调肝颗粒剂抗免疫性肝损伤的实验研究
摘要：目的观察调肝颗粒剂对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝损伤模型的保护作用，并探讨其作用机制。方法BCG(1×104个活菌)静脉注射致敏小鼠，12 d后静脉给LPS(6μg/只)攻击造成小鼠免疫性肝损伤，4 h后取血和肝脏，测血清AST和ALT并观察肝脏病理变化；乙酰氨基酚腹腔注射(500 mg/kg)致肝损伤，2.5 h后处死小鼠测血清GSH和肝脏MDA。结果给BCG的同时给调肝颗粒剂(20 g/kg)能显著的减轻BCG和LPS所造成的免疫性肝损伤小鼠ALT，AST的升高，减轻肝细胞坏死，促进枯否氏细胞增生，促进肝细胞增生；并能显著减轻对乙酰氨基酚致肝损伤引起的GSH降低，同时减少肝脂质过氧化物生成。结论 调肝颗粒剂对BCG加LPS致小鼠免疫性肝损伤有显著的保护作用，这可能与它增加机体的抗氧化能力有关。
关键词：中药； 中药药理； 免疫性肝损伤； 保肝
Protective Effects of Tiaogan Granules on Immunologic Liver Injury in Mice
CHEN Xin， ZHAO Hui， ZHANG Nan ， MU Yang， ZHANG Qiuyun
(Traditional Chinese Medical College, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100013,China)
Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of Tiaogan Granules on immunologic liver injury model. Methods(1) The liver injury model was induced by LPS intravenous injection in 12 days BCG interval, the mice were executed after 4h. the content of ALT and AST in serum were measured. (2) The other model was induced by paracetand ip 500 mg/kg, the mice were executed after 2.5h, the content of GSH and MDA in serum were measured. ResultsTiaogan granules were affused (dose20g/kg) for the mice when BCG were injected by intravenous at the same time. The increase of ALT and AST were reduced by intervention of Tiaogan granules and putrescence of hepatic cell were reduced too, but hepatic were hyperplasia and hepatic cells were improved. The decrease of GSH and the increase of MDA on the mice injected paracetamol were reduced by intervention of the Tiaogan granules.ConclusionThe protective effects of Tiaogan granules were confirmed on immunologic liver injury model. It was likely to be related to the enhancement of capability on resisted stress of oxidation of it.
Key words：Traditional Chinese Medicine; Parmacology of Traditional Chinese Medicine; Immunologic Liver Injury; Protective Effects on Liver Injury
调肝颗粒剂是肝病治疗专家、中华中医药学会内科肝病专业主任委员钱英教授沿用多年治疗乙型和甲、丙型肝炎的经验方。全方由槲寄生、黄芪等8味药组成，清热祛湿、疏肝利胆、补气养阴、活血通络。为阐述该方的保肝作用及作用机理，我们观察了调肝颗粒剂对小鼠免疫性肝损伤和化学性肝损伤的影响。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料ICR雄性小鼠体重25～30 g，由首都医科大学实验动物中心提供。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒，北京中生北控生物科技股份有限公司产品。谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。卡介苗(BCG)北京天坛生物制品研究所产品，批号20030704，脂多糖(LPS)，美国Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠免疫性肝损伤模型制备参照文献[1]并做适当修改，ICR雄性小鼠25～30 g，每鼠尾静脉注射BCG 0.2 ml(1×104个活菌)后正常饲养12 d，再经尾静脉注射LPS(6μg/只)攻击，以诱导肝损伤，于4 h后眼眶取血，血浆离心(3 500 r/min)10 min，血清测AST和ALT；同时取肝用10%甲醛固定，制作石蜡切片做病理检查。
