HPLC-MS法测定人血浆中罗红霉素浓度
【摘要】 目的 建立液相色谱-质谱测定血浆中罗红霉素浓度的方法。 方法 色谱柱为Thermo Hypersil-HyPURITY C18(150×2.1nm, 5μm)；流动相为10mM乙酸铵(1.5%乙酸，0.1%TFA)：甲醇：乙腈(38：365：26)；电喷雾电离源(ESI)；选择性正离子监测(SIM), 质荷比(m/z)罗红霉素为838、麦迪霉素为815。结果 罗红霉素血药浓度在25～16000ng/ml间线性关系良好，低、中、高三浓度的平均相对回收率分别为98.6%、100.2%和99.4%，日内、间相对RSD均小于15%。结论 本方法简便、快速、准确、灵敏度高，可用于罗红霉素的治疗药物监测及药动学研究。
【关键词】 罗红霉素；高效液相色谱-质谱法；血药浓度
罗红霉素(roxithromycin)由红霉素衍生而来，抗菌谱与红霉素相同，但抗菌作用比红霉素强，尤其对流感嗜血杆菌、淋病奈瑟杆菌、大肠杆菌、百日咳杆菌的抗菌作用较强，对肺炎衣原体、肺炎支原体、军团菌等细胞内病原微生物的作用也超过红霉素。其特点为对胃酸稳定、口服吸收好、组织穿透性强、血药峰浓度高、分布广且不良反应较少[1]。有关罗红霉素的血液药物浓度测定方法，文献报道较多的是微生物法[2～4]，操作繁杂且系统误差大，影响结果的准确性；也有人用HPLC-UV法检测[5]，但罗红霉素紫外吸收波长在220nm以下，血浆中的许多内源性物质对其检测有干扰，检测灵敏度不高。本文拟通过实验建立液相色谱-质谱测定血液中罗红霉素浓度的方法，为罗红霉素的治疗药物监测及药动学研究提供简便、准确、高灵敏度的检测方法。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 罗红霉素标准品(购自中国药品生物制品检定所)，麦迪霉素标准品(购自中国药品生物制品检定所)。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器 岛津 LCMS2010液相色谱-质谱联用仪，LC-10AD VP低压四元梯度泵，CTO-10A VP柱温箱，SCL-10AD VP系统控制器，LCMSsolution工作站。上海精宏实验设备有限公司DZF-6020型真空干燥器，Heraeus Biofuge stratos 高速冷冻离心机。
1.3 色谱和质谱条件 色谱柱为Thermo Hypersil-HyPURITY C18(150×2.1nm, 5μm)；流动相为10mM乙酸铵(1.5%乙酸，0.1%TFA)：甲醇：乙腈(38：365：26)；流速0.25ml/min；柱温45℃。电喷雾电离源(ESI)，选择性正离子监测(SIM), 质荷比(m/z)为838(罗红霉素， M+H)，815(麦迪霉素，M+2H)带正电荷的分子离子峰，电离源电压4.5kV，喷雾气氮气的流速为1.5L/min，干燥气体氮气流速为10L/min。脱溶剂温度为250℃， 检测器电压1.5kV。
1.4 血浆样品处理 吸取0.1ml血浆，置2ml离心管中，加入内标液50μl，0.1ml饱和碳酸钠溶液，漩涡混匀，加提取液(正己烷：二氯甲烷：异丙醇＝20：10：1)1ml，漩涡振荡提取3min，14000r/min离心5min。吸取上层有机相于真空干燥器中抽干，残渣用流动相0.1ml溶解，离心，取上清液5μl进样。记录色谱图，内标法以峰面积定量。
2 实验结果
2.1 质谱和色谱图 图1中A、B分别为罗红霉素和麦迪霉素的质谱扫描图谱；图2中A、B、C分别空白血样、空白血样中加入标准品、受试者服药后6h血浆的总离子流图，麦迪霉素的保留时间约为 2.5min，罗红霉素的保留时间约为 3.0min。血浆内源性物质及其他杂质不干扰样品的分离测定。
2.2 线性范围及最小定量浓度 用空白血浆将罗红霉素标准储备液稀释成不同浓度(25、50、125、250、500、1000、2000、4000、8000、16000ng/ml)的标准血样，按“5.2”项下样品处理方法处理。以样品峰面积与内标峰面积之比(Y)对药物浓度(C)进行回归处理，回归方程为Y = 0.0.0009 * Conc.( ng/ml) + 0.017，R2 = 0.9990，线性范围25～16000ng/ml，最小可定量浓度为25ng/ml。
2.3 回收率及精密度 配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆各5份，按上法平行操作，进行测定，得日内相对标准差(RSD)均小于15%(分别为8.9%、8.6%和5.7%)，平均相对回收率分别为98.6%、100.2%和99.4%。每天配制浓度50、1000、8000ng/ml 的罗红霉素标准血浆各5份，连续测定3天，得日间相对标准差(RSD)均小于15%(分别为10.2%、10.5%和5.8%)
