麻痹性贝类毒素研究进展
Advance in the research of paralytic shellfish poisons.LIU Zhi-yong，JI Rong.(China National Center for Disease Control and Prevention，Beijing100021，P.R.China)
麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish poison PSP)中毒已经作为重要的公共卫生问题得到了全世界的关注。人类通常摄入因食用滤食浮游生物(含有毒微藻类)后产生PSP的贝类水产品(如蚌类，牡蛎和蛤等)而引起麻痹性贝类中毒，中毒症状以神经系统症状为主甚至引起死亡。本文对PSP研究进展综述如下。
1 背景
在所有的贝类产品食物中毒事件中，麻痹性贝类中毒被公认为是对健康危害最严重的之一。资料报道l972～1982年日本中毒患者达1192人，1981年西班牙有5000人中毒，1983年菲律宾300人中毒，并有21人死亡，截至目前，全球沿海地区都有麻痹性贝类中毒致死事件的报道。PSP是一类神经肌肉麻痹剂，对人体的作用机理主要是阻断细胞钠离子通道，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。贝类摄入此毒素对本身无害，因毒素在贝类体内呈结合状态。当人食入后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用，潜伏期仅数分钟或数小时，症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，严重的会导致呼吸停止。PSP毒性强，其毒性是眼镜蛇毒性的80倍，其毒力与神经毒气沙林相同，在国际条约中已被列为化学武器。目前还没有针对麻痹性贝类中毒的特效解毒剂，因此人类摄入超过一定限量的PSP时，其病死率达100%。
2 PSP的主要来源
人类食用蛤和贻贝所引起的中毒国内外历史文献中早已有所记载，但其确切发病原因一直不为人们所知，直到1927年美国加州大学的研究员观察到一种特殊的双鞭甲藻在贻贝壳上开花，很多人在食用了这种贻贝后就发生麻痹并且甚至死亡，因此研究人员推测这种双鞭甲藻是有毒的，并且发现在双鞭甲藻(A.catenella，或Gonyaulax catenella)中提取出的酸性水，其与有毒贻贝都能够导致小鼠以同一种方式死亡。当研究人员把无毒贻贝放在含有双鞭甲藻培养基的广口瓶中数日，贻贝迅速变为有毒，当把它们转移到有无毒生物体的广口瓶中时，有毒贻贝在一周到两周内排泄或消灭毒素，从而最后确定了双鞭甲藻与有毒贻贝的关系 [1，2] 。1966年，美国科学家Schantz最先提出了证据证明贻贝(Mytilus californianus)和白塔蛤S.giganteus)中石房蛤毒素与亲代麻痹性贝类毒素分子的同一性 [3] 。 海洋微藻类是用显微镜可观察到的单细胞生物，在海洋食物链中处于最底层。在有利的环境条件下，一些藻类能够迅速的增殖产生密集的细胞浓度，即水华(bloom)。通过对2000种现存种类的双鞭甲藻的评估，只有30种会产生PSP。当有毒微藻类产生水花时即为“有害海藻”(HAB)。大量的水华会使水产生微黄色或微红色的变色，因此被称为赤潮。
PSP的来源并不限于游动的海藻形式，海藻经常以胞囊的形式存在于海底沉积物的上层。生活在海底部的贝类如海洋扇贝就可能以深海底的孢子为食物，他们的毒性有可能比有游动的细胞还强。早期的PSP研究曾推测深海底的孢子群在特定时期发芽是HAB的季节性的原因，但是只在70年代末，休眠中的孢子最终确认为有毒双鞭甲藻。
PSP主要来源包括三种形态学上截然不同的海产双鞭甲藻属。
Alexandrium spp.，Pyrodinium spp.，Gymnodinium spp.
四种淡水蓝绿藻:Aphanizomenon flos-aquae，Anabaena circinalis，Lyngbya wollei和Cylindrospermopsis raciborskii。
虽然双鞭甲藻是PSP的直接来源是无疑的，但它们可能不是海洋环境中PSP的唯一或最终的来源。有越来越多的证据证明PSP是由微生物引起的毒素，并且细菌藻在HAB生态学中有相互作用。Silva(1962)认为双鞭甲藻中的石房蛤毒素由内共生的细菌产生的;1996年，Kodama从双鞭甲藻(A.tamarense)中分离出产生PSP的细菌。另外，已经分离出的海洋细菌包括弧菌属Vibrio，对极鞭毛属，Alteromonas毗邻单胞菌属Plesiomonas和假单胞菌属Pseudomonas几种，它们能产生PSP。1996年，Gallacher概括证明细菌产生毒素阻碍钠离子通道，并且还发现在双鞭甲藻培养基中离析出能产生PSP的细菌。然而，细菌和双鞭甲藻与PSP产生的准确关系仍在讨论中。
麻痹性贝类中毒通常是由于食用含有PSP的双壳贝类水产品引起，这些贝类通过滤食摄入大量浮游生物中的有毒双鞭甲藻。下面几种双壳类软体动物与PSP有关[4] 。