1.2.2 乙酰氨基酚肝损伤模型制备参照文献[2]ICR小鼠腹腔注射乙酰氨基酚500 mg/kg，2.5 h后断颈放血处死，取肝脏测定GSH和MDA含量。
1.2.3 给药方法调肝颗粒剂槲寄生、黄芪等8味药均为北京市药材公司市售饮片，制成100%的水煎剂冰箱保存备用。ICR雄性小鼠25 ～30 g共24只，随机分为免疫性肝损伤模型组、损伤加调肝颗粒组和对照组，每组8只；调肝颗粒剂组于给BCG同时开始口服灌胃调肝颗粒剂100%水煎剂20 g生药/kg，直至给LPS攻击当日，对照组同时给予生理盐水。另取ICR小鼠雌雄各半，20～25 g 共24只，随机分为乙酰氨基酚肝损伤组，损伤加调肝颗粒剂组和对照组，每组8只，调肝颗粒剂组给100%调肝颗粒剂水煎剂20 g生药/kg。7 d后，给乙酰氨基酚造成肝损伤。对照组同时给予生理盐水。
2 结果
2.1 调肝颗粒剂对免疫性肝损伤的影响 结果见表1。
表1 调肝颗粒剂对免疫性肝损伤小鼠血清AST，ALT的影响(略)
与正常组比较，#P<0.001；与模型组比较，*P<0.001；n＝8表1结果显示，调肝颗粒剂对BCG加LPS造成的小鼠免疫性肝损伤有显著的保护作用。能极显著地减少ALT和AST的升高。病理观察的结果见图1～3。
图1 正常小鼠肝组织病理切片(20×)(略)
图2 BCG加LPS致小鼠免疫性肝损伤模型组肝组织病理切片(20×)(略)
图3 BCG加LPS致小鼠免疫性肝损伤调肝颗粒剂组肝组织病理切片(20×)(略)
免疫性肝损伤模型组小鼠肝组织切片见肝细胞内大量点状坏死及灶性坏死，伴有较多淋巴细胞浸润，未见纤维组织增生及淤胆现象，给调肝颗粒剂组小鼠肝组织切片见肝组织结构正常，肝细胞点状及灶性坏死较模型组轻，肝窦枯否细胞增生明显，并见肝细胞增生。
2.2 调肝颗粒剂对乙酰氨基酚肝损伤的影响结果见表2。
表2 调肝颗粒剂对乙酰氨基酚肝损伤小鼠肝GSH和MDA的影响(略)
与正常组比较#P<0.05； 与正常组比较## P<0.01；，与模型组比较*P<0.05； 与模型组比较**P<0.01；n＝8
表2结果显示调肝颗粒剂对乙酰氨基酚造成的急性肝损伤GSH降低有显著的保护作用并能减轻肝脂质过氧化损伤。
3 讨论
BCG 和LPS诱导小鼠的免疫性肝损伤模型与四氯化碳等化学性肝损伤模型比较在病生理机制上更接近人类的肝炎。此种模型病理组织学特点主要为灶性肝细胞坏死，汇管区周围大量炎细胞浸润，其发病机理可能为：单核细胞或巨噬细胞在致炎因子的作用下，向肝脏积聚并被致敏，这些致敏的巨噬细胞在接触LPS后释放毒性物质，如白三烯、TNF，IL1和NO等，NO本身作为自由基，可与O2反应生成超氧亚硝基阴离子以及其他自由基引起脂质过氧化，[3]最终导致肝组织严重的过氧化损伤。也有报道认为其发病机制可能与肝脏内的枯否氏细胞以及游入肝组织的炎性细胞功能状态密切相关。[4]BCG通过激活枯否氏细胞，使之成为活化的巨噬细胞，引起肝内枯否氏细胞的增生和浸润，在此基础上，LPS可激活枯否氏细胞分泌释放众多的生物效应分子，从而造成肝脏炎症坏死等一系列损伤效应。[5]在造模的预试验中，BCG致敏后10 d用LPS攻击，10 h取血和肝脏，动物在这10 h内的死亡率甚高，勉强存活的动物ALT和LST极高，且病理观察见肝损伤严重。观察发现LPS攻击后4 h取材，动物的ALT，AST和肝脏病理已经出现显著的改变，遂将文献方法[1]进行了修改。本实验结果显示调肝颗粒剂与致肝损伤抗原BCG同时给予动物，可显著地减轻免疫性肝损伤小鼠ALT与AST的升高；病理观察也显示调肝颗粒剂可促进肝枯否氏细胞增生，减轻肝细胞的坏死，促进肝细胞的增生，促进修复。这些结果为该方的临床疗效提供了保肝降酶的药理学依据。进一步的研究还显示调肝颗粒剂能减轻乙酰氨基酚致肝损伤引起的GSH降低，并能减轻肝脂质过氧化损伤。以往的实验研究显示调肝颗粒剂在二乙酰氨基芴(2AAF)加上肝大部分切除造成肝癌前病变模型上能显著降低肝及血浆MDA，升高SOD和GSHpx含量。[6]这些结果说明调肝颗粒剂增加体内强还原物质GSH的量，提高抗氧化酶活性，有较强的清除自由基作用。这可能是其保肝降酶作用的重要机理之一。
参考文献：
[1] 徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2003：1348.
[2] 陈重阳，唐祖年，梁荣感.青蒿琥酯对正常及肝脏毒物中毒小鼠肝脏谷胱甘肽含量的影响[J].中国药理学通报，1993，9(1)52.
[3] 王根生，刘耕陶.一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用[J].中华医学杂志，1996，76(3)：203.
[4] 王根生，刘耕陶. 枯否氏细胞与肝细胞损伤[J].中国药理学通报，1994，10(5)：330.
