二至丸对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞作用的活性组分构件研究
摘要：目的探讨二至丸免疫调节作用的活性组分构件。方法运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，观察女贞子、墨旱莲系列提取物及其组合物对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的作用。结果女贞子乙醇提取物、墨旱莲乙醇提取物、女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物(1∶1)具有较强的丝裂原样作用，可以促进小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能。结论二至丸对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞作用的活性组分构件是女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物(1∶1)。
关键词：二至丸； 中药复方组合化学； 血清药理学； 细胞药理学； 免疫调节； 活性组分构件
Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in Mice
YAO Gan，HE Zongyu
(College of Bioinformation, Chongqing University of Posts and Telecommunications, 400065,China)
Abstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.(LLA)or Eclipta prostrata L.(EPL) with different solvents such as water,alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions, blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC),the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (1∶1) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (1∶1).
Key words：Erzhi Pill; Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmacology; Immunoregulation; Active components
二至丸是中医临床的经典名方，《医便》(明·王三才)记载：“二至丸，清上补下第一方，价廉而功极大。”[1]它由女贞子、墨旱莲各等份组成，组方简单，药性平和，功效确切，作为补益肝肾良药。数百年来，倍受历代医家推崇。现代还用于衰老、神经衰弱、疲劳综合症及更年期综合症等疾病的治疗。中成药二至丸先后被历版《中国药典》(Ⅰ部)和“第二批国家非处方药目录”收载。一些学者相继从现代药理学角度对其进行了研究，证明二至丸对机体免疫功能具有多方面的调节作用，但研究中多以水煎剂、女贞子多糖及方中单味药提取物给药[2～5]。由于目前对其复方药效物质基础及作用机理还缺乏系统规范的研究，致使制剂工艺粗放，日用剂量过大[6]，剂型落后，不符合现代中药要求，影响了它的公众认知度。作者在遵从复方配伍规律的前提下，以活性评价为导向，运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，对其免疫调节作用的有效组分构件进行探讨，以期进一步组成精简方剂，从而为二至丸的二次开发和临床应用提供科学实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物普通级 KM种小鼠，8周龄，体重22～24 g，购于重庆市中药研究院实验动物研究室(许可证号：310101001)。
1.1.2 试剂RPMIl640培养液 (Gibco产品)、无酚红 RPMIl640培养液 (Sigma产品)，配制时加青霉素1×105 IU/L、链霉素100 mg/L，过滤，使用时加体积分数为15% 的胎牛血清(FBS，超级，杭州四季青生物工程材料研究所)。ConA(刀豆蛋白A)，Fluka产品；LPS(脂多糖)，Sigma产品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 μm过滤，分装，20℃冻存，临用前稀释。MTT(噻唑蓝)，Sigma产品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，过滤，4℃避光保存。硫代羟基乙酸钠 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所产品。其余试剂均为市售分析纯。
