氯氨酮对大鼠心肌缺血再灌注心肌细胞凋亡和Fas蛋白、Bcl2蛋白表达的影响
摘 要： 目的：探讨氯胺酮作用下大鼠实验性心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与Fas 及Bcl2蛋白表达的变化及与心肌组织损伤的关系，并分析心肌组织病理学损伤程度。方法：以穿线结扎或松扎左冠状动脉制备大鼠心肌缺血再灌注模型。32 只大鼠随机分成假手术组(假手术4.5 h) 、缺血再灌注组(缺血30min、再灌注4 h) 、低剂量氯胺酮+缺血再灌注组(缺血30min、再灌注4h) 及高剂量氯胺酮+缺血再灌注组(缺血30min、再灌注个4 h) 。以缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡的变化,SP 免疫组化法分别检测Fas 与Bcl2蛋白水平变化，做病理组织切片检查心肌损伤情况。 结果：心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数及Fas 蛋白阳性染色指数与Bcl2 蛋白阳性染色指数均增加, 氯氨酮可减少心肌凋亡，减少Fas和Bcl2蛋白阳性细胞表达;心肌缺血再灌注后心肌组织呈大小不一的灶性坏死,坏死周围有炎性细胞浸润，氯胺酮作用后坏死减轻，低剂量氯胺酮作用更明显。结论：心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡、Fas 基因的蛋白与Bcl2 蛋白表达量均增加, 氯氨酮可减少心肌凋亡,减少细胞Fas和Bcl2蛋白阳性表达,从而减轻心肌损伤，且低剂量氯氨酮作用更明显。
关键词： 心肌缺血再灌注损伤； 心肌细胞凋亡； 氯胺酮； Fas蛋白； Bcl2蛋白
细胞凋亡不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式, 它是一个受遗传基因调节的生理学细胞自杀过程或程序性细胞死亡[1] 。研究表明在心肌缺血再灌注过程时，大量氧自由基生成、细胞内钙超载、大量中性粒细胞浸润以及线粒体损伤等均可促进心肌细胞凋亡，造成心肌损伤。而细胞凋亡中,凋亡刺激基因的蛋白表达产物Fas 蛋白及抗凋亡因子Bcl2蛋白的作用被认为中有重要意义。有研究表明氯胺酮可抑制心肌缺血再灌注损伤，但对其是否抑制心肌中的细胞凋亡并不清楚。本实验研究氯胺酮对其作用下大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与Fas 及Bcl2 蛋白表达量的变化及与心肌组织损伤的关系。
1 材料与方法
11 实验材料与仪器小型动物呼吸机(浙江大学实验仪器厂 ),心电图检测仪(浙江大学实验仪器厂)。细胞凋亡原位检测试剂盒( In Situ Cell Death Detection Kit , POD)购自Boehringer Mannheim公司,兔抗鼠Fas 多克隆抗体及FasL 多克隆抗体均购自Santa Cruz 公司。SABC试剂盒购自于博士德公司。
12 实验动物及分组雄性健康SD大鼠(6个月左右)32只，由长江大学医学院实验动物中心提供,体重250~300g, 随机分为4组，每组8只。A组为假手术对照组；B组为缺血再灌注模型对照组；C组为2mg/kg氯胺酮+缺血再灌注模型组;D组为4mg/kg氯胺酮+缺血再灌注组。
13 动物模型制备10%水合氯醛40mg/kg腹腔注射麻醉，连接多功能监护仪记录Ⅱ导心电图；气管切开，接小型动物呼吸机进行机械通气，呼吸频率60次/分，潮气量2ml/100g，于左胸第四肋间打开胸腔暴露心脏，在左心耳1mm左冠状动脉处，用眼科外用不锈小圆针穿过心肌浅层，稳定10min后将U型含有铜丝的胶管置于冠状动脉表面一起结扎(A组不结扎，B、C、D组结扎)；结扎开始左心室心尖部即由红色变暗，30min后呈暗红色，心电图中出现ST段抬高，说明缺血形成。此时B、C、D组分别由右腹股静脉注入10mL/kg生理盐水、2mg/kg氯胺酮、4mg/kg氯胺酮,解开结扎线后进行再灌注。在再灌注4h后断头处死，将新鲜心肌组织标本放入40 g/L中性甲醛溶液中固定, 然后集中进行石蜡包埋, 切片于4℃冰箱保存备用。
14 凋亡细胞原位标记与半定量分析石蜡包埋的心肌组织,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT 酶) 介导的带荧光的dU TP 缺口末端标记法检测。结果根据凋亡阳性细胞分布情况, 每张切片拍摄5个阳性视野, 每视野记数300 个心肌细胞中阳性细胞数, 以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。
