Pluronic聚合物胶束体外逆转肿瘤细胞耐药性研究
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2007年1月25日
作者：韩丽妹，王建新(上海)
恶性肿瘤细胞的多药耐药性是导致肿瘤化疗失败的主要原因[1,2]，克服肿瘤多药耐药性，寻找逆转恶性肿瘤细胞多药耐药的新途径，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是当前肿瘤领域的重要课题之一。本课题组以逆转肿瘤多药耐药为目的，研制了紫杉醇的Pluronic P123胶束，动物体内研究获得了较理想的结果，该胶束体系可显著延长紫杉醇的体内循环时间，显著增加药物的生物利用度[3]。本文以此为基础，进一步在分子生物学水平上，研究Pluronic P123胶束逆转肿瘤细胞耐药性作用及机理，从制剂学角度上探索逆转肿瘤细胞多药耐药的新途径。
1 材料和仪器
Skov-3/PTX耐药细胞株(自诱导)；Caco-2细胞株，购自美国ATCC (American Type Culture Collection, Rochville, MD, USA), 实验用的细胞传代数在35-50代。
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紫杉醇(PTX，含量99.1%，西安三江生物工程有限公司)；Pluronic P123 (BASF，Ludwigshafen Germany);真核细胞总RNA提取试剂盒、通用RT-PCR试剂盒(BioDev博大泰克)；RT-PCR引物(英骏生物技术有限公司合成)；DPH(Molecular Probes, Inc, USA)；ATP测定试剂盒(Molecular Probes, Inc, USA)。
Power Wave XS型酶标仪(Bio-Tek，美国)；PCR扩增仪(Eppendorf，Germany)；FLS 920型稳态/瞬态荧光光谱仪(Edinburgh Instruments Ltd.，England)；BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理所)。
2 方法
2.1 胶束制备[4]
采用薄膜水化法制备PTX共聚物胶束。称取处方量的紫杉醇及载体材料Pluronic P123至容器中，加有机溶剂适量，磁力搅拌2 h，使其完全溶解。旋转蒸发将有机溶剂蒸干，真空干燥过夜去除残留溶剂，得干燥药膜。水浴60 ℃加热，使固体骨架溶解，以获得透明的凝胶样样品。加入适量同温度水，恒速搅拌1 h(600 rpm)，用0.45 μm膜过滤，得透明胶束溶液，冻干备用。
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2.2 PTX胶束的细胞摄取
胶束冻干品于实验前加入HBSS复溶，并将胶束溶液稀释至5、10、25、50 µg/mL，进行Caco-2及Skov-3/PTX细胞摄取试验。将10 mg/mL的PTX/DMSO储备液用HBSS稀释至不同浓度，作为阴性对照组。阳性对照组为不同浓度PTX溶液同时给予10 µM环孢菌素。细胞样品一部分采用HPLC法测定PTX含量，一部分用考马思亮蓝法测定细胞蛋白含量。
2.3 Rh-123胶束的细胞摄取
制备Rh-123的Pluronic P123胶束溶液(5 µM Rh-123，1%P123)进行Caco-2及Skov-3/PTX细胞摄取试验；单独给予浓度为5µM 的Rh-123作为阴性对照组；阳性对照组为：含10 µM环孢菌素的5 µM Rh-123溶液。用荧光显微镜观察细胞内Rh-123的荧光强度。
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2.4 PTX胶束的体外细胞毒研究
将对数生长期的Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞以3×104 cells/孔接种于96 孔板，48 h 后分别加入不同浓度化疗药物，每一浓度平行3孔。对照组1为不加细胞仅含培养液的空白对照；对照组2为不加药物仅加细胞的阴性对照；实验组1：浓度为1、10、100 ng/mL及1、10 、100 μg/mL的PTX；实验组2：同浓度系列的Taxol制剂；实验组3：同浓度系列的PTX-Pluronic P123胶束制剂。培养48 h后弃上清，每孔加5 mg/mL的MTT液20 μL，37 ℃继续培养4 h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加200 μL DMSO，避光振荡使结晶物充分溶解。以酶标仪检测490 nm 处的吸光度值( A )，参比波长为630 nm。计算细胞生存率( IC)，并求半数抑制浓度IC50 [5]。
2.5 细胞膜流动性的测定[6]
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以胆固醇 (25 μM) 和苯甲醇 (30 mM) 作为对照组[7]。分子探针DPH用四氢呋喃配制成1 mM的储备液，避光保存备用。将处于对数生长期的Skov-3/PTX细胞消化，用pH7.4的HBSS稀释成浓度为5×105 cells/mL细胞混悬液。取1 mL的细胞悬液，加入浓度为0.002%、0.02%、0.2%、2%的空白胶束溶液1 mL，再加入2 µL的DPH储备液，混匀后，25 ℃避光温育30 min。采用荧光法，激发波长和发射波长分别为362 nm和432 nm，立即测定分子探针DPH在水平方向和垂直方向的荧光强度，计算细胞膜的各向异性值r。