1.1.3 仪器Napco6lOO型CO2培养箱，美国。96孔板，Nunclon，丹麦。微量可调加样器，Labsystems，芬兰。多头细胞收集仪，ZTⅢ型，上海医科大学。550型酶标仪，BioRad，美国。恒温水浴摇床，Yamato，日本。
1.1.4 药物女贞子 Ligustrum lucidum Ait.(LLA)、墨旱莲 E clipta prostrata L.(EPL)，购于重庆市中药材公司，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部规定。
1.2 方法
1.2.1 女贞子、墨旱莲提取物的制备取女贞子或墨旱莲药材，粉碎，过20目筛，依次用不同溶剂，10倍量提取2次，2 h/次，过滤，合并提取液，回收溶剂，制备女贞子或墨旱莲的石油醚提取物(简称 NSYM或 HSYM)、醋酸乙酯提取物(简称 NYSYZ或 HYSYZ)、乙醇提取物(简称 NYC或 HYC)和水煎煮提取物(简称 NSJZ或 HSJZ)。临用前，分别用生理盐水(NS)制备药液，必要时可加少量 Tween80助溶，浓度相当于1 mg生药/ml。
1.2.2 含药血清的制备[7]小鼠按体重随机分组，每组10只，雌、雄各半。ig给药，给药2次，间隔2 h。ig容积10 ml/kg，空白血清组ig NS，各含药血清组 ig相应组分6.7 g生药 /kg(组合组分13.4 g生药 /kg)。末次给药1 h，深度麻醉，心脏无菌采血，3000 r/min离心10 min，收集血清。同组分血清混合，56℃水浴30 min，-20℃冻存，临用前4℃冻融。
1.2.3 细胞悬液的制备[8]小鼠腹腔注射3% TG溶液(2 ml/只)，72h后眼眶采血(肝素500 IU/ml抗凝)，随即脱颈椎处死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同时无菌取脾。常规方法制备细胞悬液，PBS液洗涤，离心，细胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培养液，调整浓度为2×106 cells/ml，台盼兰排除法检查细胞存活率大于95%。
1.2.4 淋巴细胞增殖(lymphocytes proliferation，LP)实验[9]96孔细胞培养板，各给药组每孔加入50μl淋巴细胞悬液、20 μl含药血清和120 μl RPMI164010%FBS培养液(对照组、刺激组分别用20 μl空白血清)，混匀后预孵1 h，再加入10 μl ConA或 LPS(终浓度为5 μg/ml)刺激(对照组用10 μl PBS)，各设8个复孔。5% CO2培养箱(Forma.USA)37℃培养48 h后，加入 MTT 10 μl/孔(10 mg/ml)培养8 h，弃上清，加入 DMSO 100 μl/孔，MTT结晶充分溶解后，酶标仪570 nm处测定A值。
1.2.5 腹腔巨噬细胞(PMф)吞噬活性实验[10]96孔细胞培养板，各给药组每孔加入50 μl腹腔巨噬细胞悬液、20 μl含药血清和120 μl无酚红 RPMI164010% FBS培养液(对照组用20 μl空白血清)，各设8个复孔。5% CO2培养箱(Forma.USA)37℃培养24 h，弃孔内培养基，加0.075%中性红溶液100 μl/孔，培养1 h，弃上清液，预温的 PBS液洗3遍，加入细胞溶解液(0.1 mol/L乙酸：无水乙醇)100 μl/孔，室温放置，过夜。次日，取上清液于酶标板中，酶标仪540 nm处测定A值。
1.2.6 统计学处理采用 SPSS11.0统计软件包。运用单向方差分析(OneWay ANOVA)，选用 Dunnett法进行组间显著性分析。实验数据以±s表示。
2 结果
2.1 女贞子或墨旱莲提取物对小鼠 LP和PMφ活性的影响结果见表1。
表1 女贞子或墨旱莲提取物对小鼠 LP和PMφ活性的影响(略)
与正常对照组比较，1)P<0.01，2) P<0.05；与刺激剂组比较，3) P<0.01，4) P<0.05；刺激剂指刀豆蛋白 A或脂多糖从表1可以看出，女贞子或墨旱莲提取物对 ConA或 LPS诱导的小鼠外周血和脾淋巴细胞增殖、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性均有较明显的促进作用。强度顺序依次为，NYC>NYSYZ>NSJZ>NSYM；HYC>HYSYZ>HSJZ>HSYM。提示，女贞子或墨旱莲促进小鼠LP和PMф活性作用最强的组分分别是 NYC或 HYC，即女贞子乙醇提取物或墨旱莲乙醇提取物。
表2 女贞子墨旱莲提取物组合对小鼠 LP和PMφ活性的影响(略)