15 Fas基因和Bcl2基因蛋白表达检测与半定量分析取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5 张，采用链霉亲和素生物素过氧化酶复合物技术(SABC) 法进行免疫组化染色和HRP/ AEC 显色法。每张切片于阳性表达区域选择10 个无重叠视野,用图像分析仪进行分析,并计算其光密度值的均值。采用光密度值的均值×102 表示。
16 心肌组织病理学分析切片于HE 染色后观察其组织病理性损伤改变。
17 统计学处理采用SPSS软件进行统计学分析,多组间比较用单因素方差分析，q检验进行组间比较，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
21 心肌凋亡细胞计数心肌组织中凋亡细胞的分布及变化: 经TUNEL 染色及苏木素复染后凋亡细胞核呈棕色,正常细胞核染蓝色。假手术组仅见极少数散在的凋亡细胞; 心肌缺血再灌注后凋亡细胞数明显增加, 氯氨酮作用后凋亡细胞数明显下降,且低剂量氯氨酮作用组下降更多。见表1。
22 心肌组织中Fas 和Bcl2基因的蛋白阳性染色变化假手术组仅见极少数散在的Fas 蛋白阳性染色细胞和 Bcl2蛋白阳性染色细胞;心肌缺血再灌注后Fas 和Bcl2蛋白阳性染色的细胞增加,Fas和Bcl2蛋白阳性细胞多为位于心肌梗死区周围的心肌细胞,氯氨酮作用后Fas蛋白和Bcl2蛋白阳性细胞数较缺血再灌注组减少,低剂量组减少更多。见表2。
表1 各组大鼠心肌细胞凋亡变化( 略)
表2 大鼠心肌组织Fas 与FasL 蛋白阳性染色细胞指数的变化(略)
23 心肌组织病理学改变假手术组心肌组织未见细胞变性和坏死;心肌缺血再灌注各组均有明显的心肌细胞浊肿灶性坏死,甚至可见多个相互连接的坏死灶。氯胺酮作用组细胞坏死情况减轻，坏死灶减少，低剂量氯胺酮作用组减轻程度更多。
3 讨论
研究表明，心肌缺血再灌注过程中除了细胞坏死外，还有另外一种细胞死亡形式即细胞凋亡[1]。早在90年代就有研究证实心肌缺血再灌注能引起心肌细胞凋亡[2]。本研究缺血再灌注组较对照组的的心肌凋亡细胞明显增加，进一步证实了这个结论。Fas 蛋白是存在于细胞表面Ⅰ型膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF) 受体家族成员之一。在心肌细胞凋亡中，启动凋亡的一条最具特征性的可直接启动细胞凋亡的途径为以Fas 受体/ Fas 配体(FasL) 系统为代表的死亡受体信号转导途径。而凋亡抑制基因Bcl2 可通过其抗氧化,调节细胞内钙稳态及抑制线粒体中细胞色素C 的释放等作用,阻止细胞凋亡。普遍认为，细胞凋亡依赖于凋亡促进基因与凋亡抑制基因表达产物的比值[3]。研究证实在缺血再灌注的动物模型中发现心肌细胞凋亡明显增加,同时伴有Fas 水平的明显增加[4,5]。本实验也发现，缺血再灌注组Fas蛋白阳性率明显增加，Bcl2蛋白阳性率也明显增加,而Fas/Bcl2增加，说明心肌缺血再灌注能增加心肌中Fas和Bcl2阳性蛋白表达,使Fas/Bcl2增加，从而导致心肌凋亡。早已有研究证实,氯氨酮对心脏和心肌具有正性和负性的直接作用 。近年研究证实[6] ,氯胺酮通过抑制细胞膜电压门控的Ca2+ 通道,降低细胞内Ca2+ 浓度。已广泛证实Ca2+通道通透性增加,心肌细胞内钙超载可导致心肌凋亡,从而导致心肌缺血再灌注。心肌缺血时Ca2+大量积聚,进一步激活IP3 和cAMP 等第二信使,促使Fas，Bcl2等基因的产生。而氯氨酮可能通过降低Ca2+浓度, 降低IP3 和cAMP 等第二信使的产生,从而可能减少Fas和Bcl2基因的产生,减少蛋白表达，在一定程度上抑止心肌凋亡,减轻心肌缺血再灌注损伤。研究证实[7], 高浓度氯胺酮(1×10-3mol/ L)对心肌有直接抑制作用,而低中浓度氯胺酮(1×10-5mol/ L 和1× 10-4mol/ L) ,就没有抑制作用,还具有正性变时变力效应,浓度越低(1×10-5mol/ L),作用越强。本实验2mg/kg氯氨酮和4mg/kg氯氨酮作用组结果,心肌凋亡减轻,Fas和Bcl2蛋白表达减少, Fas/Bcl2增加较缺血再灌注组减少，病理切片也显示坏死情况减轻，坏死灶减少,也证明中小剂量氯氨酮能减轻心肌凋亡和缺血再灌注损伤，而2mg/kg氯氨酮作用更大。综上所述,心肌缺血再灌注后心肌细胞发生坏死,Fas和Bcl2蛋白阳性细胞增加,心肌细胞凋亡增加。氯氨酮可减少心肌凋亡,减少Fas和Bcl2蛋白阳性细胞表达,且低剂量氯氨酮作用更大。