贻贝类:Mytilus，Modiolus;蛤类:Saxidomus，Protothaca，Spisula，Mya，Arctica，Humilaria，Mercenaria，Mesodesma，Tresus and Ensis;牡蛎:Crassostrea，Ostrea;扇贝类:Placopecten，Pecen，Spondylus and Hinnites;海扇类:Cardium，Clinocardium。
尽管双壳贝软体动物是最重要的PSP的携带者，可食用的食肉类和以腐肉为食的腹足纲动物，甲壳类及鱼都可能成为携带者(见表1)。 表1 常见携带PSP的可食用食肉或腐肉纲动物、甲壳类和鱼类名称(略)
食肉类:1998年，Chen and Chou在含有毒双鞭甲藻A.minutum的培养基中饲养滤食紫贻贝，在几天后紫贻贝变得有毒而且用来喂养食肉的腹足动物—象牙贝(这种贝在台湾是非常受欢迎的)。经检测在象贝类的内脏中发现了膝钩藻毒素A.minutumGTX1-4，但象牙贝中的GTX1有显著的退化，GTX2和GTX4都有所增加。双鞭甲藻中的PSP通过滤食活动转移到紫贻贝体内，然后通过双壳贝传播到食肉象牙贝内。
鱼及其它类:1998年，Amott在维多利亚、澳大利亚海岸的石龙虾内脏及鲍鱼体内检出，提出龙虾及鲍鱼可能通过食物链摄取毒素。赤潮期，鱼类可能暴露于溶有PSP的水中，或直接通过食用含有PSP的有毒双鞭甲藻、食草浮游动物、食肉贝类或小鱼而带毒。在印尼，曾发生由于食用鲱鱼引起麻痹性贝类中毒事件，但未鉴定出双鞭甲藻，这些鱼也没有以双鞭甲藻为食，而是以浮游动物为食，因此浮游动物有可能将来源于双鞭甲藻的毒素转移到鱼类中。
3 PSP的理化性质
PSP是一种极易溶于水的白色吸水固体，部分溶于甲醇和酒精，不溶于大多数非极性溶剂如乙醛、石油醚。它是一种生物碱，容易从酸性溶液中萃取。在紫外线范围内不被吸收，pKa值在8.2到11.5间，旋光度大概是+130。分子式是C 10 H 17 N 7 O 4 ，分子量是(MW)是299。在氢氯化盐中分子量是372。
PSP的基本结构是有两个胍盐基的四水化嘌呤。目前发现的大约20种化合物属于STX一族。两个亲代化合物是STX，N-羟基衍生出neoSTX。大多数衍生物是这两个分子特定位置硫酸盐化的结果。
世界各国对PSP分类虽各不相同，但目前已分离出20多种毒素，依基因的相似性可将这些毒素分为4类:①氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(STX)，新石房蛤毒素(neoSTX)，膝沟藻毒素1-4(GTX1-4);②N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括GTX5(B1)，GTX6(B2)，C1-4;③脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，包括dcSTX，dcneoSTX，dcGTX1-4;④N-羟基类毒素(N-hydroxycarbamoyl toxins)，包括hySTX和hyneoSTX;其中氨基甲酸酯类毒素中的STX，neoSTX，GTX1-4最常见，其中STX的占PSP的85%以上，人类目前研究STX也最为广泛，一般研究PSP主要是STX为主要研究对象 [5] 。
PSP通常分为氨基甲酰或氨基甲酸盐毒素(STX，neoSTX，GTX1-4)，它们的N-磺酰氨甲酰基类毒素衍生物(GTX5，GTX6，and C1-4)和脱氨甲酰基类毒素 [6，7] 。STX的两个胍基每个带有一个正电荷(图1)。STX和neoSTX具有近似相同的电荷和毒性。R2/R3(GTX1-4)的11-硫酸氢盐基和每个R4(B1，B2，C1-4)的21-磺基能还原一个单位的净电荷。净电荷对层析法和PSP的毒物学都有重要的影响。
PSP的稳定性如下:STX>neoSTX>GTX2，3>GTX1，4。稳定性的差异和互变现象的存在引起毒素分析的差异。neoSTX多样性的减小导致了STX的形成，有证据表明生物体系有类似的转换发生 [8] 。PSP的主要结构见图1。
4 PSP的检测方法
PSP是碱性的水溶性化合物，在碱性环境和空气氧化下不稳定，又由于PSP存在大量的变异，因此合成物中PSP的分析也很复杂，并且随着检出痕量要求的提高，PSP的分析技术也必须不断发展出精确、可靠的针对性分析方法。当前全球PSP的分析方法繁多，日、美两国学者为控制中毒的发生对PSP的检测方法进行了大量的研究。尤其在日本，建立了多种检测方法。这些方法按其性质可归结为生物、理化和免疫化学三个方面。
4.1 生物测定法
4.1.1 小鼠生物测定法(MBA)