2.4 萃取回收率 配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆各5份；按5.2项下操作，记录罗红霉素和内标峰面积。另配制含罗红霉素浓度分别50、1000、8000ng/ml，内标浓度为10g/ml的流动相溶液各1ml，直接进样5l，记录罗红霉素和内标峰面积。计算血浆样品和流动相样品的峰面积百分比，得罗红霉素的萃取回收率分别为64.6%、64.2%、64.6%，内标的萃取回收率为62.5%。
2.5 稳定性考察 血样的室温稳定性：配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆，在室温条件下放置，分别在0、2、4、6、12h按上述方法测定罗红霉素的浓度，结果表明RSD<15%, 样品在室温放置12h内稳定。
血样的冻融稳定性：配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆，在-40℃冰箱中冷冻后取出，室温融化，测定罗红霉素的浓度，重复操作4次，结果表明RSD<15%，样品在4次冻融过程中稳定，氨氯地平血样历经3次冻融后稳定。
血浆样品冷冻放置稳定性：配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆，在-40℃冰箱中放置，分别在0、5、10、20、30天取样按上述方法测定罗红霉素的浓度，结果表明RSD<15%，样品在冷冻条件下放置30天内稳定。
3 讨论
本试验建立起罗红霉素血药浓度的高效液相色谱-质谱检测法，方法灵敏、准确、重现性好，操作简便，血浆内源杂质无干扰，最低定量浓度达25ng/ml，能够满足罗红霉素生物利用度和药代动力学研究的要求。
【参考文献】
1 Zhanel GG，Dueck M，Hoban DJ,et al.Review of macrolides and ketolides：focus on respiratory tract infections .Drugs, 2001,61(4)：443-498.
2 郁继诚，张菁，曹忆堇,等.国产罗红霉素胶囊剂的药代动力学及相对生物利用度测定.中国新药杂志，2001,10(9)：685-688.
3 杜智敏，张波，赵红光,等.国产罗红霉素胶囊的人体生物利用度和药代动力学 .哈尔滨医科大学学报，2000,34(6)：425-427.
4 杨昭毅,魏伟,汪倪萍,等.罗红霉素胶囊人体相对生物利用度研究 . 安徽医科大学学报, 2005,40(3):267-269.
5 Macek J，Ptacek P.Determination of roxithromycin in human plasma by high- perform ance liquid chromatography with spec-trophotometric detection .J Chromatogr B Biomed Sci App1, 1999,723 (2)：233-235.
作者单位： 414000 湖南岳阳，中国化学工程第四建设公司职工医院
(编辑：若 木), 百拇医药(周知)
【关键词】 罗红霉素；高效液相色谱-质谱法；血药浓度
罗红霉素(roxithromycin)由红霉素衍生而来，抗菌谱与红霉素相同，但抗菌作用比红霉素强，尤其对流感嗜血杆菌、淋病奈瑟杆菌、大肠杆菌、百日咳杆菌的抗菌作用较强，对肺炎衣原体、肺炎支原体、军团菌等细胞内病原微生物的作用也超过红霉素。其特点为对胃酸稳定、口服吸收好、组织穿透性强、血药峰浓度高、分布广且不良反应较少[1]。有关罗红霉素的血液药物浓度测定方法，文献报道较多的是微生物法[2～4]，操作繁杂且系统误差大，影响结果的准确性；也有人用HPLC-UV法检测[5]，但罗红霉素紫外吸收波长在220nm以下，血浆中的许多内源性物质对其检测有干扰，检测灵敏度不高。本文拟通过实验建立液相色谱-质谱测定血液中罗红霉素浓度的方法，为罗红霉素的治疗药物监测及药动学研究提供简便、准确、高灵敏度的检测方法。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 罗红霉素标准品(购自中国药品生物制品检定所)，麦迪霉素标准品(购自中国药品生物制品检定所)。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器 岛津 LCMS2010液相色谱-质谱联用仪，LC-10AD VP低压四元梯度泵，CTO-10A VP柱温箱，SCL-10AD VP系统控制器，LCMSsolution工作站。上海精宏实验设备有限公司DZF-6020型真空干燥器，Heraeus Biofuge stratos 高速冷冻离心机。
1.3 色谱和质谱条件 色谱柱为Thermo Hypersil-HyPURITY C18(150×2.1nm, 5μm)；流动相为10mM乙酸铵(1.5%乙酸，0.1%TFA)：甲醇：乙腈(38：365：26)；流速0.25ml/min；柱温45℃。电喷雾电离源(ESI)，选择性正离子监测(SIM), 质荷比(m/z)为838(罗红霉素， M+H)，815(麦迪霉素，M+2H)带正电荷的分子离子峰，电离源电压4.5kV，喷雾气氮气的流速为1.5L/min，干燥气体氮气流速为10L/min。脱溶剂温度为250℃， 检测器电压1.5kV。