与正常对照组比较，1) P<0.01，2) P<0.05；与刺激剂组比较，3) P<0.01，4) P<0.05；刺激剂指刀豆蛋白 A或脂多糖
2.2 女贞子墨旱莲提取物组合对小鼠 LP和 PMφ活性的影响结果见表2。从表2可以看出，女贞子墨旱莲不同提取物交叉组合后，对 ConA或 LPS诱导的小鼠外周血和脾淋巴细胞增殖、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性均有较明显的促进作用。强度顺序依次为 NYC+HYC>NYC+HYSYZ>HYC+NYSYZ>NYC+HSJZ>HYC+NSJZ>NYC+HSYM>HYC+NSYM。提示，二至丸(女贞子和墨旱莲的组合复方)促进小鼠LP和PMφ活性作用最强的组分构件是NYC+HYC，即女贞子乙醇提取物和墨旱莲乙醇提取物。
3 讨论
免疫功能低下常常与一些疾病的发生、发展密切相关，已经对人类社会构成了巨大威胁。对于疾病、衰老或治疗药物引起的免疫功能低下，现代惯用生物制剂，如胸腺素、转移因子、干扰素等，或化学制剂如左旋咪唑等，增强细胞免疫功能，但这些药物容易引起发热、呕吐、粒细胞减少及肝肾功能异常等不良反应，而中药在这方面具有独特的优势[11]。在人用疫苗佐剂相对缺乏、人们日益注重改善生命质量的今天，具有高活性免疫调节作用的中药有效成分被认为是理想的生物反应调节剂[12]。近年来通过临床或实验研究发现四君子汤、生脉散、六味地黄丸、当归补血汤、肾气丸等补益方剂有很强的免疫调节作用，二至丸在改善机体免疫功能方面疗效显著[13]。目前国内对六味地黄丸的药效物质基础及作用机理研究较为深入，相继研制成功了六味地黄口服液、胶囊、软胶囊及滴丸等新剂型，取得了巨大的经济效益和社会效益，而对二至丸的相关研究却极为薄弱。中药复方本身的分子多样性决定了其“有用分子”不明确，无用或诱发毒副作用的分子占绝大多数，从而表现出多成分、多途径、多靶点的作用特点，这在客观上增加了中药复方药效物质基础及作用机理研究的难度。目前，关于其方法学研究，观点和构思较多，如三元设计方案、霰弹理论、血清药理学及天然组合化学库与多靶作用机理等[14]，对于实际工作具有一定的启发和参考价值。作者在实际研究工作中发现，中药复方组合化学方法在中药复方活性成分群研究中具有明显的优势。该方法借鉴现代药学组合化学研究方法，选择能代表方剂主治病症病理生理和治则的药理学指标，通过组分或单体成分的组合，采用排除筛选法，找出其活性最强的组份构件，即确定“有用分子”组合的精简方剂[15]。它与直接测定成分法不同，既可充分体现中药复方多组分协同的特点，又可简化中药复方的分子多样性，符合中医药整体观和辩证分析的理论精髓。考虑到二至丸原方及其中成药均采用方中药味单独处理后再组合制剂的工艺路线，故本文运用中药复方组合化学方法进行活性部位研究。本研究结果表明，女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物(1∶1)是二至丸复方最强的免疫调节作用活性部位，能够协同LPS、ConA等有丝分裂原诱导的小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬细胞活性。提示这些组分均能激活T细胞及B细胞，具有丝裂原样作用，可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能。据此推测，女贞子、墨旱莲以水做溶媒提取活性成分可能提取不充分，故二至煎剂的药理作用还不能完全反映二至丸的药理作用，因此古代医家用二至丸而不用二至汤。随着对上述组分的进一步分离、纯化及其作用机理的阐明，获得由有效成分组成的精简方剂将成为现实，无疑会为现代中药的研究注入新的内容。
参考文献：
[1] 操红缨，梁颂名，荣向路，等.二至丸对阴虚模型神经内分泌免疫网络调节作用的研究[J].中药材，2000，23(2)：166.
[2] 段晓春.旱莲草的研究概况[J].中国临床医药实用杂志，2004，(12)：59.
[3] 李葆华.女贞子的研究状况[J].中华医学研究与实践，2004，2(7)：49.
[4] 李磷，丁安伟，孟丽.二至丸免疫调节作用活性部位的研究[J].中医药研究，2002；18(5)：42.
[5] 刘大基，刘解生，徐继勋，等.二至丸对小鼠淋巴细胞免疫功能的调节作用[J].湖北中医杂志，2002，24(2)：48 .
[6] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：293.
[7] 姚干，彭成，周东，等.大川芎方对神经细胞缺血性损伤的保护作用[M].中成药，2004，26(4)：315.
[8] 路景涛，杨雁，陈敏珠.黄芪多糖对细菌脂多糖诱导大鼠腹腔巨噬细胞释放TNFα、NO及IL1的影响[J].安徽医科大学学报，2004，39(2)：140.