2.6 RT-PCR测定耐药细胞MDR1、MRP和GST-π mRNA水平[7]
取对数生长期的Skov-3/PTX细胞，给予10 µM环孢菌素或浓度为0.1%的Pluronic P123胶束溶液作用后，以Trizol试剂盒提取细胞总RNA，合成cDNA。PCR引物见表1，β-action 作为内参基因。反应参数为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，退火温度55 ℃，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35圈，72 ℃再延伸4 min。用2 %琼脂糖电泳观察PCR产物。
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表 1 PCR引物序列、退火温度及片度长度
Tab 1 Sequences of primers for PCR
Transcript Primer Sequence(5’→3’) Annealing(℃) Product(bp)
MDR1 AGCAAATCTTGGGACAGGAA 55 230
CAAACTTCTGCTCCTGAGTC
MRP ATGGACTACACAAGGGTGATCG 55 335
TCCGCATCTCTGTCTCTCC
GST-π CAGGAGGGCTCACTCAAAG 55 369
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GATCAGCAGCAAGTCCAGCAG
β-actin GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA 58 650
GCATTTGCGGTGGACGATGGAGG
2.7 荧光素-荧光素酶法测定耐药细胞ATP水平[8]
配制荧光素-荧光素酶反应溶液，制备ATP含量测定标准曲线。将Pluronic P123空白胶束溶液作用后的Skov-3/PTX细胞用2%三氯乙酸溶液提取ATP。在发光仪中加入90 μL标准反应溶液和10 μL ATP样品，立即进行发光读数，代入标准曲线即可得样品中ATP含量。以不予胶束作用的Skov-3/PTX细胞作为对照。
3 结果
3.1 PTX胶束的细胞摄取
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PTX-Pluronic P123胶束在Caco-2细胞中的摄取测定结果见图1，在Skov-3/PTX细胞中的摄取测定结果见图2。
图 1 紫杉醇胶束在Caco-2细胞中的摄取
Fig 1 The effect of Pluronic P123 micelles on PTX uptake in Caco-2 cell lines (Each point presented the meanSD of 3 experiments)
图 2 紫杉醇胶束在Skov-3/PTX细胞中的摄取
Fig 2 The effect of Pluronic P123 micelles on PTX uptake in Skov-3/PTX cell lines (Each point presented the meanSD of 3 experiments)
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结果显示，各浓度给药条件下，胶束组的Caco-2细胞摄取量均高于PTX溶液组，尤其是高浓度(25、50μg/mL)剂量条件，差异显著(P<0.01)。与阳性对照组环孢菌素(10 µM)相比，胶束组在低浓度剂量条件下的细胞摄取量略低，高浓度时摄取量略高，但均无显著性差异(P>0.05)。各浓度给药条件下，胶束组的Skov-3/PTX细胞摄取量均显著高于阴性对照组(P<0.05)，且随着PTX浓度的升高(载体浓度升高)，两者的差异也越大。胶束组除低浓度(5 μg/mL)之外的细胞摄取量均略高于阳性对照组，但均无显著性差异(P>0.05)。该结果表明Pluronic P123胶束可以显著增加PTX在Caco-2和Skov-3/PTX细胞中的摄取量，且作用具有浓度依赖性。
3.2 Rh-123胶束的细胞摄取
荧光显微镜观察Rh-123胶束在Caco-2细胞中的摄取情况见图3，在Skov-3/PTX细胞中的摄取情况见图4。
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(A) (B)
(C)
图3 Rh-123胶束在Caco-2细胞中的蓄积
Fig 3 Accumulation fluorescence microscopy of Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles in Caco-2 cells.(A)：5.0 μM Rh-123；(B)：5.0 μM Rh-123 and 10 μM CsA；(C)：Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles including 5.0 μM Rh-123 and 0.1%Pluronic P123
(A) (B)
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(C)
图4 Rh-123胶束在Skov-3/PTX细胞中的蓄积
