采用高新技术 探索配伍规律 寻找活性物质——中药方剂现代研究的思路与方法
开展方剂的现代研究是中医药现代化研究的重要组成部分，对于继承和发展中医药理论，有效地指导临床和中药新产品创新研究具有重要意义。国家“十五”科技攻关项目及国家自然科学基金将方剂的研究列为重点项目，其招标指南中提出以若干个有效方剂为研究对象，构建适合复方中药作用特点的、科学客观的有效性评价方法与标准体系；通过对中药复方体内代谢过程的系统分析和研究，从多层次、多角度系统揭示复方疗效的客观性；同时，以药性理论与配伍理论阐释中药疗效的合理性，为中药复方研发提供科学依据。因此，探讨方剂药效物质基础及作用机理的研究以及药性理论与配伍理论的研究思路与方法，成为当今学术界注目的焦点。
近年来，方剂研究的方法主要包括化学研究、药效及量效关系研究、作用机理研究、毒性及安全性研究、拆方研究等等。其研究成果在一定程度上说明了方剂组成的合理性及中药配伍应用的优越性，在研究手段上，已逐渐采用新技术和新方法，并强调多学科、多方法的综合研究。但这些研究仍存在着很多问题，如研究过程中受中西医理论差异以及组方中药成分复杂性的限制，中医药缺乏对药效物质的微观分析和作用规律的科学阐释，缺乏规范评价方法和量化的指标，表现在内在质量的不可控及作用机理的不明确。因此到目前为止在揭示方剂的科学内涵方面仍然没有取得突破性进展。方剂的文献研究主要集中在传统理论回顾性、释理性的文献再整理研究。
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研究方剂，应遵循病证结合、方证关联、药与证对应、理法方药统一的整体研究思路，并充分利用现代化学和分子生物学理论与技术，在揭示药效物质基础变化与配伍、药效学间的内在联系研究基础上，进行药效物质差比构成与生物效应靶点反应特性的相关分析，以揭示复方配伍的科学内涵，从而构建创新中药理论基础和关键技术体系。
■方剂配伍规律及生物效应的研究
方剂研究的关键问题主要是配伍相关理论的研究。君臣佐使是方剂的组成原则，是方剂整体功效的结构基础。药对是相对固定的中药配伍形式，是方剂中最小的配伍单位，是研究方剂配伍重要的切入点之一。类方是药物组成上具有一定相似性方剂的集合，是在基本方的基础上派生而来。药性(包括四气五味、升降浮沉、归经等)是遣方用药的根本，对药性的选择取舍是治则治法的具体体现，是阐明君臣佐使关系的途径。因此，围绕方剂研究的关键问题，以建立方剂物质分离分析、生物效应综合评价的关键方法与创新技术为先导，以方剂药效物质基础及作用原理为突破口，以方剂的配伍、配比为研究重点，构建创新中药的理论基础和关键技术体系。方剂研究内容可包括：“君臣佐使”的配伍规律研究；类方的共性规律研究；药对的配伍机理研究；中药药性理论与方剂配伍规律研究。通过上述4个方面的研究，致力于探讨其配伍规律的深刻内涵。
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■方剂活性物质的基础研究
方剂的物质基础研究包含三个层次的化学成分研究，即复方、药材、有效部位和有效成分，可用生物效应指标追踪筛选。其主要过程为：选择目标方剂，核定标准处方并确定标准汤剂的药效，采用植物化学方法对全方化学成分进行系统提取、分离和鉴定，研究方剂的主要部位、组分、成分；以主要药效为指标建立多指标活性筛选体系对目标成分进行系统评估，筛选其有效和活性成分群，追踪分离目标活性成分并确定其化学结构，最终实现对方剂物质基础的确定。
有效部位群研究：通过对方剂整体成分的分割分离，以药效为指标追踪有效部位群。采用液相质普联用或气相质普联用、多种色谱仪器联用的方法，确定复方在血清中的成分谱，以原方的效应为指标，追踪血清中的有效组分，并研究其与原方效应的关系。