MBA作为PSP的半定性分析方法，被美国公职分析化学家协会(AOAC)推广为PSP的标准检测方法，同时也是唯一国际大多数国家普遍接受的统一方法。AOAC定义一个鼠单位(MU相当于0.18μg)为给予20g小白鼠注射1ml贝类提取物使其在15min内致死的最小剂量。尽管该方法在概括样品毒性方面相当有效，但也有较多的限制，如该法不能确定样品中毒素结构;毒素分子与受体亲和的错误率高(±20%);该法是利用对小白鼠腹腔注射毒物测定其死亡时间以确定毒性大小，因此灵敏度低，其检出限约160ngSTX/m1或40μgSTXeq./100g贝肉;该法在标准程序中不同小鼠的品系、批次、损伤程度和大小对毒素的灵敏度有很大的波动性;浪费较多的毒素和需使用活体动物等等 [2，11] 。
4.1.2 其他生物测定法
4.1.2.1 家蝇生物分析法(House_fly biassay)
将一定量的酸性组织PSP提取液注入麻醉的家蝇体内、约10min后、家蝇的活动减弱直至死亡。其分析方法与MBA法相似。PSP的最低检测水平约为20μgSTX-eq./100g [12，13] 。
4.1.2.2 蝗虫生物分析法(Locust bioassy LBA)
近年来，Mcel- hiney等人用沙漠蝗虫(schistocerca gregaria)来检测PSP的毒性。其结果与MBA及HPLC等方法的检测结果基本相符。于蝗虫的第2和3体节之间.沿着腹部注射10μg测试样品液，记录注射后30、60和90min时被麻痹昆虫的百分数。计算出ED50值，从而检测出样品毒性。蝗虫生物分析法操作简单、方便、费用低廉，而效果与MBA法相似;家蝇生物分析法虽然比较灵敏，却难以操作，样品液须显微注射。故Mcelhiney等建议以LBA法用作一定样品范围的PSP常规检测方法 [15] 。
4.1.2.3 神经细胞生物分析法(Neurronal bioassay)
这种方法也称为组织培养分析法，以大鼠小脑神经细胞来检测有毒口中PSP的一种细胞毒性生物分析新方法。将分离的小脑神经细胞悬浮于一定的培养基中，该细胞一旦在培养基中分化，就能够表达对PSP敏感的电压依赖式钠离子通道。用一定浓度的藜芦定(veratridine)处理。分别往培养基中加入不同浓度的贝肝胰PSP提取物或不同稀释度的标准毒素。24h后，用二乙酸荧光素和溴化乙锭等荧光别处理细胞。在荧光灯下，存活的神经细胞呈亮绿色，而死亡细胞的细胞核显红色。根据存活细胞占总细胞的百分率可以计算出提取物中毒素含量，该方法的检测最低限度约为O.4μg STX/100g 鲜组织[16] 。
近年来，Tcllett Bioteck Ltd公司设计研制出一种用于PSP检测的神经细胞生物分析装置(MIST TM 装置)。其原理是抑制剂与激动剂对神经细胞上钠离子通道的竞争性相互作用，是由神经细胞瘤生物分析法(McMroUa5toma bjoasssy)发展而来。MIST TM 装置已成功地用于酸性粗毒中PSP总毒性的测定及纯STX、neoSTX、GTX 2/3 和dcSTX相关毒性的测定。该装置的最低检测限度为2μg/100g 鲜组织 ，约为MBA法灵敏度的20倍;此外，它无需组织培养的设备和专门知识 [14] 。
4.2 理化分析法
用于PSP理化分析技术的共同原理，是通过碱性氧化作用将毒素分子氧化成有色的或荧光衍生物，再通过荧光或紫外光检测系统进行分析。
4.2.1 高效液相色谱法(HPLC)
HPLC法是九十年代PSP研究领域较成熟和普遍使用的理化检测技术之一。可分为柱前反应法和柱后反应法。HPLC法是一种非常快速的方法，被认为可以与小鼠生物测定法互换。HPLC法提供了快速、定量的方法区分存在的毒素结构，例如在塔斯马尼亚HPLC法用来确定G.catenatum是与贝类中PSP有关的生物体。G.catenatum主要产生低毒性的磺酰氨甲酰基类毒素C1～C4。贝类吃入含有这种毒素的G.catenatum，但是它们还含有一些氨基甲酸盐和脱氨甲酰基类毒素。HPLC法可以检测出是PSP由于磺酰氨甲酰基构成的化学转化结构还是由双鞭甲藻有选择性的保留的微量结构。HPLC法的检出限通常比小鼠生物检测法低，HPLC法的灵敏度是小白鼠分析法的4～400倍，平均灵敏度小于1μgSTX eq./100g，最低检测值为0.5～25ng STX eq/100g [14] 。然而，HPLC法需要根据小鼠生物测定法进行广泛的标定，而且HPLC方法存在PSP分析标准品全球缺乏的普遍问题，每种PSP类似物的毒性种类都是唯一的，很多类似物很容易相互转化，对样品中的原始或潜在总毒性作出判断较困难的。这是影响该法普遍推广的主要原因。目前一些发达国家如荷兰、加拿大等法定使用该法。
4.2.2 其他方法
4.2.2.1 分光光度法
最早用于PSP分析，其原理是:先将毒素分子吸附到阳离子交换树脂上，通过Jaffe反应将毒素分子中的胍基氧化成有色衍生物，洗脱后用分光光度仪检测。因该技术易被其它含胍基化合物干扰，测得结果往往比实际偏高。其检测范围为1000～1500μg/kg [13] 。
4.2.2.2 电泳技术(Electrophoresis technique)
