-Ⅱ和bFGF在2周时显示弱阳性，但4周和8周时显示阴性，说明本实验制备的骨诱导再生膜在2周内对多种生长因子有良好的释放效应。8周时仍有bBMP表达，这可能与膜表面吸附其剂量较多有关，说明生长因子的缓释时间与其吸附量呈正相关。
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天津市卫生局科技基金(局99KY050)
(天津市第一中心医院骨科，天津 300192;中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192), http://www.100md.com(姜文学，曹现林，徐东明，胡茂忠，尤佳，孙洪范)