1.4 血浆样品处理 吸取0.1ml血浆，置2ml离心管中，加入内标液50μl，0.1ml饱和碳酸钠溶液，漩涡混匀，加提取液(正己烷：二氯甲烷：异丙醇＝20：10：1)1ml，漩涡振荡提取3min，14000r/min离心5min。吸取上层有机相于真空干燥器中抽干，残渣用流动相0.1ml溶解，离心，取上清液5μl进样。记录色谱图，内标法以峰面积定量。
2 实验结果
2.1 质谱和色谱图 图1中A、B分别为罗红霉素和麦迪霉素的质谱扫描图谱；图2中A、B、C分别空白血样、空白血样中加入标准品、受试者服药后6h血浆的总离子流图，麦迪霉素的保留时间约为 2.5min，罗红霉素的保留时间约为 3.0min。血浆内源性物质及其他杂质不干扰样品的分离测定。
2.2 线性范围及最小定量浓度 用空白血浆将罗红霉素标准储备液稀释成不同浓度(25、50、125、250、500、1000、2000、4000、8000、16000ng/ml)的标准血样，按“5.2”项下样品处理方法处理。以样品峰面积与内标峰面积之比(Y)对药物浓度(C)进行回归处理，回归方程为Y = 0.0.0009 * Conc.( ng/ml) + 0.017，R2 = 0.9990，线性范围25～16000ng/ml，最小可定量浓度为25ng/ml。
2.3 回收率及精密度 配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆各5份，按上法平行操作，进行测定，得日内相对标准差(RSD)均小于15%(分别为8.9%、8.6%和5.7%)，平均相对回收率分别为98.6%、100.2%和99.4%。每天配制浓度50、1000、8000ng/ml 的罗红霉素标准血浆各5份，连续测定3天，得日间相对标准差(RSD)均小于15%(分别为10.2%、10.5%和5.8%)
2.4 萃取回收率 配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆各5份；按5.2项下操作，记录罗红霉素和内标峰面积。另配制含罗红霉素浓度分别50、1000、8000ng/ml，内标浓度为10g/ml的流动相溶液各1ml，直接进样5l，记录罗红霉素和内标峰面积。计算血浆样品和流动相样品的峰面积百分比，得罗红霉素的萃取回收率分别为64.6%、64.2%、64.6%，内标的萃取回收率为62.5%。
2.5 稳定性考察 血样的室温稳定性：配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆，在室温条件下放置，分别在0、2、4、6、12h按上述方法测定罗红霉素的浓度，结果表明RSD<15%, 样品在室温放置12h内稳定。
血样的冻融稳定性：配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆，在-40℃冰箱中冷冻后取出，室温融化，测定罗红霉素的浓度，重复操作4次，结果表明RSD<15%，样品在4次冻融过程中稳定，氨氯地平血样历经3次冻融后稳定。
血浆样品冷冻放置稳定性：配制浓度50、1000、8000ng/ml的罗红霉素标准血浆，在-40℃冰箱中放置，分别在0、5、10、20、30天取样按上述方法测定罗红霉素的浓度，结果表明RSD<15%，样品在冷冻条件下放置30天内稳定。
3 讨论
本试验建立起罗红霉素血药浓度的高效液相色谱-质谱检测法，方法灵敏、准确、重现性好，操作简便，血浆内源杂质无干扰，最低定量浓度达25ng/ml，能够满足罗红霉素生物利用度和药代动力学研究的要求。
【参考文献】
1 Zhanel GG，Dueck M，Hoban DJ,et al.Review of macrolides and ketolides：focus on respiratory tract infections .Drugs, 2001,61(4)：443-498.
2 郁继诚，张菁，曹忆堇,等.国产罗红霉素胶囊剂的药代动力学及相对生物利用度测定.中国新药杂志，2001,10(9)：685-688.
3 杜智敏，张波，赵红光,等.国产罗红霉素胶囊的人体生物利用度和药代动力学 .哈尔滨医科大学学报，2000,34(6)：425-427.
4 杨昭毅,魏伟,汪倪萍,等.罗红霉素胶囊人体相对生物利用度研究 . 安徽医科大学学报, 2005,40(3):267-269.
5 Macek J，Ptacek P.Determination of roxithromycin in human plasma by high- perform ance liquid chromatography with spec-trophotometric detection .J Chromatogr B Biomed Sci App1, 1999,723 (2)：233-235.
作者单位： 414000 湖南岳阳，中国化学工程第四建设公司职工医院
(编辑：若 木), 百拇医药(周知)