在PSP家族中，各种毒素分子所带电荷量不同，如STX、neoSTX、dc-neoSTX、dc-STX等均带两个正电荷:GTX 1～6 、dc-GTX 1～4 、do-GTX 2/3 等均带一个正电荷;而C 1～4 都不带电荷。所带电荷量的差异可用电泳技术初步分离PSP，在醋酸纤维薄膜上涂氧化剂(如H 2 O 2 等)加热氧化。使毒素分子发生颜色反应，在紫外灯下检测。在多种电泳技术中，最常用的是毛细管电泳(Capillary elec-trophoresis，CE)，主要用于分离测定PSP毒素中的非衍生毒素，如STX，noeSTX等，电泳峰常通过一个离子喷雾CE-MS接口)用质谱仪检测。而串联的质谱分析技术可提供毒素分子的结构信息，以鉴定各异构复合物 [13] 。
4.2.2.3 色谱技术(Chromatography)
a、薄层色谱法(thin layer chromatography)固定相一般为硅胶，流动相是n-丁醇、醋酸、水溶剂系统或嘧啶、乙酸乙酯、醋酸、水等溶剂系统，显色时用H 2 O 2 .KOH，Waber试剂，fast blue B试剂，sakaguchi试剂和Jaffe试剂等作氧化剂。Shoptaugh等人发现，waber试剂、sakaguchi试剂和Jaffe试剂均能检测2Fμg的STX;sakaguchi试剂的GTX 2/3 检测限度为2μg;fast blue B试剂则可检测低至0.01μg的STX，但它缺乏专一性;而H 2 O 2 和KOH可使STX和GTX 2/3 产生荧光，易于检测。薄层色谱法和电泳技术在七、八十年代的使用频率较高。但均不够灵敏，且只能检测7～9种PSP。目前已很少人用 [13] 。b、气相色谱法(gaschromatography GC)该技术已不再直接用于PSP测定，仅在化学分类上做有机成分的粗略测定，将含PSP的贝从无毒贝中鉴别出来 [14] 。
4.3 免疫化学法
免疫分析技术分为血球凝聚、放射免疫分 析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)等。RIA法和ELISA法的STX检测限度已能达到低于1ng [15，16] 。其中，直接的竞争性ELISA(dc-ELISA)法是最常用的一种。另一种较常用的方法是间接的竞争性ELISA。用免疫化学方法检测PSP在1989年以后才见于文献报道。用于检测PSP的免疫化学技术主要以单克隆抗体(Monoclonal antibody，MAb)为基础。国外学者对抗PSPMAb制备及PSP定量测定方法进行了尝试，取得了满意的结果。PSP本身为小分子物质，不具有免疫原性，因此需要连接到大分子载体上，使其成为完全抗原，再用来免疫动物。一般采用小剂量长周期免疫方案制备单克隆抗体。目前有关MAb用于检测PSP的报道很少。检出限为0.03～100μg/孔(0.3～1000μg/ml)，且本法对样品处理要求较低，干扰也少。由于MAb检测方法快速、简便、灵敏、特异、经济，因此这种方法的推广应用有着广泛的前景。受体分析法也属于免疫化学法，又称为固相受体结合法或生物分子分析法。这种方法是将取自大鼠大脑细胞膜上的钠通道受体固定在微滴度板表面，通过待测样品和氚标记的标准STX与受体的竞争性结合来测定样品中PSP的毒性;其检测限度已达0.5ngSTX/ml;最近，人们又发现一种可由节肢动物和脊椎动物体内获得的可溶性蛋白-saxiphltin它在结构上与转铁蛋白相似，而且能与STX、dc-STX、neo-STX等PSPs高度亲和，与C 1 的亲和力则较低。其高度的亲和力、对各种PSPs的非选择性结合及对TTx的不敏感性，使得研究人员认为saxiphltin可代替钠通道受体。另一种主要检测钠通道堵塞物(STX)的极端灵敏的组织生物传感器，这种传感器是将一个钠电极整合到—个含8%NaCl溶液的腔内，电极头上覆盖有三层膜，即两层醋酸纤维素膜之间夹一层蛙的膀胀膜。该传感器一次检测只需5min左右，可检测低于86fg/ml的STX。而且，在有0.003%NaN 3 的情况下，这种传感器可持续使用约250个h[17] 。 表2 常用PSP分析方法检出限或灵敏度参考表(略)
PSP的定量测定方法很多，各有其优缺点，检出限或灵敏度各不相同可根据实际工作需要选用。我国拥有丰富的贝类资源，目前国际贸易增加，国际要求PSP的检出含量也越来越低，国内一些水产企业迫切需要有适合既与国际标准符合又与我国实际相符的检测方法，建立一种能满足可靠、先进、可行要求的PSP检测方法是十分必要的。
5 我国PSP的研究现状及展望
九十年代以来，我国的生物毒素研究进步比较明显，但是在PSP的研究方面则显得相对薄弱，只有个别科研单位对其进行基础研究，对PSP的检测只是简单模仿国外方法。因而我国仍处于对已有的Alexandrium spp，Pyrodiniumspp，Gymnodinium spp等有毒藻的发现报告状况，这仅能说明我国已经存在严重的PSP污染问题，我国水养殖业也面临着PSP的威胁。因此，进行PSP相关问题的研究，对于麻痹性贝类中毒防治、水产业的顺利发展以及公众的健康都是非常必要的。针对我国研究的现状，作者认为，在今后我国应在以下几个方面进行重点研究:PSP分析方法的研究、我国PSP产毒藻的分类与鉴定新技术研究、PSP毒理学和生态毒理学研究、我国PSP污染状况及分布规律研究和建立健全我国PSP管理和控制体系(包括国家限量标准的制定)等。