参 考 文 献
1 Buerke M. Cardioprotective effect of insulin2like growth factor in myocardial ischemia followed by reperfusion.Proc Natl Acad Sci USA , 1995, 92 :8031
2 Gottlieb RA ,Burleson KO ,Kloner RA , et al . Reperfusion injury in2duces apoptosis in rabbit cardiomyocytes. J Cli n Invest , 1994,94 :1621~1628.
3 Jayanthi S , Deng X, Bordelon M, Pawar S. Methamphetamine causes differential regulation of pro2death and anti2death Bcl22genes in the mouse neocortex. FASEB J ,2001 ;15 :1745~1752
4 Stephanou A , Scarabelli T M, Brar B K, et al. Induction of apoptosis and Fas receptor/ Fas ligand expression by ischemia/reperfusion in cardiac myocytes requires Serine 727 of the STAT21 transcription factor but not Tyrosine 701. J BiolChem , 2001 , 276 :28340~28347.
5 Yue TL , Ma X L , Wang X, et al. Possible involvement of stress activated protein kinase signaling pathway and Fas receptor expression in prevention of ischemia/ reperfusion induced cardiomyocyte apoptosis by carvedilol. Circ Res, 1998 , 82 :166~174.
6 彭章龙,杭燕南,孙大金氯胺酮对培养心肌细胞的直接作用及其机制 中华麻醉学杂志, 1999, 19 :566~568
7 Kongsayreepong S ,Cook DJ ,Housmans PRMechanism of the direct ,negtive inotropic effect of ketamine in isolated ferret and frog ventricularmyocardium1 Anesthesiology ,1993 ,79 :3122~3221
长江大学医学院形态部 荆州 434000, 百拇医药(吴 婧 吴焱森 赵长瑶)
关键词： 心肌缺血再灌注损伤； 心肌细胞凋亡； 氯胺酮； Fas蛋白； Bcl2蛋白
细胞凋亡不同于细胞坏死的另一种细胞死亡形式, 它是一个受遗传基因调节的生理学细胞自杀过程或程序性细胞死亡[1] 。研究表明在心肌缺血再灌注过程时，大量氧自由基生成、细胞内钙超载、大量中性粒细胞浸润以及线粒体损伤等均可促进心肌细胞凋亡，造成心肌损伤。而细胞凋亡中,凋亡刺激基因的蛋白表达产物Fas 蛋白及抗凋亡因子Bcl2蛋白的作用被认为中有重要意义。有研究表明氯胺酮可抑制心肌缺血再灌注损伤，但对其是否抑制心肌中的细胞凋亡并不清楚。本实验研究氯胺酮对其作用下大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡与Fas 及Bcl2 蛋白表达量的变化及与心肌组织损伤的关系。
1 材料与方法
11 实验材料与仪器小型动物呼吸机(浙江大学实验仪器厂 ),心电图检测仪(浙江大学实验仪器厂)。细胞凋亡原位检测试剂盒( In Situ Cell Death Detection Kit , POD)购自Boehringer Mannheim公司,兔抗鼠Fas 多克隆抗体及FasL 多克隆抗体均购自Santa Cruz 公司。SABC试剂盒购自于博士德公司。