Fig 4 Accumulation fluorescence microscopy of Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles in Skov-3/PTX cells.(A)：5.0 μM Rh-123；(B)：5.0 μM Rh-123 and 10 μM CsA；(C)：Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles including 5.0 μM Rh-123 and 0.1%Pluronic P123
罗丹明123 (Rh-123)是P-gp的底物，Caco-2和Skov-3/PTX细胞对Rh-123均有交叉耐药性。由图3可知，阴性对照组Rh-123溶液在Caco-2细胞中摄取量极低，荧光显微镜下几乎观察不到红色荧光，而给予Rh-123的Pluronic P123胶束后，细胞内显现明显红色荧光，且荧光强度与阳性对照组相当。由图4可知，胶束制剂在Skov-3/PTX细胞中的摄取情况与Caco-2细胞中的相似。胶束组荧光强度与阳性对照组相当，远高于阴性对照组。以上结果表明，Pluronic P123胶束可以显著增加Rh-123在Caco-2和Skov-3/PTX细胞中的摄取量，即Pluronic P123胶束可逆转Caco-2和Skov-3/PTX细胞对Rh-123的交叉耐药性。
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3.3 PTX胶束的体外细胞毒研究
PTX胶束制剂对Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞的体外细胞毒研究结果见表2。
表 2 Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞对紫杉醇胶束的IC50值
Tab 2 IC50 of PTX-Pluronic P123 micelles in Caco-2、Skov-3 and Skov-3/PTX cells (n＝3)
Drug IC50(μg/mL)
Caco-2 Skov-3 Skov-3/PTX
PTX 22.19 0.33 15.15
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Taxol 13.53 0.30 7.4
PTX-Micelle 4.4 0.31 1.1
在预试验中，以0.1%空白胶束作用于两种细胞48 h，细胞生存率均高于80%，该结果说明胶束载体Pluronic P123对细胞的毒性较小，对本细胞毒实验影响较小。由上表结果可知，PTX-Pluronic P123胶束、Taxol和PTX对Skov-3的细胞毒性作用相似(P>0.05)，而对Skov-3/PTX，PTX胶束的细胞毒性作用较PTX和Taxol明显增强(P<0.05)。其在Skov-3/PTX细胞中相对于PTX的耐药逆转指数(RRI＝IC50 (PTX)/ IC50 (PTX-Micelle))为13.77，相对于Taxol的耐药逆转指数(RRI＝IC50 (Taxol)/ IC50 (PTX-Micelle))为6.73。即Pluronic P123 胶束可显著提高PTX对耐药细胞的细胞毒性，即Pluronic P123 胶束可以逆转Skov-3/PTX细胞对PTX的耐药性。
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3.3 细胞膜流动性的测定
考察不同浓度Pluronic P123对Skov-3/PTX细胞膜流动性的影响，结果见表3。
表3 Pluronic P123 胶束对DPH各向异性值的影响
Tab 3 Effect of Pluronic P123 micelles on anisotropy of DPH in Skov-3/PTX cells
Fluidity modulators DPH steady state anisotropy(r) Ratio of control %
1 2 3
-(Control) 0.2685 0.2609 0.2700 -
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Cholesterol(0.2 mM) 0.3601 0.3631 0.3385 132.8±5.0
Benzyl alcohol(30 mM) 0.2266 0.2187 0.2352 85.1±3.1
P123(0.001%) 0.2662 0.2603 0.2588 98.2±1.5
P123(0.01%) 0.2259 0.2353 0.2228 85.6±2.4
P123(0.1%) 0.2184 0.2170 0.2233 82.4±1.2
P123(1%) 0.2077 0.2027 0.1950 75.7±2.4
由上表可知，阳性对照胆固醇(0.2 mM) 能显著降低细胞膜脂质双层中亲脂区的流动性，DPH的各向异性值r显著增加(P<0.01)，为对照组的132.8%。阴性对照苯甲醇则可以显著增加细胞膜流动性，DPH的各向异性值r显著下降(P<0.01)，为对照组的85.1%。将载体Pluronic P123稀释成不同倍数后，对细胞膜流动性的影响大小不同。浓度为0.001%的载体几乎不改变DPH的各向异性值，对细胞膜流动性没有显著性影响；浓度为0.01%、0.1%和1%的载体均可以显著增加细胞膜流动性，且载体浓度越高，作用越强。
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3.4 耐药细胞MDR1、MRP和GST-π mRNA水平的测定