有效成分的研究：用高效液相-质谱联用(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)等技术进行有效部位群指纹图谱测定，确定有效成分的变化特征；利用最新研究手段，如超导二维核磁共振谱、软电离质谱等光谱技术与HPLC、HPCE、SFE等分离分析技术联合运用；研究建立有效成分分离、分析及结构鉴定等技术手段。
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活性成分的分离纯化技术研究：为解决目前提取分离方法工作量大、效率低、涪生成分易损失等问题，建立新技术在活性成分提取分离中的方法。主要研究内容包括：在精制中药成分研究的基础上，进一步开展应用研究；研究利用超临界提取与树脂吸附联用进行活性成分的提取分离。
■新技术在方剂研究中的应用
以桂枝茯苓方为例，探讨建立方剂中物质分离分析、生物效应综合评价的关键方法与创新技术。
桂枝茯苓方来源于汉代张仲景《金匮要略》，具有活血化瘀、通经止痛、缓消症块之功效，是历代医家治疗妇科疾病的常用方剂。因此开展对桂枝茯苓方的基础及应用研究有着广阔的市场前景和社会效益。桂枝茯苓方发挥治疗作用的物质基础是复杂的，可能是：方药经口服吸收入血，效应物质群及其化学成分作用于机体器官和病灶部位；经体内代谢产生的具有生物效应的修饰物和代谢产物；生物体受到药物作用后机体内部环境的变化、基因的功能改变以及生物体自身分泌物出现变化。
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开展桂枝茯苓方的作用机理研究包括：桂枝茯苓组方配伍之间相互作用的研究，以及不同提取溶剂对组分结构及性质的影响；桂枝茯苓方成分及其可能形成方剂复合物的三维结构，以及他们同各种受体的相互作用(多靶酶、多靶点的相互作用)，在此基础上探讨桂枝茯苓方的可能作用机理及副作用；通过溶剂环境下的桂枝茯苓方成分的计算机模拟研究探讨溶剂对桂枝茯苓方作用机理的影响，为提取工艺提供合理的方案；桂枝茯苓成分同MDR库中已知活性化合物的结构比对及相似性分析有助于探讨其作用机理；通过对桂枝茯苓方组分及其受体和靶点以及代谢物的结构分析，得出该方组成在体内可能的代谢途径和代谢产物，从而获得可能的药理参考资料。
利用细胞生物色谱仪可分析方剂血清中的活性成分。细胞膜固相色谱技术的基本原理是：药物效应的产生是由于药物分子与细胞内生物大分子(如受体)结合，激活了生物信号放大系统，能与细胞靶点结合的化学成分才有可能产生生物效应。应用子宫肌瘤细胞固相化色谱技术分析桂枝茯苓方，不同提取物及其活性组分与信号传导及细胞因子各效应之间的关系，阐明该方中5味中药之间的配伍规律。
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利用报告基因的方法探讨桂枝茯苓方的活性物质：现代医学认为子宫肌瘤是一种依赖于雌激素生长的肿瘤。过多雌激素可导致卵巢充血、胀大、子宫内膜增长过快等。在进入性成熟期后，残存于肌层的未分化间叶细胞和成熟的平滑肌细胞，在雌、孕激素周期作用下出现自身连续性增殖、分化及肥大过程，在长时间内反复进行，最后形成肿瘤。传统药理学的方法是给大鼠皮下注射雌激素诱发大鼠的乳腺增生，导致血清中雌激素的水平升高，由于造模周期较长，存在较大的个体差异，并与人类乳腺增生的病理生理过程不一致等缺点，难以用上述模型筛选或评价方剂不同配伍关系与疗效关系。
如桂枝(君)配伍不同的药物(臣、佐、使)，在血清中的化学成分不同，则表现出不同的生物效应。构建带有雌激素受体效应元件与荧光素酶基因(报告基因)的质粒，转染细胞，筛选稳定表达细胞系，因为雌激素能够进入细胞核，与核内受体作用，使受体结合到雌激素反应元件上，从而调控下游基因的表达，微量、高效地从桂枝茯苓方剂中筛选出可以调节雌激素基因表达的活性成分群，可以方便地检测血清中桂枝茯苓方药成分及方药配伍后成分的变化对细胞中雌激素基因的表达水平的影响。