[9] 徐建芬，陈学群，杜继曾.间断性低氧对大鼠淋巴细胞转化的影响[J].中国应用生理学杂志，2005，21(1)：5.
[10] 梁文杰，刘东青，单保恩，等.北豆根提取物对小鼠和人淋巴细胞及巨噬细胞作用的体外实验研究[J].中国免疫学杂志，2005，21(1)：56.
[11] 周丽娟，许利平.中药抗炎免疫药理免疫调节研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2004，10(1)：79.
[12] 祝 峥，胡云章，钱子刚.补益类中药有效成分作为新型人用疫苗佐剂的应用前景[J].生物技术通讯，2004，15(1)：92.
[13] 沈映君.中医药学高级丛书·中药药理学，第1版[M].北京：人民卫生出版社，2000：988.
[14] 谭 玮，宋崇顺，高 月.中药复方方法学研究进展[J].中国中西医结合杂志，2004，24(5)：458.
[15] 杨 奎，薄旭峰.中药复方组合化学研究方法初探[J].中药药理与临床，1998；14(3)：42.
基金项目：重庆邮电大学博士启动基金资助项目(No.A200551)
(重庆邮电学院生物信息学院，重庆 400065), http://www.100md.com(姚干， 何宗玉)
关键词：二至丸； 中药复方组合化学； 血清药理学； 细胞药理学； 免疫调节； 活性组分构件
Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in Mice
YAO Gan，HE Zongyu
(College of Bioinformation, Chongqing University of Posts and Telecommunications, 400065,China)
Abstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.(LLA)or Eclipta prostrata L.(EPL) with different solvents such as water,alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions, blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC),the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (1∶1) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (1∶1).
Key words：Erzhi Pill; Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmacology; Immunoregulation; Active components
二至丸是中医临床的经典名方，《医便》(明·王三才)记载：“二至丸，清上补下第一方，价廉而功极大。”[1]它由女贞子、墨旱莲各等份组成，组方简单，药性平和，功效确切，作为补益肝肾良药。数百年来，倍受历代医家推崇。现代还用于衰老、神经衰弱、疲劳综合症及更年期综合症等疾病的治疗。中成药二至丸先后被历版《中国药典》(Ⅰ部)和“第二批国家非处方药目录”收载。一些学者相继从现代药理学角度对其进行了研究，证明二至丸对机体免疫功能具有多方面的调节作用，但研究中多以水煎剂、女贞子多糖及方中单味药提取物给药[2～5]。由于目前对其复方药效物质基础及作用机理还缺乏系统规范的研究，致使制剂工艺粗放，日用剂量过大[6]，剂型落后，不符合现代中药要求，影响了它的公众认知度。作者在遵从复方配伍规律的前提下，以活性评价为导向，运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，对其免疫调节作用的有效组分构件进行探讨，以期进一步组成精简方剂，从而为二至丸的二次开发和临床应用提供科学实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物普通级 KM种小鼠，8周龄，体重22～24 g，购于重庆市中药研究院实验动物研究室(许可证号：310101001)。
