荧光定量PCR试剂盒多采用Taqman探针技术、MGB探针技术、分子信标技术等。这些技术除需要扩增引物以外，还需要单独合成1～2条荧光探针，并且要分别标记荧光基团和淬灭基团。探针在结合过程中会影响PCR扩增，而且探针合成以及探针双标记价格昂贵，给病人带来了较大的经济压力。自身淬灭探针(self-quenched probe)技术是一种新型的荧光定量PCR技术，它的主要特点是在保证高灵敏度和高特异性的前提下，使扩增反应类似常规PCR，减少了影响因素，使得反应简单、易行价廉 [7～9] 。本研究拟采用自身淬灭探针技术建立一种高灵敏、高特异、成本低的荧光定量PCR检测Uu的方法。

     1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1质粒和菌株①Uu疑似标本:28例，来自我院2006年3月～4月期间，门诊疑似Uu感染孕妇白带，阴性标本:10例，来自我院2006年5月，健康体检妇女白带，同时三次培养检测结果均为阴性的标本，采用无菌棉拭子取白带，微生物培养检测于30min内接种培养基，PCR检测标本-70℃保存。②pMD18-T质粒:T-A克隆试剂盒，购自TAKARA公司，-20℃保存。③DH5α大肠杆菌:本实验室保存。

    1.1.2主要试剂与仪器 胶回收试剂盒、T-A克隆系统、PCR用Taq酶、dNTPs、Buffer、MgCl 2 购自大连宝生物技术有限公司;引物和探针由Invitrogen公司合成、标记;胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司。荧光定量PCR仪RG-3000为Corbett Research产品;解脲支原体液体培养基由郑州博赛生物技术研究所提供。

    1.2方法

    1.2.1微生物培养方法按试剂操作说明操作。

    1.2.2荧光定量PCR引物、自身淬灭探针的设计合成 选择解脲脲原体保守序列UreA(AF085729) [10] ，利用Invitrogen主页(https://orf.invitrogen.com/lux/)在线D-LUX引物设计软件设计探针:上游引物:5'-GCAATCTGCTCGTGAAGTATTACG-3'下游引物:5'-TGGGAAAGTAACTTCAACTTG-GAT-3'探针引物:5'-cgtaataGCAATCTGCTCGTGAAG-TATTAcG-3'

    1.2.3标准品质粒的构建标本模板的提取:①白 带标本 ......