胶束制剂作用前后Skov-3/PTX 细胞的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平的RT-PCR测定结果见图5。
(A) (B)
(C)
图 5 RT-PCR测定MDR1、MRP、GST-π的表达
Fig 5 A 2% agarose gel electrophoresis showing the amplicons obtained after RT-PCR amplification. M: PCR Marker; 1: Skov-3; 2: Skov-3/PTX; 3: Skov-3/PTX (10µM CsA) ; 4: Skov-3/PTX (0.1%Pluronic P123 micelles). (A) MDR1; (B): MRP; (C): GST-π
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由上图可见，内参β-actin 各条带清晰，亮度较一致，故各目的条带的亮度强弱可以代表各目的基因的表达强弱。亲本细胞Skov-3上的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平均较低；耐药株Skov-3/PTX的耐药相关基因MDR1、MRP和GST-π均呈现高表达；阳性对照组给予10 μM CsA作用后，Skov-3/PTX的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平较空白耐药株明显减弱；而给予0.1%的Pluronic P123空白胶束溶液作用后，Skov-3/PTX的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平较空白耐药株明显减弱，且较阳性对照组也有明显减弱。故Pluronic P123胶束可以抑制耐药肿瘤细胞的耐药相关基因MDR1、MRP和GST-π的水平。
3.5 荧光素-荧光素酶法测定耐药细胞ATP水平
不同浓度Pluronic P123胶束作用不同时间后 Skov-3/PTX细胞ATP水平测定结果见表4。
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表4 Pluronic P123胶束对Skov-3/PTX细胞ATP水平的影响
Tab 4 The influence of Pluronic P123 micelles on ATP levels of Skov-3/PTX cells
Concentration of carriers Ratio of control (%)
30min 60min 90min
0.01% 132.17±4.19 124.72±5.49 117.53±4.28
0.1% 88.81±2.55 85.69±2.31 83.23±8.92
1% 67.77±4.85 48.87±7.39 43.86±4.32
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由表4可知，作用相同时间，Pluronic P123载体浓度越高，Skov-3/PTX耐药细胞的ATP水平越低。同一浓度Pluronic P123在90min内，作用于细胞时间越长，耐药细胞的ATP水平越低。与不给予胶束作用的空白Skov-3/PTX细胞ATP水平进行比较，发现浓度为0.1%及1%的Pluronic P123可降低细胞的ATP水平，尤其是高浓度载体(1%)，对ATP的耗竭作用尤其显著(P<0.01)，且随作用时间延长ATP水平下降越多。而浓度为0.01%的胶束作用于耐药细胞后，ATP水平反而升高，但随着作用时间的延长，耐药细胞的ATP水平又出现下降趋势。该现象值得进一步探讨。
4 讨论
4.1 Caco-2及Skov-3/PTX细胞对PTX具有显著耐药性[9]，Pluronic P123胶束可以显著增加PTX在Caco-2及Skov-3/PTX细胞中的摄取量，且作用具有浓度依赖性，载体浓度越高，药物摄取量增加越多。Rh-123是膜外排蛋白P-gp的底物，Pluronic P123胶束制剂可以显著增加Rh-123在P-gp高表达的Caco-2及Skov-3/PTX细胞中的聚积量，其作用与P-gp底物CsA相当。故Pluronic P123胶束不但具有逆转Caco-2和Skov-3/PTX细胞对PTX的耐药作用，并且可以逆转对Rh-123的交叉耐药性。
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4.2 PTX胶束制剂对Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞的体外细胞毒研究结果显示Pluronic P123 胶束可显著提高PTX对耐药细胞的细胞毒性。由于载体对细胞的毒性较小，我们认为Pluronic P123 胶束提高PTX对耐药细胞的细胞毒性主要原因在于其可以显著增加PTX在细胞中的蓄积量，故该结果进一步说明了Pluronic P123胶束具有逆转细胞耐药作用。
4.3 P-gp主要分布在细胞膜亲脂性区域，并且它的作用底物多为脂溶性药物[10]。Pluronic P123可以增加细胞膜亲脂性区域的流动性，不仅可以提高疏水性药物(如：Rh-123、紫杉醇)的细胞膜渗透性，并且可以抑制或减少P-gp对作用底物Rh-123、紫杉醇的外排作用，从而增加药物在耐药细胞中的蓄积。