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利用代谢组学研究桂枝茯苓方的作用机理及物质基础：应用代谢组学研究天然药物对机体内分泌系统的调节作用有其他方法无法比拟的优势，代谢组学关注的是各种代谢路径底物和产物的小分子代谢物，反映细胞或组织在外界刺激或是遗传修饰下代谢应答的变化，包括激素、糖、脂、氨基酸、维生素等。特别是基于NMR技术的研究方法，并不需要进行样品的提取、纯化，可以无损伤地监测组织代谢表达谱的改变，动态地评估代谢信息。并在此基础上，定位相应的靶组织、作用过程以及生物学标。
通过用代谢组学的方法对内分泌物质(如雌激素等)的变化进行分析，就能知道桂枝茯苓方对动物内分泌的影响(无论是直接的还是间接的)。可以采集器官组织的样品，应用质谱及核磁共振及放射性免疫技术检测其中内分泌物质的变化，对药物的作用进行定位。
■方剂信息资源挖掘与利用
南京中医药大学在编撰《方剂大辞典》、《中华本草》的基础上，开展方剂物质基础、药效和信息科学的相关性研究，建立方剂数据库，并在此基础上开始进行方剂数据挖掘研究。
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通过对方剂数据库数据特征、关系、聚类、趋向、偏差和特例现象的深层多维分析，揭示其间复杂和特殊的关系，发现其隐含的规则、模式和规律，为分析方剂配伍规律提供可靠数据。研究内容包括：以证为对象的方药配伍与应用规律；高频药组合规律以及与经验药对比较分析，揭示药物应用规律；类方的主治病证、方剂结构、配伍模式；由药量和剂型的变化所致的主治病证与原方迥异的变化规律；组方药物的药性分析，四气五味、归经、升降浮沉在方剂组成中的规律。将中医药学与现代药理学、药物化学、药剂学、生物信息学、数理统计学、计算机技术等相关学科有机结合才有可能突破，方剂的现代研究才能发展。因此，方剂配伍规律及其生物效应的研究；方剂活性物质基础研究；新技术在方剂研究中的应用；方剂信息资源挖掘与利用成为我们实验室的研究方向。实验室将瞄准方剂学研究发展前沿，运用现代生物技术等新技术、新方法努力构建方剂基础研究及应用开发研究的技术平台。
(段金廒 陆茵 陈建伟), 百拇医药(段金廒；陆茵；陈建伟)
近年来，方剂研究的方法主要包括化学研究、药效及量效关系研究、作用机理研究、毒性及安全性研究、拆方研究等等。其研究成果在一定程度上说明了方剂组成的合理性及中药配伍应用的优越性，在研究手段上，已逐渐采用新技术和新方法，并强调多学科、多方法的综合研究。但这些研究仍存在着很多问题，如研究过程中受中西医理论差异以及组方中药成分复杂性的限制，中医药缺乏对药效物质的微观分析和作用规律的科学阐释，缺乏规范评价方法和量化的指标，表现在内在质量的不可控及作用机理的不明确。因此到目前为止在揭示方剂的科学内涵方面仍然没有取得突破性进展。方剂的文献研究主要集中在传统理论回顾性、释理性的文献再整理研究。
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研究方剂，应遵循病证结合、方证关联、药与证对应、理法方药统一的整体研究思路，并充分利用现代化学和分子生物学理论与技术，在揭示药效物质基础变化与配伍、药效学间的内在联系研究基础上，进行药效物质差比构成与生物效应靶点反应特性的相关分析，以揭示复方配伍的科学内涵，从而构建创新中药理论基础和关键技术体系。
■方剂配伍规律及生物效应的研究