12 实验动物及分组雄性健康SD大鼠(6个月左右)32只，由长江大学医学院实验动物中心提供,体重250~300g, 随机分为4组，每组8只。A组为假手术对照组；B组为缺血再灌注模型对照组；C组为2mg/kg氯胺酮+缺血再灌注模型组;D组为4mg/kg氯胺酮+缺血再灌注组。
13 动物模型制备10%水合氯醛40mg/kg腹腔注射麻醉，连接多功能监护仪记录Ⅱ导心电图；气管切开，接小型动物呼吸机进行机械通气，呼吸频率60次/分，潮气量2ml/100g，于左胸第四肋间打开胸腔暴露心脏，在左心耳1mm左冠状动脉处，用眼科外用不锈小圆针穿过心肌浅层，稳定10min后将U型含有铜丝的胶管置于冠状动脉表面一起结扎(A组不结扎，B、C、D组结扎)；结扎开始左心室心尖部即由红色变暗，30min后呈暗红色，心电图中出现ST段抬高，说明缺血形成。此时B、C、D组分别由右腹股静脉注入10mL/kg生理盐水、2mg/kg氯胺酮、4mg/kg氯胺酮,解开结扎线后进行再灌注。在再灌注4h后断头处死，将新鲜心肌组织标本放入40 g/L中性甲醛溶液中固定, 然后集中进行石蜡包埋, 切片于4℃冰箱保存备用。
14 凋亡细胞原位标记与半定量分析石蜡包埋的心肌组织,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT 酶) 介导的带荧光的dU TP 缺口末端标记法检测。结果根据凋亡阳性细胞分布情况, 每张切片拍摄5个阳性视野, 每视野记数300 个心肌细胞中阳性细胞数, 以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。
15 Fas基因和Bcl2基因蛋白表达检测与半定量分析取上述石蜡标本相应部位的连续切片各5 张，采用链霉亲和素生物素过氧化酶复合物技术(SABC) 法进行免疫组化染色和HRP/ AEC 显色法。每张切片于阳性表达区域选择10 个无重叠视野,用图像分析仪进行分析,并计算其光密度值的均值。采用光密度值的均值×102 表示。
16 心肌组织病理学分析切片于HE 染色后观察其组织病理性损伤改变。
17 统计学处理采用SPSS软件进行统计学分析,多组间比较用单因素方差分析，q检验进行组间比较，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
21 心肌凋亡细胞计数心肌组织中凋亡细胞的分布及变化: 经TUNEL 染色及苏木素复染后凋亡细胞核呈棕色,正常细胞核染蓝色。假手术组仅见极少数散在的凋亡细胞; 心肌缺血再灌注后凋亡细胞数明显增加, 氯氨酮作用后凋亡细胞数明显下降,且低剂量氯氨酮作用组下降更多。见表1。
22 心肌组织中Fas 和Bcl2基因的蛋白阳性染色变化假手术组仅见极少数散在的Fas 蛋白阳性染色细胞和 Bcl2蛋白阳性染色细胞;心肌缺血再灌注后Fas 和Bcl2蛋白阳性染色的细胞增加,Fas和Bcl2蛋白阳性细胞多为位于心肌梗死区周围的心肌细胞,氯氨酮作用后Fas蛋白和Bcl2蛋白阳性细胞数较缺血再灌注组减少,低剂量组减少更多。见表2。
表1 各组大鼠心肌细胞凋亡变化( 略)
表2 大鼠心肌组织Fas 与FasL 蛋白阳性染色细胞指数的变化(略)
23 心肌组织病理学改变假手术组心肌组织未见细胞变性和坏死;心肌缺血再灌注各组均有明显的心肌细胞浊肿灶性坏死,甚至可见多个相互连接的坏死灶。氯胺酮作用组细胞坏死情况减轻，坏死灶减少，低剂量氯胺酮作用组减轻程度更多。
3 讨论
研究表明，心肌缺血再灌注过程中除了细胞坏死外，还有另外一种细胞死亡形式即细胞凋亡[1]。早在90年代就有研究证实心肌缺血再灌注能引起心肌细胞凋亡[2]。本研究缺血再灌注组较对照组的的心肌凋亡细胞明显增加，进一步证实了这个结论。Fas 蛋白是存在于细胞表面Ⅰ型膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF) 受体家族成员之一。在心肌细胞凋亡中，启动凋亡的一条最具特征性的可直接启动细胞凋亡的途径为以Fas 受体/ Fas 配体(FasL) 系统为代表的死亡受体信号转导途径。而凋亡抑制基因Bcl2 可通过其抗氧化,调节细胞内钙稳态及抑制线粒体中细胞色素C 的释放等作用,阻止细胞凋亡。普遍认为，细胞凋亡依赖于凋亡促进基因与凋亡抑制基因表达产物的比值[3]。研究证实在缺血再灌注的动物模型中发现心肌细胞凋亡明显增加,同时伴有Fas 水平的明显增加[4,5]。本实验也发现，缺血再灌注组Fas蛋白阳性率明显增加，Bcl2蛋白阳性率也明显增加,而Fas/Bcl2增加，说明心肌缺血再灌注能增加心肌中Fas和Bcl2阳性蛋白表达,使Fas/Bcl2增加，从而导致心肌凋亡。