4.4 肿瘤细胞产生多药耐药性的原因复杂，包括多药耐药基因(MDR1)的过度表达；多药耐药相关蛋白(MRP)的过度表达；谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽S转移酶(GST)活性增高；DNA修复功能增强；凋亡抗性增加；蛋白激酶C(PKC)活性增高等多种机制[11, 12]。其中MDR1的过度表达产生的P-gp对药物的外排作用是MDR的主要产生机制。故本文选择了耐药细胞的MDR1、MRP 和GST-π mRNA的水平作为指标，考察Pluronic P123胶束逆转肿瘤细胞耐药的机理。RT-PCR结果显示，Pluronic P123胶束(0.1% P123)可以降低Skov-3/PTX细胞的MDR1、MRP 和GST-π mRNA水平，其对MRP 和GST-π mRNA水平的抑制作用强于CsA。
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4.5 ATP 生物荧光反应原理是在有氧条件下，荧光酶和荧光素结合后催化ATP 转变成AMP , 并释放出光子(波长为562 nm) ，测定产生的荧光强度, 即可获得ATP 的含量[13]。Pluronic P123作用前后耐药细胞Skov-3/PTX 的ATP水平发生显著变化，浓度为0.1%及1%的Pluronic P123可降低细胞的ATP水平。P-gp对药物的外排作用是多药耐药产生的主要原因，P-gp将进入细胞内的药物“泵” 出时需消耗ATP，即具有能量依赖性[14]。故Pluronic P123可以通过耗竭耐药细胞的ATP水平来逆转细胞耐药作用。
参考文献
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制备Rh-123的Pluronic P123胶束溶液(5 µM Rh-123，1%P123)进行Caco-2及Skov-3/PTX细胞摄取试验；单独给予浓度为5µM 的Rh-123作为阴性对照组；阳性对照组为：含10 µM环孢菌素的5 µM Rh-123溶液。用荧光显微镜观察细胞内Rh-123的荧光强度。
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将对数生长期的Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞以3×104 cells/孔接种于96 孔板，48 h 后分别加入不同浓度化疗药物，每一浓度平行3孔。对照组1为不加细胞仅含培养液的空白对照；对照组2为不加药物仅加细胞的阴性对照；实验组1：浓度为1、10、100 ng/mL及1、10 、100 μg/mL的PTX；实验组2：同浓度系列的Taxol制剂；实验组3：同浓度系列的PTX-Pluronic P123胶束制剂。培养48 h后弃上清，每孔加5 mg/mL的MTT液20 μL，37 ℃继续培养4 h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加200 μL DMSO，避光振荡使结晶物充分溶解。以酶标仪检测490 nm 处的吸光度值( A )，参比波长为630 nm。计算细胞生存率( IC)，并求半数抑制浓度IC50 [5]。
2.5 细胞膜流动性的测定[6]
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以胆固醇 (25 μM) 和苯甲醇 (30 mM) 作为对照组[7]。分子探针DPH用四氢呋喃配制成1 mM的储备液，避光保存备用。将处于对数生长期的Skov-3/PTX细胞消化，用pH7.4的HBSS稀释成浓度为5×105 cells/mL细胞混悬液。取1 mL的细胞悬液，加入浓度为0.002%、0.02%、0.2%、2%的空白胶束溶液1 mL，再加入2 µL的DPH储备液，混匀后，25 ℃避光温育30 min。采用荧光法，激发波长和发射波长分别为362 nm和432 nm，立即测定分子探针DPH在水平方向和垂直方向的荧光强度，计算细胞膜的各向异性值r。
2.6 RT-PCR测定耐药细胞MDR1、MRP和GST-π mRNA水平[7]
取对数生长期的Skov-3/PTX细胞，给予10 µM环孢菌素或浓度为0.1%的Pluronic P123胶束溶液作用后，以Trizol试剂盒提取细胞总RNA，合成cDNA。PCR引物见表1，β-action 作为内参基因。反应参数为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，退火温度55 ℃，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35圈，72 ℃再延伸4 min。用2 %琼脂糖电泳观察PCR产物。
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表 1 PCR引物序列、退火温度及片度长度
Tab 1 Sequences of primers for PCR
Transcript Primer Sequence(5’→3’) Annealing(℃) Product(bp)
MDR1 AGCAAATCTTGGGACAGGAA 55 230
CAAACTTCTGCTCCTGAGTC
MRP ATGGACTACACAAGGGTGATCG 55 335
TCCGCATCTCTGTCTCTCC
GST-π CAGGAGGGCTCACTCAAAG 55 369
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GATCAGCAGCAAGTCCAGCAG