参考文献:
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麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish poison PSP)中毒已经作为重要的公共卫生问题得到了全世界的关注。人类通常摄入因食用滤食浮游生物(含有毒微藻类)后产生PSP的贝类水产品(如蚌类，牡蛎和蛤等)而引起麻痹性贝类中毒，中毒症状以神经系统症状为主甚至引起死亡。本文对PSP研究进展综述如下。
1 背景
在所有的贝类产品食物中毒事件中，麻痹性贝类中毒被公认为是对健康危害最严重的之一。资料报道l972～1982年日本中毒患者达1192人，1981年西班牙有5000人中毒，1983年菲律宾300人中毒，并有21人死亡，截至目前，全球沿海地区都有麻痹性贝类中毒致死事件的报道。PSP是一类神经肌肉麻痹剂，对人体的作用机理主要是阻断细胞钠离子通道，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。贝类摄入此毒素对本身无害，因毒素在贝类体内呈结合状态。当人食入后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用，潜伏期仅数分钟或数小时，症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，严重的会导致呼吸停止。PSP毒性强，其毒性是眼镜蛇毒性的80倍，其毒力与神经毒气沙林相同，在国际条约中已被列为化学武器。目前还没有针对麻痹性贝类中毒的特效解毒剂，因此人类摄入超过一定限量的PSP时，其病死率达100%。
2 PSP的主要来源
人类食用蛤和贻贝所引起的中毒国内外历史文献中早已有所记载，但其确切发病原因一直不为人们所知，直到1927年美国加州大学的研究员观察到一种特殊的双鞭甲藻在贻贝壳上开花，很多人在食用了这种贻贝后就发生麻痹并且甚至死亡，因此研究人员推测这种双鞭甲藻是有毒的，并且发现在双鞭甲藻(A.catenella，或Gonyaulax catenella)中提取出的酸性水，其与有毒贻贝都能够导致小鼠以同一种方式死亡。当研究人员把无毒贻贝放在含有双鞭甲藻培养基的广口瓶中数日，贻贝迅速变为有毒，当把它们转移到有无毒生物体的广口瓶中时，有毒贻贝在一周到两周内排泄或消灭毒素，从而最后确定了双鞭甲藻与有毒贻贝的关系 [1，2] 。1966年，美国科学家Schantz最先提出了证据证明贻贝(Mytilus californianus)和白塔蛤S.giganteus)中石房蛤毒素与亲代麻痹性贝类毒素分子的同一性 [3] 。 海洋微藻类是用显微镜可观察到的单细胞生物，在海洋食物链中处于最底层。在有利的环境条件下，一些藻类能够迅速的增殖产生密集的细胞浓度，即水华(bloom)。通过对2000种现存种类的双鞭甲藻的评估，只有30种会产生PSP。当有毒微藻类产生水花时即为“有害海藻”(HAB)。大量的水华会使水产生微黄色或微红色的变色，因此被称为赤潮。
PSP的来源并不限于游动的海藻形式，海藻经常以胞囊的形式存在于海底沉积物的上层。生活在海底部的贝类如海洋扇贝就可能以深海底的孢子为食物，他们的毒性有可能比有游动的细胞还强。早期的PSP研究曾推测深海底的孢子群在特定时期发芽是HAB的季节性的原因，但是只在70年代末，休眠中的孢子最终确认为有毒双鞭甲藻。
PSP主要来源包括三种形态学上截然不同的海产双鞭甲藻属。
Alexandrium spp.，Pyrodinium spp.，Gymnodinium spp.
四种淡水蓝绿藻:Aphanizomenon flos-aquae，Anabaena circinalis，Lyngbya wollei和Cylindrospermopsis raciborskii。
虽然双鞭甲藻是PSP的直接来源是无疑的，但它们可能不是海洋环境中PSP的唯一或最终的来源。有越来越多的证据证明PSP是由微生物引起的毒素，并且细菌藻在HAB生态学中有相互作用。Silva(1962)认为双鞭甲藻中的石房蛤毒素由内共生的细菌产生的;1996年，Kodama从双鞭甲藻(A.tamarense)中分离出产生PSP的细菌。另外，已经分离出的海洋细菌包括弧菌属Vibrio，对极鞭毛属，Alteromonas毗邻单胞菌属Plesiomonas和假单胞菌属Pseudomonas几种，它们能产生PSP。1996年，Gallacher概括证明细菌产生毒素阻碍钠离子通道，并且还发现在双鞭甲藻培养基中离析出能产生PSP的细菌。然而，细菌和双鞭甲藻与PSP产生的准确关系仍在讨论中。
麻痹性贝类中毒通常是由于食用含有PSP的双壳贝类水产品引起，这些贝类通过滤食摄入大量浮游生物中的有毒双鞭甲藻。下面几种双壳类软体动物与PSP有关[4] 。