[5] 项瑞望，李 颖，张 春，等.卡介苗和脂多糖致小鼠免疫性肝损伤时血清GST的变化规律[J].武汉大学学报，2002，23(4)：330.
[6] 王学江，丰 平，文朝阳，等. 调肝颗粒剂阻断肝癌前病变的机理研究[C].全国第十一届中医肝胆病学术会论文集，2004：5.
(首都医科大学中医药学院，北京 100013), http://www.100md.com(陈忻， 赵晖， 张楠， 穆阳， 张秋云)
关键词：中药； 中药药理； 免疫性肝损伤； 保肝
Protective Effects of Tiaogan Granules on Immunologic Liver Injury in Mice
CHEN Xin， ZHAO Hui， ZHANG Nan ， MU Yang， ZHANG Qiuyun
(Traditional Chinese Medical College, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100013,China)
Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of Tiaogan Granules on immunologic liver injury model. Methods(1) The liver injury model was induced by LPS intravenous injection in 12 days BCG interval, the mice were executed after 4h. the content of ALT and AST in serum were measured. (2) The other model was induced by paracetand ip 500 mg/kg, the mice were executed after 2.5h, the content of GSH and MDA in serum were measured. ResultsTiaogan granules were affused (dose20g/kg) for the mice when BCG were injected by intravenous at the same time. The increase of ALT and AST were reduced by intervention of Tiaogan granules and putrescence of hepatic cell were reduced too, but hepatic were hyperplasia and hepatic cells were improved. The decrease of GSH and the increase of MDA on the mice injected paracetamol were reduced by intervention of the Tiaogan granules.ConclusionThe protective effects of Tiaogan granules were confirmed on immunologic liver injury model. It was likely to be related to the enhancement of capability on resisted stress of oxidation of it.
Key words：Traditional Chinese Medicine; Parmacology of Traditional Chinese Medicine; Immunologic Liver Injury; Protective Effects on Liver Injury
调肝颗粒剂是肝病治疗专家、中华中医药学会内科肝病专业主任委员钱英教授沿用多年治疗乙型和甲、丙型肝炎的经验方。全方由槲寄生、黄芪等8味药组成，清热祛湿、疏肝利胆、补气养阴、活血通络。为阐述该方的保肝作用及作用机理，我们观察了调肝颗粒剂对小鼠免疫性肝损伤和化学性肝损伤的影响。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料ICR雄性小鼠体重25～30 g，由首都医科大学实验动物中心提供。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒，北京中生北控生物科技股份有限公司产品。谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。卡介苗(BCG)北京天坛生物制品研究所产品，批号20030704，脂多糖(LPS)，美国Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠免疫性肝损伤模型制备参照文献[1]并做适当修改，ICR雄性小鼠25～30 g，每鼠尾静脉注射BCG 0.2 ml(1×104个活菌)后正常饲养12 d，再经尾静脉注射LPS(6μg/只)攻击，以诱导肝损伤，于4 h后眼眶取血，血浆离心(3 500 r/min)10 min，血清测AST和ALT；同时取肝用10%甲醛固定，制作石蜡切片做病理检查。