β-actin GGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA 58 650
GCATTTGCGGTGGACGATGGAGG
2.7 荧光素-荧光素酶法测定耐药细胞ATP水平[8]
配制荧光素-荧光素酶反应溶液，制备ATP含量测定标准曲线。将Pluronic P123空白胶束溶液作用后的Skov-3/PTX细胞用2%三氯乙酸溶液提取ATP。在发光仪中加入90 μL标准反应溶液和10 μL ATP样品，立即进行发光读数，代入标准曲线即可得样品中ATP含量。以不予胶束作用的Skov-3/PTX细胞作为对照。
3 结果
3.1 PTX胶束的细胞摄取
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PTX-Pluronic P123胶束在Caco-2细胞中的摄取测定结果见图1，在Skov-3/PTX细胞中的摄取测定结果见图2。
图 1 紫杉醇胶束在Caco-2细胞中的摄取
Fig 1 The effect of Pluronic P123 micelles on PTX uptake in Caco-2 cell lines (Each point presented the meanSD of 3 experiments)
图 2 紫杉醇胶束在Skov-3/PTX细胞中的摄取
Fig 2 The effect of Pluronic P123 micelles on PTX uptake in Skov-3/PTX cell lines (Each point presented the meanSD of 3 experiments)
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结果显示，各浓度给药条件下，胶束组的Caco-2细胞摄取量均高于PTX溶液组，尤其是高浓度(25、50μg/mL)剂量条件，差异显著(P<0.01)。与阳性对照组环孢菌素(10 µM)相比，胶束组在低浓度剂量条件下的细胞摄取量略低，高浓度时摄取量略高，但均无显著性差异(P>0.05)。各浓度给药条件下，胶束组的Skov-3/PTX细胞摄取量均显著高于阴性对照组(P<0.05)，且随着PTX浓度的升高(载体浓度升高)，两者的差异也越大。胶束组除低浓度(5 μg/mL)之外的细胞摄取量均略高于阳性对照组，但均无显著性差异(P>0.05)。该结果表明Pluronic P123胶束可以显著增加PTX在Caco-2和Skov-3/PTX细胞中的摄取量，且作用具有浓度依赖性。
3.2 Rh-123胶束的细胞摄取
荧光显微镜观察Rh-123胶束在Caco-2细胞中的摄取情况见图3，在Skov-3/PTX细胞中的摄取情况见图4。
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(A) (B)
(C)
图3 Rh-123胶束在Caco-2细胞中的蓄积
Fig 3 Accumulation fluorescence microscopy of Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles in Caco-2 cells.(A)：5.0 μM Rh-123；(B)：5.0 μM Rh-123 and 10 μM CsA；(C)：Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles including 5.0 μM Rh-123 and 0.1%Pluronic P123
(A) (B)
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(C)
图4 Rh-123胶束在Skov-3/PTX细胞中的蓄积
Fig 4 Accumulation fluorescence microscopy of Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles in Skov-3/PTX cells.(A)：5.0 μM Rh-123；(B)：5.0 μM Rh-123 and 10 μM CsA；(C)：Rh-123 loaded Pluronic P123 micelles including 5.0 μM Rh-123 and 0.1%Pluronic P123
罗丹明123 (Rh-123)是P-gp的底物，Caco-2和Skov-3/PTX细胞对Rh-123均有交叉耐药性。由图3可知，阴性对照组Rh-123溶液在Caco-2细胞中摄取量极低，荧光显微镜下几乎观察不到红色荧光，而给予Rh-123的Pluronic P123胶束后，细胞内显现明显红色荧光，且荧光强度与阳性对照组相当。由图4可知，胶束制剂在Skov-3/PTX细胞中的摄取情况与Caco-2细胞中的相似。胶束组荧光强度与阳性对照组相当，远高于阴性对照组。以上结果表明，Pluronic P123胶束可以显著增加Rh-123在Caco-2和Skov-3/PTX细胞中的摄取量，即Pluronic P123胶束可逆转Caco-2和Skov-3/PTX细胞对Rh-123的交叉耐药性。
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3.3 PTX胶束的体外细胞毒研究
PTX胶束制剂对Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞的体外细胞毒研究结果见表2。