贻贝类:Mytilus，Modiolus;蛤类:Saxidomus，Protothaca，Spisula，Mya，Arctica，Humilaria，Mercenaria，Mesodesma，Tresus and Ensis;牡蛎:Crassostrea，Ostrea;扇贝类:Placopecten，Pecen，Spondylus and Hinnites;海扇类:Cardium，Clinocardium。
尽管双壳贝软体动物是最重要的PSP的携带者，可食用的食肉类和以腐肉为食的腹足纲动物，甲壳类及鱼都可能成为携带者(见表1)。 表1 常见携带PSP的可食用食肉或腐肉纲动物、甲壳类和鱼类名称(略)
食肉类:1998年，Chen and Chou在含有毒双鞭甲藻A.minutum的培养基中饲养滤食紫贻贝，在几天后紫贻贝变得有毒而且用来喂养食肉的腹足动物—象牙贝(这种贝在台湾是非常受欢迎的)。经检测在象贝类的内脏中发现了膝钩藻毒素A.minutumGTX1-4，但象牙贝中的GTX1有显著的退化，GTX2和GTX4都有所增加。双鞭甲藻中的PSP通过滤食活动转移到紫贻贝体内，然后通过双壳贝传播到食肉象牙贝内。
鱼及其它类:1998年，Amott在维多利亚、澳大利亚海岸的石龙虾内脏及鲍鱼体内检出，提出龙虾及鲍鱼可能通过食物链摄取毒素。赤潮期，鱼类可能暴露于溶有PSP的水中，或直接通过食用含有PSP的有毒双鞭甲藻、食草浮游动物、食肉贝类或小鱼而带毒。在印尼，曾发生由于食用鲱鱼引起麻痹性贝类中毒事件，但未鉴定出双鞭甲藻，这些鱼也没有以双鞭甲藻为食，而是以浮游动物为食，因此浮游动物有可能将来源于双鞭甲藻的毒素转移到鱼类中。
3 PSP的理化性质
PSP是一种极易溶于水的白色吸水固体，部分溶于甲醇和酒精，不溶于大多数非极性溶剂如乙醛、石油醚。它是一种生物碱，容易从酸性溶液中萃取。在紫外线范围内不被吸收，pKa值在8.2到11.5间，旋光度大概是+130。分子式是C 10 H 17 N 7 O 4 ，分子量是(MW)是299。在氢氯化盐中分子量是372。
PSP的基本结构是有两个胍盐基的四水化嘌呤。目前发现的大约20种化合物属于STX一族。两个亲代化合物是STX，N-羟基衍生出neoSTX。大多数衍生物是这两个分子特定位置硫酸盐化的结果。
世界各国对PSP分类虽各不相同，但目前已分离出20多种毒素，依基因的相似性可将这些毒素分为4类:①氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins)，包括石房蛤毒素(STX)，新石房蛤毒素(neoSTX)，膝沟藻毒素1-4(GTX1-4);②N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，包括GTX5(B1)，GTX6(B2)，C1-4;③脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，包括dcSTX，dcneoSTX，dcGTX1-4;④N-羟基类毒素(N-hydroxycarbamoyl toxins)，包括hySTX和hyneoSTX;其中氨基甲酸酯类毒素中的STX，neoSTX，GTX1-4最常见，其中STX的占PSP的85%以上，人类目前研究STX也最为广泛，一般研究PSP主要是STX为主要研究对象 [5] 。
PSP通常分为氨基甲酰或氨基甲酸盐毒素(STX，neoSTX，GTX1-4)，它们的N-磺酰氨甲酰基类毒素衍生物(GTX5，GTX6，and C1-4)和脱氨甲酰基类毒素 [6，7] 。STX的两个胍基每个带有一个正电荷(图1)。STX和neoSTX具有近似相同的电荷和毒性。R2/R3(GTX1-4)的11-硫酸氢盐基和每个R4(B1，B2，C1-4)的21-磺基能还原一个单位的净电荷。净电荷对层析法和PSP的毒物学都有重要的影响。
PSP的稳定性如下:STX>neoSTX>GTX2，3>GTX1，4。稳定性的差异和互变现象的存在引起毒素分析的差异。neoSTX多样性的减小导致了STX的形成，有证据表明生物体系有类似的转换发生 [8] 。PSP的主要结构见图1。
4 PSP的检测方法
PSP是碱性的水溶性化合物，在碱性环境和空气氧化下不稳定，又由于PSP存在大量的变异，因此合成物中PSP的分析也很复杂，并且随着检出痕量要求的提高，PSP的分析技术也必须不断发展出精确、可靠的针对性分析方法。当前全球PSP的分析方法繁多，日、美两国学者为控制中毒的发生对PSP的检测方法进行了大量的研究。尤其在日本，建立了多种检测方法。这些方法按其性质可归结为生物、理化和免疫化学三个方面。
4.1 生物测定法
4.1.1 小鼠生物测定法(MBA)
MBA作为PSP的半定性分析方法，被美国公职分析化学家协会(AOAC)推广为PSP的标准检测方法，同时也是唯一国际大多数国家普遍接受的统一方法。AOAC定义一个鼠单位(MU相当于0.18μg)为给予20g小白鼠注射1ml贝类提取物使其在15min内致死的最小剂量。尽管该方法在概括样品毒性方面相当有效，但也有较多的限制，如该法不能确定样品中毒素结构;毒素分子与受体亲和的错误率高(±20%);该法是利用对小白鼠腹腔注射毒物测定其死亡时间以确定毒性大小，因此灵敏度低，其检出限约160ngSTX/m1或40μgSTXeq./100g贝肉;该法在标准程序中不同小鼠的品系、批次、损伤程度和大小对毒素的灵敏度有很大的波动性;浪费较多的毒素和需使用活体动物等等 [2，11] 。