1.2.2 乙酰氨基酚肝损伤模型制备参照文献[2]ICR小鼠腹腔注射乙酰氨基酚500 mg/kg，2.5 h后断颈放血处死，取肝脏测定GSH和MDA含量。
1.2.3 给药方法调肝颗粒剂槲寄生、黄芪等8味药均为北京市药材公司市售饮片，制成100%的水煎剂冰箱保存备用。ICR雄性小鼠25 ～30 g共24只，随机分为免疫性肝损伤模型组、损伤加调肝颗粒组和对照组，每组8只；调肝颗粒剂组于给BCG同时开始口服灌胃调肝颗粒剂100%水煎剂20 g生药/kg，直至给LPS攻击当日，对照组同时给予生理盐水。另取ICR小鼠雌雄各半，20～25 g 共24只，随机分为乙酰氨基酚肝损伤组，损伤加调肝颗粒剂组和对照组，每组8只，调肝颗粒剂组给100%调肝颗粒剂水煎剂20 g生药/kg。7 d后，给乙酰氨基酚造成肝损伤。对照组同时给予生理盐水。
2 结果
2.1 调肝颗粒剂对免疫性肝损伤的影响 结果见表1。
表1 调肝颗粒剂对免疫性肝损伤小鼠血清AST，ALT的影响(略)
与正常组比较，#P<0.001；与模型组比较，*P<0.001；n＝8表1结果显示，调肝颗粒剂对BCG加LPS造成的小鼠免疫性肝损伤有显著的保护作用。能极显著地减少ALT和AST的升高。病理观察的结果见图1～3。
图1 正常小鼠肝组织病理切片(20×)(略)
图2 BCG加LPS致小鼠免疫性肝损伤模型组肝组织病理切片(20×)(略)
图3 BCG加LPS致小鼠免疫性肝损伤调肝颗粒剂组肝组织病理切片(20×)(略)
免疫性肝损伤模型组小鼠肝组织切片见肝细胞内大量点状坏死及灶性坏死，伴有较多淋巴细胞浸润，未见纤维组织增生及淤胆现象，给调肝颗粒剂组小鼠肝组织切片见肝组织结构正常，肝细胞点状及灶性坏死较模型组轻，肝窦枯否细胞增生明显，并见肝细胞增生。
2.2 调肝颗粒剂对乙酰氨基酚肝损伤的影响结果见表2。
表2 调肝颗粒剂对乙酰氨基酚肝损伤小鼠肝GSH和MDA的影响(略)
与正常组比较#P<0.05； 与正常组比较## P<0.01；，与模型组比较*P<0.05； 与模型组比较**P<0.01；n＝8
表2结果显示调肝颗粒剂对乙酰氨基酚造成的急性肝损伤GSH降低有显著的保护作用并能减轻肝脂质过氧化损伤。
3 讨论
BCG 和LPS诱导小鼠的免疫性肝损伤模型与四氯化碳等化学性肝损伤模型比较在病生理机制上更接近人类的肝炎。此种模型病理组织学特点主要为灶性肝细胞坏死，汇管区周围大量炎细胞浸润，其发病机理可能为：单核细胞或巨噬细胞在致炎因子的作用下，向肝脏积聚并被致敏，这些致敏的巨噬细胞在接触LPS后释放毒性物质，如白三烯、TNF，IL1和NO等，NO本身作为自由基，可与O2反应生成超氧亚硝基阴离子以及其他自由基引起脂质过氧化，[3]最终导致肝组织严重的过氧化损伤。也有报道认为其发病机制可能与肝脏内的枯否氏细胞以及游入肝组织的炎性细胞功能状态密切相关。[4]BCG通过激活枯否氏细胞，使之成为活化的巨噬细胞，引起肝内枯否氏细胞的增生和浸润，在此基础上，LPS可激活枯否氏细胞分泌释放众多的生物效应分子，从而造成肝脏炎症坏死等一系列损伤效应。[5]在造模的预试验中，BCG致敏后10 d用LPS攻击，10 h取血和肝脏，动物在这10 h内的死亡率甚高，勉强存活的动物ALT和LST极高，且病理观察见肝损伤严重。观察发现LPS攻击后4 h取材，动物的ALT，AST和肝脏病理已经出现显著的改变，遂将文献方法[1]进行了修改。本实验结果显示调肝颗粒剂与致肝损伤抗原BCG同时给予动物，可显著地减轻免疫性肝损伤小鼠ALT与AST的升高；病理观察也显示调肝颗粒剂可促进肝枯否氏细胞增生，减轻肝细胞的坏死，促进肝细胞的增生，促进修复。这些结果为该方的临床疗效提供了保肝降酶的药理学依据。进一步的研究还显示调肝颗粒剂能减轻乙酰氨基酚致肝损伤引起的GSH降低，并能减轻肝脂质过氧化损伤。以往的实验研究显示调肝颗粒剂在二乙酰氨基芴(2AAF)加上肝大部分切除造成肝癌前病变模型上能显著降低肝及血浆MDA，升高SOD和GSHpx含量。[6]这些结果说明调肝颗粒剂增加体内强还原物质GSH的量，提高抗氧化酶活性，有较强的清除自由基作用。这可能是其保肝降酶作用的重要机理之一。
参考文献：
[1] 徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2003：1348.
[2] 陈重阳，唐祖年，梁荣感.青蒿琥酯对正常及肝脏毒物中毒小鼠肝脏谷胱甘肽含量的影响[J].中国药理学通报，1993，9(1)52.
[3] 王根生，刘耕陶.一氧化氮在小鼠肝损伤中的作用[J].中华医学杂志，1996，76(3)：203.
[4] 王根生，刘耕陶. 枯否氏细胞与肝细胞损伤[J].中国药理学通报，1994，10(5)：330.
[5] 项瑞望，李 颖，张 春，等.卡介苗和脂多糖致小鼠免疫性肝损伤时血清GST的变化规律[J].武汉大学学报，2002，23(4)：330.
[6] 王学江，丰 平，文朝阳，等. 调肝颗粒剂阻断肝癌前病变的机理研究[C].全国第十一届中医肝胆病学术会论文集，2004：5.
(首都医科大学中医药学院，北京 100013), http://www.100md.com(陈忻， 赵晖， 张楠， 穆阳， 张秋云)