柱前在线衍生反相高效液相色谱内标法快速测定饲料中氨基酸
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摘 要 采用邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯联合柱前在线衍生，用反相C18短柱梯度洗脱，二极管阵列检测器(用于检测胱氨酸和赖氨酸)和荧光检测器(用于检测其它氨基酸)联合检测，建立了一种高效液相色谱内标法快速测定饲料中氨基酸含量的方法。此方法对传统样品水解液制备的方法进行了简化,在不须预先除去干扰物质的情况下，提高了氨基酸测定的准确度，18种氨基酸除胱氨酸和色氨酸未检出(完全被破坏)和蛋氨酸为87.32%(部分被氧化破坏)外，其它氨基酸的回收率为94.14%～102.25%,相对标准偏差为2.11%～452%(n=5);线性相关性好(相关系数为0.9900～0.9995)；线性范围为4.5～1000 μmol/L；方法检出限低，灵敏度高，分离时间短，适合饲料中氨基酸的快速测定。关键词 高效液相色谱法，柱前在线衍生，内标法，饲料，氨基酸
1 引 言
随着畜禽业、水产养殖业和饲料工业的迅猛发展，饲料的质量监督问题越来越受到人们的重视。以往饲料企业一般只依靠测定饲料中的粗蛋白来衡量饲料的优劣，这样是不够的。因为饲料中构成蛋白质的各种氨基酸数量的相对比例直接关系到动物生长和肉质水平\[1\]，同时也影响动物遗传性能的充分发挥，影响动物生产效果和经济效益\[2\]。因此，氨基酸含量分析是衡量饲料品质的一项重要指标。饲料中的成分复杂，很多成分对氨基酸的检测都有影响。如盐分、重金属、油脂，尤其是碳水化合物等\[2\]，使氨基酸的分析变得困难，不易测准。钱爱萍等\[3\]组织了饲料氨基酸测定联合实验，结果发现，不同实验室间的检测结果相差很大，并认为误差主要来源于样品的前处理即样品的水解。对于饲料氨基酸分析方法的研究，已有很多报道。其中经典的方法是高效阳离子交换色谱(HPCEC)结合柱后茚三酮衍生光度检测测定氨基酸。该法优点是准确、可靠、重现性好，缺点是仪器昂贵、灵敏度低，只可对100pmol以上的氨基酸进行准确分析\[4\],且分析时间长，一般需要1h。近年来，柱前衍生反相高效液相色谱法(RPHPLC)分析氨基酸以其灵敏度高，分析时间短等优点而广泛应用。目前已经报道的用于氨基酸柱前衍生的试剂很多，主要有氯甲酸芴甲酯(FMOC)\[5\]、异硫氰酸苯酯(PITC)\[6\]、丹酰氯(DansylCl)\[7\]、二甲胺偶氮苯磺酰氯(DabsylCl)\[8\]、二硝基氟苯(FDNB)\[9\]等，这些衍生试剂除OPA和FMOC的检测灵敏度为fmol级外，其它均在pmol级以上\[12\]，且分析时间至少需要30 min ......
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