4.1.2 其他生物测定法
4.1.2.1 家蝇生物分析法(House_fly biassay)
将一定量的酸性组织PSP提取液注入麻醉的家蝇体内、约10min后、家蝇的活动减弱直至死亡。其分析方法与MBA法相似。PSP的最低检测水平约为20μgSTX-eq./100g [12，13] 。
4.1.2.2 蝗虫生物分析法(Locust bioassy LBA)
近年来，Mcel- hiney等人用沙漠蝗虫(schistocerca gregaria)来检测PSP的毒性。其结果与MBA及HPLC等方法的检测结果基本相符。于蝗虫的第2和3体节之间.沿着腹部注射10μg测试样品液，记录注射后30、60和90min时被麻痹昆虫的百分数。计算出ED50值，从而检测出样品毒性。蝗虫生物分析法操作简单、方便、费用低廉，而效果与MBA法相似;家蝇生物分析法虽然比较灵敏，却难以操作，样品液须显微注射。故Mcelhiney等建议以LBA法用作一定样品范围的PSP常规检测方法 [15] 。
4.1.2.3 神经细胞生物分析法(Neurronal bioassay)
这种方法也称为组织培养分析法，以大鼠小脑神经细胞来检测有毒口中PSP的一种细胞毒性生物分析新方法。将分离的小脑神经细胞悬浮于一定的培养基中，该细胞一旦在培养基中分化，就能够表达对PSP敏感的电压依赖式钠离子通道。用一定浓度的藜芦定(veratridine)处理。分别往培养基中加入不同浓度的贝肝胰PSP提取物或不同稀释度的标准毒素。24h后，用二乙酸荧光素和溴化乙锭等荧光别处理细胞。在荧光灯下，存活的神经细胞呈亮绿色，而死亡细胞的细胞核显红色。根据存活细胞占总细胞的百分率可以计算出提取物中毒素含量，该方法的检测最低限度约为O.4μg STX/100g 鲜组织[16] 。
近年来，Tcllett Bioteck Ltd公司设计研制出一种用于PSP检测的神经细胞生物分析装置(MIST TM 装置)。其原理是抑制剂与激动剂对神经细胞上钠离子通道的竞争性相互作用，是由神经细胞瘤生物分析法(McMroUa5toma bjoasssy)发展而来。MIST TM 装置已成功地用于酸性粗毒中PSP总毒性的测定及纯STX、neoSTX、GTX 2/3 和dcSTX相关毒性的测定。该装置的最低检测限度为2μg/100g 鲜组织 ，约为MBA法灵敏度的20倍;此外，它无需组织培养的设备和专门知识 [14] 。
4.2 理化分析法
用于PSP理化分析技术的共同原理，是通过碱性氧化作用将毒素分子氧化成有色的或荧光衍生物，再通过荧光或紫外光检测系统进行分析。
4.2.1 高效液相色谱法(HPLC)
HPLC法是九十年代PSP研究领域较成熟和普遍使用的理化检测技术之一。可分为柱前反应法和柱后反应法。HPLC法是一种非常快速的方法，被认为可以与小鼠生物测定法互换。HPLC法提供了快速、定量的方法区分存在的毒素结构，例如在塔斯马尼亚HPLC法用来确定G.catenatum是与贝类中PSP有关的生物体。G.catenatum主要产生低毒性的磺酰氨甲酰基类毒素C1～C4。贝类吃入含有这种毒素的G.catenatum，但是它们还含有一些氨基甲酸盐和脱氨甲酰基类毒素。HPLC法可以检测出是PSP由于磺酰氨甲酰基构成的化学转化结构还是由双鞭甲藻有选择性的保留的微量结构。HPLC法的检出限通常比小鼠生物检测法低，HPLC法的灵敏度是小白鼠分析法的4～400倍，平均灵敏度小于1μgSTX eq./100g，最低检测值为0.5～25ng STX eq/100g [14] 。然而，HPLC法需要根据小鼠生物测定法进行广泛的标定，而且HPLC方法存在PSP分析标准品全球缺乏的普遍问题，每种PSP类似物的毒性种类都是唯一的，很多类似物很容易相互转化，对样品中的原始或潜在总毒性作出判断较困难的。这是影响该法普遍推广的主要原因。目前一些发达国家如荷兰、加拿大等法定使用该法。
4.2.2 其他方法
4.2.2.1 分光光度法
最早用于PSP分析，其原理是:先将毒素分子吸附到阳离子交换树脂上，通过Jaffe反应将毒素分子中的胍基氧化成有色衍生物，洗脱后用分光光度仪检测。因该技术易被其它含胍基化合物干扰，测得结果往往比实际偏高。其检测范围为1000～1500μg/kg [13] 。
4.2.2.2 电泳技术(Electrophoresis technique)
在PSP家族中，各种毒素分子所带电荷量不同，如STX、neoSTX、dc-neoSTX、dc-STX等均带两个正电荷:GTX 1～6 、dc-GTX 1～4 、do-GTX 2/3 等均带一个正电荷;而C 1～4 都不带电荷。所带电荷量的差异可用电泳技术初步分离PSP，在醋酸纤维薄膜上涂氧化剂(如H 2 O 2 等)加热氧化。使毒素分子发生颜色反应，在紫外灯下检测。在多种电泳技术中，最常用的是毛细管电泳(Capillary elec-trophoresis，CE)，主要用于分离测定PSP毒素中的非衍生毒素，如STX，noeSTX等，电泳峰常通过一个离子喷雾CE-MS接口)用质谱仪检测。而串联的质谱分析技术可提供毒素分子的结构信息，以鉴定各异构复合物 [13] 。