方剂研究的关键问题主要是配伍相关理论的研究。君臣佐使是方剂的组成原则，是方剂整体功效的结构基础。药对是相对固定的中药配伍形式，是方剂中最小的配伍单位，是研究方剂配伍重要的切入点之一。类方是药物组成上具有一定相似性方剂的集合，是在基本方的基础上派生而来。药性(包括四气五味、升降浮沉、归经等)是遣方用药的根本，对药性的选择取舍是治则治法的具体体现，是阐明君臣佐使关系的途径。因此，围绕方剂研究的关键问题，以建立方剂物质分离分析、生物效应综合评价的关键方法与创新技术为先导，以方剂药效物质基础及作用原理为突破口，以方剂的配伍、配比为研究重点，构建创新中药的理论基础和关键技术体系。方剂研究内容可包括：“君臣佐使”的配伍规律研究；类方的共性规律研究；药对的配伍机理研究；中药药性理论与方剂配伍规律研究。通过上述4个方面的研究，致力于探讨其配伍规律的深刻内涵。
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■方剂活性物质的基础研究
方剂的物质基础研究包含三个层次的化学成分研究，即复方、药材、有效部位和有效成分，可用生物效应指标追踪筛选。其主要过程为：选择目标方剂，核定标准处方并确定标准汤剂的药效，采用植物化学方法对全方化学成分进行系统提取、分离和鉴定，研究方剂的主要部位、组分、成分；以主要药效为指标建立多指标活性筛选体系对目标成分进行系统评估，筛选其有效和活性成分群，追踪分离目标活性成分并确定其化学结构，最终实现对方剂物质基础的确定。
有效部位群研究：通过对方剂整体成分的分割分离，以药效为指标追踪有效部位群。采用液相质普联用或气相质普联用、多种色谱仪器联用的方法，确定复方在血清中的成分谱，以原方的效应为指标，追踪血清中的有效组分，并研究其与原方效应的关系。
有效成分的研究：用高效液相-质谱联用(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)等技术进行有效部位群指纹图谱测定，确定有效成分的变化特征；利用最新研究手段，如超导二维核磁共振谱、软电离质谱等光谱技术与HPLC、HPCE、SFE等分离分析技术联合运用；研究建立有效成分分离、分析及结构鉴定等技术手段。
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活性成分的分离纯化技术研究：为解决目前提取分离方法工作量大、效率低、涪生成分易损失等问题，建立新技术在活性成分提取分离中的方法。主要研究内容包括：在精制中药成分研究的基础上，进一步开展应用研究；研究利用超临界提取与树脂吸附联用进行活性成分的提取分离。
■新技术在方剂研究中的应用
以桂枝茯苓方为例，探讨建立方剂中物质分离分析、生物效应综合评价的关键方法与创新技术。
桂枝茯苓方来源于汉代张仲景《金匮要略》，具有活血化瘀、通经止痛、缓消症块之功效，是历代医家治疗妇科疾病的常用方剂。因此开展对桂枝茯苓方的基础及应用研究有着广阔的市场前景和社会效益。桂枝茯苓方发挥治疗作用的物质基础是复杂的，可能是：方药经口服吸收入血，效应物质群及其化学成分作用于机体器官和病灶部位；经体内代谢产生的具有生物效应的修饰物和代谢产物；生物体受到药物作用后机体内部环境的变化、基因的功能改变以及生物体自身分泌物出现变化。
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开展桂枝茯苓方的作用机理研究包括：桂枝茯苓组方配伍之间相互作用的研究，以及不同提取溶剂对组分结构及性质的影响；桂枝茯苓方成分及其可能形成方剂复合物的三维结构，以及他们同各种受体的相互作用(多靶酶、多靶点的相互作用)，在此基础上探讨桂枝茯苓方的可能作用机理及副作用；通过溶剂环境下的桂枝茯苓方成分的计算机模拟研究探讨溶剂对桂枝茯苓方作用机理的影响，为提取工艺提供合理的方案；桂枝茯苓成分同MDR库中已知活性化合物的结构比对及相似性分析有助于探讨其作用机理；通过对桂枝茯苓方组分及其受体和靶点以及代谢物的结构分析，得出该方组成在体内可能的代谢途径和代谢产物，从而获得可能的药理参考资料。