1.1.2 试剂RPMIl640培养液 (Gibco产品)、无酚红 RPMIl640培养液 (Sigma产品)，配制时加青霉素1×105 IU/L、链霉素100 mg/L，过滤，使用时加体积分数为15% 的胎牛血清(FBS，超级，杭州四季青生物工程材料研究所)。ConA(刀豆蛋白A)，Fluka产品；LPS(脂多糖)，Sigma产品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 μm过滤，分装，20℃冻存，临用前稀释。MTT(噻唑蓝)，Sigma产品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，过滤，4℃避光保存。硫代羟基乙酸钠 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所产品。其余试剂均为市售分析纯。
1.1.3 仪器Napco6lOO型CO2培养箱，美国。96孔板，Nunclon，丹麦。微量可调加样器，Labsystems，芬兰。多头细胞收集仪，ZTⅢ型，上海医科大学。550型酶标仪，BioRad，美国。恒温水浴摇床，Yamato，日本。
1.1.4 药物女贞子 Ligustrum lucidum Ait.(LLA)、墨旱莲 E clipta prostrata L.(EPL)，购于重庆市中药材公司，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部规定。
1.2 方法
1.2.1 女贞子、墨旱莲提取物的制备取女贞子或墨旱莲药材，粉碎，过20目筛，依次用不同溶剂，10倍量提取2次，2 h/次，过滤，合并提取液，回收溶剂，制备女贞子或墨旱莲的石油醚提取物(简称 NSYM或 HSYM)、醋酸乙酯提取物(简称 NYSYZ或 HYSYZ)、乙醇提取物(简称 NYC或 HYC)和水煎煮提取物(简称 NSJZ或 HSJZ)。临用前，分别用生理盐水(NS)制备药液，必要时可加少量 Tween80助溶，浓度相当于1 mg生药/ml。
1.2.2 含药血清的制备[7]小鼠按体重随机分组，每组10只，雌、雄各半。ig给药，给药2次，间隔2 h。ig容积10 ml/kg，空白血清组ig NS，各含药血清组 ig相应组分6.7 g生药 /kg(组合组分13.4 g生药 /kg)。末次给药1 h，深度麻醉，心脏无菌采血，3000 r/min离心10 min，收集血清。同组分血清混合，56℃水浴30 min，-20℃冻存，临用前4℃冻融。
1.2.3 细胞悬液的制备[8]小鼠腹腔注射3% TG溶液(2 ml/只)，72h后眼眶采血(肝素500 IU/ml抗凝)，随即脱颈椎处死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同时无菌取脾。常规方法制备细胞悬液，PBS液洗涤，离心，细胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培养液，调整浓度为2×106 cells/ml，台盼兰排除法检查细胞存活率大于95%。
1.2.4 淋巴细胞增殖(lymphocytes proliferation，LP)实验[9]96孔细胞培养板，各给药组每孔加入50μl淋巴细胞悬液、20 μl含药血清和120 μl RPMI164010%FBS培养液(对照组、刺激组分别用20 μl空白血清)，混匀后预孵1 h，再加入10 μl ConA或 LPS(终浓度为5 μg/ml)刺激(对照组用10 μl PBS)，各设8个复孔。5% CO2培养箱(Forma.USA)37℃培养48 h后，加入 MTT 10 μl/孔(10 mg/ml)培养8 h，弃上清，加入 DMSO 100 μl/孔，MTT结晶充分溶解后，酶标仪570 nm处测定A值。
1.2.5 腹腔巨噬细胞(PMф)吞噬活性实验[10]96孔细胞培养板，各给药组每孔加入50 μl腹腔巨噬细胞悬液、20 μl含药血清和120 μl无酚红 RPMI164010% FBS培养液(对照组用20 μl空白血清)，各设8个复孔。5% CO2培养箱(Forma.USA)37℃培养24 h，弃孔内培养基，加0.075%中性红溶液100 μl/孔，培养1 h，弃上清液，预温的 PBS液洗3遍，加入细胞溶解液(0.1 mol/L乙酸：无水乙醇)100 μl/孔，室温放置，过夜。次日，取上清液于酶标板中，酶标仪540 nm处测定A值。
1.2.6 统计学处理采用 SPSS11.0统计软件包。运用单向方差分析(OneWay ANOVA)，选用 Dunnett法进行组间显著性分析。实验数据以±s表示。
2 结果
2.1 女贞子或墨旱莲提取物对小鼠 LP和PMφ活性的影响结果见表1。
表1 女贞子或墨旱莲提取物对小鼠 LP和PMφ活性的影响(略)