表 2 Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞对紫杉醇胶束的IC50值
Tab 2 IC50 of PTX-Pluronic P123 micelles in Caco-2、Skov-3 and Skov-3/PTX cells (n＝3)
Drug IC50(μg/mL)
Caco-2 Skov-3 Skov-3/PTX
PTX 22.19 0.33 15.15
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Taxol 13.53 0.30 7.4
PTX-Micelle 4.4 0.31 1.1
在预试验中，以0.1%空白胶束作用于两种细胞48 h，细胞生存率均高于80%，该结果说明胶束载体Pluronic P123对细胞的毒性较小，对本细胞毒实验影响较小。由上表结果可知，PTX-Pluronic P123胶束、Taxol和PTX对Skov-3的细胞毒性作用相似(P>0.05)，而对Skov-3/PTX，PTX胶束的细胞毒性作用较PTX和Taxol明显增强(P<0.05)。其在Skov-3/PTX细胞中相对于PTX的耐药逆转指数(RRI＝IC50 (PTX)/ IC50 (PTX-Micelle))为13.77，相对于Taxol的耐药逆转指数(RRI＝IC50 (Taxol)/ IC50 (PTX-Micelle))为6.73。即Pluronic P123 胶束可显著提高PTX对耐药细胞的细胞毒性，即Pluronic P123 胶束可以逆转Skov-3/PTX细胞对PTX的耐药性。
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3.3 细胞膜流动性的测定
考察不同浓度Pluronic P123对Skov-3/PTX细胞膜流动性的影响，结果见表3。
表3 Pluronic P123 胶束对DPH各向异性值的影响
Tab 3 Effect of Pluronic P123 micelles on anisotropy of DPH in Skov-3/PTX cells
Fluidity modulators DPH steady state anisotropy(r) Ratio of control %
1 2 3
-(Control) 0.2685 0.2609 0.2700 -
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Cholesterol(0.2 mM) 0.3601 0.3631 0.3385 132.8±5.0
Benzyl alcohol(30 mM) 0.2266 0.2187 0.2352 85.1±3.1
P123(0.001%) 0.2662 0.2603 0.2588 98.2±1.5
P123(0.01%) 0.2259 0.2353 0.2228 85.6±2.4
P123(0.1%) 0.2184 0.2170 0.2233 82.4±1.2
P123(1%) 0.2077 0.2027 0.1950 75.7±2.4
由上表可知，阳性对照胆固醇(0.2 mM) 能显著降低细胞膜脂质双层中亲脂区的流动性，DPH的各向异性值r显著增加(P<0.01)，为对照组的132.8%。阴性对照苯甲醇则可以显著增加细胞膜流动性，DPH的各向异性值r显著下降(P<0.01)，为对照组的85.1%。将载体Pluronic P123稀释成不同倍数后，对细胞膜流动性的影响大小不同。浓度为0.001%的载体几乎不改变DPH的各向异性值，对细胞膜流动性没有显著性影响；浓度为0.01%、0.1%和1%的载体均可以显著增加细胞膜流动性，且载体浓度越高，作用越强。
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3.4 耐药细胞MDR1、MRP和GST-π mRNA水平的测定
胶束制剂作用前后Skov-3/PTX 细胞的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平的RT-PCR测定结果见图5。
(A) (B)
(C)
图 5 RT-PCR测定MDR1、MRP、GST-π的表达
Fig 5 A 2% agarose gel electrophoresis showing the amplicons obtained after RT-PCR amplification. M: PCR Marker; 1: Skov-3; 2: Skov-3/PTX; 3: Skov-3/PTX (10µM CsA) ; 4: Skov-3/PTX (0.1%Pluronic P123 micelles). (A) MDR1; (B): MRP; (C): GST-π
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由上图可见，内参β-actin 各条带清晰，亮度较一致，故各目的条带的亮度强弱可以代表各目的基因的表达强弱。亲本细胞Skov-3上的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平均较低；耐药株Skov-3/PTX的耐药相关基因MDR1、MRP和GST-π均呈现高表达；阳性对照组给予10 μM CsA作用后，Skov-3/PTX的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平较空白耐药株明显减弱；而给予0.1%的Pluronic P123空白胶束溶液作用后，Skov-3/PTX的MDR1、MRP和GST-π mRNA水平较空白耐药株明显减弱，且较阳性对照组也有明显减弱。故Pluronic P123胶束可以抑制耐药肿瘤细胞的耐药相关基因MDR1、MRP和GST-π的水平。