早已有研究证实,氯氨酮对心脏和心肌具有正性和负性的直接作用 。近年研究证实[6] ,氯胺酮通过抑制细胞膜电压门控的Ca2+ 通道,降低细胞内Ca2+ 浓度。已广泛证实Ca2+通道通透性增加,心肌细胞内钙超载可导致心肌凋亡,从而导致心肌缺血再灌注。心肌缺血时Ca2+大量积聚,进一步激活IP3 和cAMP 等第二信使,促使Fas，Bcl2等基因的产生。而氯氨酮可能通过降低Ca2+浓度, 降低IP3 和cAMP 等第二信使的产生,从而可能减少Fas和Bcl2基因的产生,减少蛋白表达，在一定程度上抑止心肌凋亡,减轻心肌缺血再灌注损伤。研究证实[7], 高浓度氯胺酮(1×10-3mol/ L)对心肌有直接抑制作用,而低中浓度氯胺酮(1×10-5mol/ L 和1× 10-4mol/ L) ,就没有抑制作用,还具有正性变时变力效应,浓度越低(1×10-5mol/ L),作用越强。本实验2mg/kg氯氨酮和4mg/kg氯氨酮作用组结果,心肌凋亡减轻,Fas和Bcl2蛋白表达减少, Fas/Bcl2增加较缺血再灌注组减少，病理切片也显示坏死情况减轻，坏死灶减少,也证明中小剂量氯氨酮能减轻心肌凋亡和缺血再灌注损伤，而2mg/kg氯氨酮作用更大。综上所述,心肌缺血再灌注后心肌细胞发生坏死,Fas和Bcl2蛋白阳性细胞增加,心肌细胞凋亡增加。氯氨酮可减少心肌凋亡,减少Fas和Bcl2蛋白阳性细胞表达,且低剂量氯氨酮作用更大。
参 考 文 献
1 Buerke M. Cardioprotective effect of insulin2like growth factor in myocardial ischemia followed by reperfusion.Proc Natl Acad Sci USA , 1995, 92 :8031
2 Gottlieb RA ,Burleson KO ,Kloner RA , et al . Reperfusion injury in2duces apoptosis in rabbit cardiomyocytes. J Cli n Invest , 1994,94 :1621~1628.
3 Jayanthi S , Deng X, Bordelon M, Pawar S. Methamphetamine causes differential regulation of pro2death and anti2death Bcl22genes in the mouse neocortex. FASEB J ,2001 ;15 :1745~1752
4 Stephanou A , Scarabelli T M, Brar B K, et al. Induction of apoptosis and Fas receptor/ Fas ligand expression by ischemia/reperfusion in cardiac myocytes requires Serine 727 of the STAT21 transcription factor but not Tyrosine 701. J BiolChem , 2001 , 276 :28340~28347.
5 Yue TL , Ma X L , Wang X, et al. Possible involvement of stress activated protein kinase signaling pathway and Fas receptor expression in prevention of ischemia/ reperfusion induced cardiomyocyte apoptosis by carvedilol. Circ Res, 1998 , 82 :166~174.
6 彭章龙,杭燕南,孙大金氯胺酮对培养心肌细胞的直接作用及其机制 中华麻醉学杂志, 1999, 19 :566~568
7 Kongsayreepong S ,Cook DJ ,Housmans PRMechanism of the direct ,negtive inotropic effect of ketamine in isolated ferret and frog ventricularmyocardium1 Anesthesiology ,1993 ,79 :3122~3221
长江大学医学院形态部 荆州 434000, 百拇医药(吴 婧 吴焱森 赵长瑶)