与正常对照组比较，1)P<0.01，2) P<0.05；与刺激剂组比较，3) P<0.01，4) P<0.05；刺激剂指刀豆蛋白 A或脂多糖从表1可以看出，女贞子或墨旱莲提取物对 ConA或 LPS诱导的小鼠外周血和脾淋巴细胞增殖、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性均有较明显的促进作用。强度顺序依次为，NYC>NYSYZ>NSJZ>NSYM；HYC>HYSYZ>HSJZ>HSYM。提示，女贞子或墨旱莲促进小鼠LP和PMф活性作用最强的组分分别是 NYC或 HYC，即女贞子乙醇提取物或墨旱莲乙醇提取物。
表2 女贞子墨旱莲提取物组合对小鼠 LP和PMφ活性的影响(略)
与正常对照组比较，1) P<0.01，2) P<0.05；与刺激剂组比较，3) P<0.01，4) P<0.05；刺激剂指刀豆蛋白 A或脂多糖
2.2 女贞子墨旱莲提取物组合对小鼠 LP和 PMφ活性的影响结果见表2。从表2可以看出，女贞子墨旱莲不同提取物交叉组合后，对 ConA或 LPS诱导的小鼠外周血和脾淋巴细胞增殖、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性均有较明显的促进作用。强度顺序依次为 NYC+HYC>NYC+HYSYZ>HYC+NYSYZ>NYC+HSJZ>HYC+NSJZ>NYC+HSYM>HYC+NSYM。提示，二至丸(女贞子和墨旱莲的组合复方)促进小鼠LP和PMφ活性作用最强的组分构件是NYC+HYC，即女贞子乙醇提取物和墨旱莲乙醇提取物。
3 讨论
免疫功能低下常常与一些疾病的发生、发展密切相关，已经对人类社会构成了巨大威胁。对于疾病、衰老或治疗药物引起的免疫功能低下，现代惯用生物制剂，如胸腺素、转移因子、干扰素等，或化学制剂如左旋咪唑等，增强细胞免疫功能，但这些药物容易引起发热、呕吐、粒细胞减少及肝肾功能异常等不良反应，而中药在这方面具有独特的优势[11]。在人用疫苗佐剂相对缺乏、人们日益注重改善生命质量的今天，具有高活性免疫调节作用的中药有效成分被认为是理想的生物反应调节剂[12]。近年来通过临床或实验研究发现四君子汤、生脉散、六味地黄丸、当归补血汤、肾气丸等补益方剂有很强的免疫调节作用，二至丸在改善机体免疫功能方面疗效显著[13]。目前国内对六味地黄丸的药效物质基础及作用机理研究较为深入，相继研制成功了六味地黄口服液、胶囊、软胶囊及滴丸等新剂型，取得了巨大的经济效益和社会效益，而对二至丸的相关研究却极为薄弱。中药复方本身的分子多样性决定了其“有用分子”不明确，无用或诱发毒副作用的分子占绝大多数，从而表现出多成分、多途径、多靶点的作用特点，这在客观上增加了中药复方药效物质基础及作用机理研究的难度。目前，关于其方法学研究，观点和构思较多，如三元设计方案、霰弹理论、血清药理学及天然组合化学库与多靶作用机理等[14]，对于实际工作具有一定的启发和参考价值。作者在实际研究工作中发现，中药复方组合化学方法在中药复方活性成分群研究中具有明显的优势。该方法借鉴现代药学组合化学研究方法，选择能代表方剂主治病症病理生理和治则的药理学指标，通过组分或单体成分的组合，采用排除筛选法，找出其活性最强的组份构件，即确定“有用分子”组合的精简方剂[15]。它与直接测定成分法不同，既可充分体现中药复方多组分协同的特点，又可简化中药复方的分子多样性，符合中医药整体观和辩证分析的理论精髓。考虑到二至丸原方及其中成药均采用方中药味单独处理后再组合制剂的工艺路线，故本文运用中药复方组合化学方法进行活性部位研究。本研究结果表明，女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物(1∶1)是二至丸复方最强的免疫调节作用活性部位，能够协同LPS、ConA等有丝分裂原诱导的小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬细胞活性。提示这些组分均能激活T细胞及B细胞，具有丝裂原样作用，可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能。据此推测，女贞子、墨旱莲以水做溶媒提取活性成分可能提取不充分，故二至煎剂的药理作用还不能完全反映二至丸的药理作用，因此古代医家用二至丸而不用二至汤。随着对上述组分的进一步分离、纯化及其作用机理的阐明，获得由有效成分组成的精简方剂将成为现实，无疑会为现代中药的研究注入新的内容。
参考文献：
[1] 操红缨，梁颂名，荣向路，等.二至丸对阴虚模型神经内分泌免疫网络调节作用的研究[J].中药材，2000，23(2)：166.
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基金项目：重庆邮电大学博士启动基金资助项目(No.A200551)
(重庆邮电学院生物信息学院，重庆 400065), http://www.100md.com(姚干， 何宗玉)