4.2.2.3 色谱技术(Chromatography)
a、薄层色谱法(thin layer chromatography)固定相一般为硅胶，流动相是n-丁醇、醋酸、水溶剂系统或嘧啶、乙酸乙酯、醋酸、水等溶剂系统，显色时用H 2 O 2 .KOH，Waber试剂，fast blue B试剂，sakaguchi试剂和Jaffe试剂等作氧化剂。Shoptaugh等人发现，waber试剂、sakaguchi试剂和Jaffe试剂均能检测2Fμg的STX;sakaguchi试剂的GTX 2/3 检测限度为2μg;fast blue B试剂则可检测低至0.01μg的STX，但它缺乏专一性;而H 2 O 2 和KOH可使STX和GTX 2/3 产生荧光，易于检测。薄层色谱法和电泳技术在七、八十年代的使用频率较高。但均不够灵敏，且只能检测7～9种PSP。目前已很少人用 [13] 。b、气相色谱法(gaschromatography GC)该技术已不再直接用于PSP测定，仅在化学分类上做有机成分的粗略测定，将含PSP的贝从无毒贝中鉴别出来 [14] 。
4.3 免疫化学法
免疫分析技术分为血球凝聚、放射免疫分 析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)等。RIA法和ELISA法的STX检测限度已能达到低于1ng [15，16] 。其中，直接的竞争性ELISA(dc-ELISA)法是最常用的一种。另一种较常用的方法是间接的竞争性ELISA。用免疫化学方法检测PSP在1989年以后才见于文献报道。用于检测PSP的免疫化学技术主要以单克隆抗体(Monoclonal antibody，MAb)为基础。国外学者对抗PSPMAb制备及PSP定量测定方法进行了尝试，取得了满意的结果。PSP本身为小分子物质，不具有免疫原性，因此需要连接到大分子载体上，使其成为完全抗原，再用来免疫动物。一般采用小剂量长周期免疫方案制备单克隆抗体。目前有关MAb用于检测PSP的报道很少。检出限为0.03～100μg/孔(0.3～1000μg/ml)，且本法对样品处理要求较低，干扰也少。由于MAb检测方法快速、简便、灵敏、特异、经济，因此这种方法的推广应用有着广泛的前景。受体分析法也属于免疫化学法，又称为固相受体结合法或生物分子分析法。这种方法是将取自大鼠大脑细胞膜上的钠通道受体固定在微滴度板表面，通过待测样品和氚标记的标准STX与受体的竞争性结合来测定样品中PSP的毒性;其检测限度已达0.5ngSTX/ml;最近，人们又发现一种可由节肢动物和脊椎动物体内获得的可溶性蛋白-saxiphltin它在结构上与转铁蛋白相似，而且能与STX、dc-STX、neo-STX等PSPs高度亲和，与C 1 的亲和力则较低。其高度的亲和力、对各种PSPs的非选择性结合及对TTx的不敏感性，使得研究人员认为saxiphltin可代替钠通道受体。另一种主要检测钠通道堵塞物(STX)的极端灵敏的组织生物传感器，这种传感器是将一个钠电极整合到—个含8%NaCl溶液的腔内，电极头上覆盖有三层膜，即两层醋酸纤维素膜之间夹一层蛙的膀胀膜。该传感器一次检测只需5min左右，可检测低于86fg/ml的STX。而且，在有0.003%NaN 3 的情况下，这种传感器可持续使用约250个h[17] 。 表2 常用PSP分析方法检出限或灵敏度参考表(略)
PSP的定量测定方法很多，各有其优缺点，检出限或灵敏度各不相同可根据实际工作需要选用。我国拥有丰富的贝类资源，目前国际贸易增加，国际要求PSP的检出含量也越来越低，国内一些水产企业迫切需要有适合既与国际标准符合又与我国实际相符的检测方法，建立一种能满足可靠、先进、可行要求的PSP检测方法是十分必要的。
5 我国PSP的研究现状及展望
九十年代以来，我国的生物毒素研究进步比较明显，但是在PSP的研究方面则显得相对薄弱，只有个别科研单位对其进行基础研究，对PSP的检测只是简单模仿国外方法。因而我国仍处于对已有的Alexandrium spp，Pyrodiniumspp，Gymnodinium spp等有毒藻的发现报告状况，这仅能说明我国已经存在严重的PSP污染问题，我国水养殖业也面临着PSP的威胁。因此，进行PSP相关问题的研究，对于麻痹性贝类中毒防治、水产业的顺利发展以及公众的健康都是非常必要的。针对我国研究的现状，作者认为，在今后我国应在以下几个方面进行重点研究:PSP分析方法的研究、我国PSP产毒藻的分类与鉴定新技术研究、PSP毒理学和生态毒理学研究、我国PSP污染状况及分布规律研究和建立健全我国PSP管理和控制体系(包括国家限量标准的制定)等。
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