利用细胞生物色谱仪可分析方剂血清中的活性成分。细胞膜固相色谱技术的基本原理是：药物效应的产生是由于药物分子与细胞内生物大分子(如受体)结合，激活了生物信号放大系统，能与细胞靶点结合的化学成分才有可能产生生物效应。应用子宫肌瘤细胞固相化色谱技术分析桂枝茯苓方，不同提取物及其活性组分与信号传导及细胞因子各效应之间的关系，阐明该方中5味中药之间的配伍规律。
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利用报告基因的方法探讨桂枝茯苓方的活性物质：现代医学认为子宫肌瘤是一种依赖于雌激素生长的肿瘤。过多雌激素可导致卵巢充血、胀大、子宫内膜增长过快等。在进入性成熟期后，残存于肌层的未分化间叶细胞和成熟的平滑肌细胞，在雌、孕激素周期作用下出现自身连续性增殖、分化及肥大过程，在长时间内反复进行，最后形成肿瘤。传统药理学的方法是给大鼠皮下注射雌激素诱发大鼠的乳腺增生，导致血清中雌激素的水平升高，由于造模周期较长，存在较大的个体差异，并与人类乳腺增生的病理生理过程不一致等缺点，难以用上述模型筛选或评价方剂不同配伍关系与疗效关系。
如桂枝(君)配伍不同的药物(臣、佐、使)，在血清中的化学成分不同，则表现出不同的生物效应。构建带有雌激素受体效应元件与荧光素酶基因(报告基因)的质粒，转染细胞，筛选稳定表达细胞系，因为雌激素能够进入细胞核，与核内受体作用，使受体结合到雌激素反应元件上，从而调控下游基因的表达，微量、高效地从桂枝茯苓方剂中筛选出可以调节雌激素基因表达的活性成分群，可以方便地检测血清中桂枝茯苓方药成分及方药配伍后成分的变化对细胞中雌激素基因的表达水平的影响。
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利用代谢组学研究桂枝茯苓方的作用机理及物质基础：应用代谢组学研究天然药物对机体内分泌系统的调节作用有其他方法无法比拟的优势，代谢组学关注的是各种代谢路径底物和产物的小分子代谢物，反映细胞或组织在外界刺激或是遗传修饰下代谢应答的变化，包括激素、糖、脂、氨基酸、维生素等。特别是基于NMR技术的研究方法，并不需要进行样品的提取、纯化，可以无损伤地监测组织代谢表达谱的改变，动态地评估代谢信息。并在此基础上，定位相应的靶组织、作用过程以及生物学标。
通过用代谢组学的方法对内分泌物质(如雌激素等)的变化进行分析，就能知道桂枝茯苓方对动物内分泌的影响(无论是直接的还是间接的)。可以采集器官组织的样品，应用质谱及核磁共振及放射性免疫技术检测其中内分泌物质的变化，对药物的作用进行定位。
■方剂信息资源挖掘与利用
南京中医药大学在编撰《方剂大辞典》、《中华本草》的基础上，开展方剂物质基础、药效和信息科学的相关性研究，建立方剂数据库，并在此基础上开始进行方剂数据挖掘研究。
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通过对方剂数据库数据特征、关系、聚类、趋向、偏差和特例现象的深层多维分析，揭示其间复杂和特殊的关系，发现其隐含的规则、模式和规律，为分析方剂配伍规律提供可靠数据。研究内容包括：以证为对象的方药配伍与应用规律；高频药组合规律以及与经验药对比较分析，揭示药物应用规律；类方的主治病证、方剂结构、配伍模式；由药量和剂型的变化所致的主治病证与原方迥异的变化规律；组方药物的药性分析，四气五味、归经、升降浮沉在方剂组成中的规律。将中医药学与现代药理学、药物化学、药剂学、生物信息学、数理统计学、计算机技术等相关学科有机结合才有可能突破，方剂的现代研究才能发展。因此，方剂配伍规律及其生物效应的研究；方剂活性物质基础研究；新技术在方剂研究中的应用；方剂信息资源挖掘与利用成为我们实验室的研究方向。实验室将瞄准方剂学研究发展前沿，运用现代生物技术等新技术、新方法努力构建方剂基础研究及应用开发研究的技术平台。
(段金廒 陆茵 陈建伟), 百拇医药(段金廒；陆茵；陈建伟)