3.5 荧光素-荧光素酶法测定耐药细胞ATP水平
不同浓度Pluronic P123胶束作用不同时间后 Skov-3/PTX细胞ATP水平测定结果见表4。
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表4 Pluronic P123胶束对Skov-3/PTX细胞ATP水平的影响
Tab 4 The influence of Pluronic P123 micelles on ATP levels of Skov-3/PTX cells
Concentration of carriers Ratio of control (%)
30min 60min 90min
0.01% 132.17±4.19 124.72±5.49 117.53±4.28
0.1% 88.81±2.55 85.69±2.31 83.23±8.92
1% 67.77±4.85 48.87±7.39 43.86±4.32
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由表4可知，作用相同时间，Pluronic P123载体浓度越高，Skov-3/PTX耐药细胞的ATP水平越低。同一浓度Pluronic P123在90min内，作用于细胞时间越长，耐药细胞的ATP水平越低。与不给予胶束作用的空白Skov-3/PTX细胞ATP水平进行比较，发现浓度为0.1%及1%的Pluronic P123可降低细胞的ATP水平，尤其是高浓度载体(1%)，对ATP的耗竭作用尤其显著(P<0.01)，且随作用时间延长ATP水平下降越多。而浓度为0.01%的胶束作用于耐药细胞后，ATP水平反而升高，但随着作用时间的延长，耐药细胞的ATP水平又出现下降趋势。该现象值得进一步探讨。
4 讨论
4.1 Caco-2及Skov-3/PTX细胞对PTX具有显著耐药性[9]，Pluronic P123胶束可以显著增加PTX在Caco-2及Skov-3/PTX细胞中的摄取量，且作用具有浓度依赖性，载体浓度越高，药物摄取量增加越多。Rh-123是膜外排蛋白P-gp的底物，Pluronic P123胶束制剂可以显著增加Rh-123在P-gp高表达的Caco-2及Skov-3/PTX细胞中的聚积量，其作用与P-gp底物CsA相当。故Pluronic P123胶束不但具有逆转Caco-2和Skov-3/PTX细胞对PTX的耐药作用，并且可以逆转对Rh-123的交叉耐药性。
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4.2 PTX胶束制剂对Caco-2、Skov-3和Skov-3/PTX细胞的体外细胞毒研究结果显示Pluronic P123 胶束可显著提高PTX对耐药细胞的细胞毒性。由于载体对细胞的毒性较小，我们认为Pluronic P123 胶束提高PTX对耐药细胞的细胞毒性主要原因在于其可以显著增加PTX在细胞中的蓄积量，故该结果进一步说明了Pluronic P123胶束具有逆转细胞耐药作用。
4.3 P-gp主要分布在细胞膜亲脂性区域，并且它的作用底物多为脂溶性药物[10]。Pluronic P123可以增加细胞膜亲脂性区域的流动性，不仅可以提高疏水性药物(如：Rh-123、紫杉醇)的细胞膜渗透性，并且可以抑制或减少P-gp对作用底物Rh-123、紫杉醇的外排作用，从而增加药物在耐药细胞中的蓄积。
4.4 肿瘤细胞产生多药耐药性的原因复杂，包括多药耐药基因(MDR1)的过度表达；多药耐药相关蛋白(MRP)的过度表达；谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽S转移酶(GST)活性增高；DNA修复功能增强；凋亡抗性增加；蛋白激酶C(PKC)活性增高等多种机制[11, 12]。其中MDR1的过度表达产生的P-gp对药物的外排作用是MDR的主要产生机制。故本文选择了耐药细胞的MDR1、MRP 和GST-π mRNA的水平作为指标，考察Pluronic P123胶束逆转肿瘤细胞耐药的机理。RT-PCR结果显示，Pluronic P123胶束(0.1% P123)可以降低Skov-3/PTX细胞的MDR1、MRP 和GST-π mRNA水平，其对MRP 和GST-π mRNA水平的抑制作用强于CsA。
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4.5 ATP 生物荧光反应原理是在有氧条件下，荧光酶和荧光素结合后催化ATP 转变成AMP , 并释放出光子(波长为562 nm) ，测定产生的荧光强度, 即可获得ATP 的含量[13]。Pluronic P123作用前后耐药细胞Skov-3/PTX 的ATP水平发生显著变化，浓度为0.1%及1%的Pluronic P123可降低细胞的ATP水平。P-gp对药物的外排作用是多药耐药产生的主要原因，P-gp将进入细胞内的药物“泵” 出时需消耗ATP，即具有能量依赖性[14]。故Pluronic P123可以通过耗竭耐药细胞的ATP水平来逆转细胞耐药作用。
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