当前位置: 首页 > 期刊 > 《分析化学》 > 2007年第1期
编号:11401425
高效毛细管电泳法手性分离D氨基酸取代胸腺五肽类似物的研究
http://www.100md.com 《分析化学》医学期刊 2007年第1期
     摘 要 采用高效毛细管电泳法分离两对D氨基酸取代的胸腺五肽类似物。对影响分离的缓冲液pH值、电泳温度、电泳电压等进行了系统的研究。用含20 mmol/L 2,6二甲基β环糊精(DMβCD)，40 mmol/L磷酸盐缓冲液(Ⅰ：pH 6.03；Ⅱ：pH 5.05)作运行缓冲液，柱温15℃，电压20 kV，使样品获得基线分离，取得了满意的分离结果。结果显示，两组样品的D氨基酸取代物均比L氨基酸取代物出峰早，提示D氨基酸取代物的电泳移动速度较快，与DMβCD的结合稳定性较L氨基酸取代物弱。

    关键词 胸腺五肽, D氨基酸,手性分离,高效毛细管电泳,2,6二甲基β环糊精

    1 引 言

    高效毛细管电泳法(HPCE)与高效液相色谱法(HPLC)相比较，具有柱效高、消耗低的优点，已经成功应用于药物手性分离[1]。环糊精(CD)及其衍生物存在疏水性内部空穴结构和外部亲水性结构，因此是肽类化合物HPCE手性分离应用最广的手性选择剂[2]。胸腺五肽(thymopentin)[3，4]是一种双向免疫调节剂的肽类药品，具有诱导和促进T淋巴细胞及其亚群分化、成熟和活化功能，通过调节T淋巴细胞比例使T淋巴细胞亚群(CD4/CD8)趋于正常。临床用于某些自身免疫性疾病。胸腺五肽具有五个手性中心(HArgLysAspValTyrOH)，其分子结构如下：D氨基酸引入肽链是一种有效提高肽类化合物稳定性的方法。含有D氨基酸的肽链在体内不易被蛋白酶降解，因此与天然肽相比，稳定性和抗代谢作用都有所增加，从而有效地提高了药物的生物活性，延长了生物半衰期。由于光学异构体的生物活性存在差异，生物活性肽及D氨基酸取代物的光学纯度对药品的研发及质量控制至关重要[4]。随着肽类化合物的药用价值不断提高，D氨基酸取代物的研究不断深入[5]。HPCE法对D氨基酸取代胸腺五肽类似物进行手性分离的研究尚未见报道。为了提高分离肽类光学异构体的能力，本实验随机选取两对D氨基酸取代胸腺五肽类似物，每对肽序列均具有一个氨基酸的手性差异，通过加入DMβCD手性选择剂使两对胸腺五肽类似物得到基线分离。讨论了pH值、温度、浓度等影响分离度的因素，该方法快速、简便，达到满意的分离效果。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂Beckman P/ACE5500型全自动毛细管电泳仪，配备二极管阵列检测器和GOLD软件数据工作站(美国BeckmanCoultere有限公司)。中性毛细管柱50 μm×56 cm(有效长度49 cm)(河北永年光导纤维厂)。4种D取代胸腺五肽类似物(自制，HPLC归一化法分析纯度>95%)。2,6二甲基β环糊精(DMβCD)(美国BeckmanCoulter有限公司)；ΚΗ2ΡΟ4、Η3ΡΟ4、NaOH、Tris均为分析纯。所用水为二次去离子水。样品溶液的配制:样品Ⅰ 称取L精氨酰D赖氨酰L天冬氨酰D缬氨酰L酪氨酸(HArgDLysAspDValTyrOH)(A)和D精氨酰D赖氨酰L天冬氨酰D缬氨酰L酪氨酸(HDArgDLysAspDValTyrOH)(B)各约1mg，水溶解并稀释至浓度约为0.45 g/L；样品Ⅱ 称取L精氨酰L赖氨酰D天冬氨酰L缬氨酰D酪氨酸(HArgLysDAspValDTyrOH)(C)和L精氨酰L赖氨酰D天冬氨酰D缬氨酰D酪氨酸(HArgLysDAspDValDTyrOH)(D)各约1mg，水溶解并稀释至浓度约为2.25 g/L；磷酸盐缓冲液的配制 精密称取KH2PO4 0.624 g至100 mL容量瓶中，水溶解后加1 mL甲醇[6]，加水稀释至刻度，配成浓度为40 mmol/L备用。10% Tris溶液调pH。

    2.2 实验方法背景电解质溶液为40 mmol/L磷酸盐缓冲液，分离电压：20 kV，检测波长：210 nm，柱温：15℃，阳极气压进样3 s，毛细管柱在使用前依次用0.1 mol/L HCl溶液冲洗2 min、水冲洗2 min和运行缓冲液冲洗5 min，两次运行之间均用水和缓冲液各冲洗2 min。

    3 结果与讨论

    D取代胸腺五肽类似物的分离是基于其在电泳缓冲液中与DMβCD通过氢键作用形成等基团作用生成复合物，由于肽链氨基酸残基的手性差异，造成D取代胸腺五肽类似物对映体的电泳速率不同。本实验选择的两对类似物均存在一个氨基酸的手性差异(Ⅰ为末端Arg不同，Ⅱ为Val不同)，由此导致电泳移动速度的不同，从而达到对映体分离的目的。

    3.1 缓冲液酸度对分离的影响在分离电压为20 kV、40 mmol/L磷酸盐缓冲液、DMβCD浓度20 mmol/L条件下，调节pH值至260、3.60、5.05、6.03，考察两对胸腺五肽类似物Ⅰ、Ⅱ的分离度，发现pH值为6.03时样品I得到最佳分离、pH值为5.05时样品II得到最佳分离(如表1所示)。

    表1 样品在不同pH条件的高效毛细管电泳分析数据 略

    3.2 柱温对分离的影响用20 mmol/L DMβCD的40 mmol/L磷酸盐缓冲液作运行液(Ⅰ：pH为6.03；Ⅱ：pH为5.05)。样品Ⅰ分别选择柱温15℃、20℃、25℃、30℃；样品Ⅱ分别选择柱温15℃、25℃。温度升高，焦耳热背景噪音增加，对映体分离度差。Ⅰ在高温时分离度降低，迁移时间缩短，选择25℃为最佳柱温；Ⅱ分离结果如表2所示，同样选择15℃为最佳柱温。

    3.3 电压对分离的影响用20 mmol/L DMβCD的40 mmol/L磷酸盐缓冲液作运行液(Ⅰ：pH为6.03，柱温25℃；Ⅱ：pH为5.05，柱温15℃)。样品Ⅰ、Ⅱ分别选择电压12 kV、15 kV、20 kV。在一定范围升高电压有助于减少分

    表2 样品在不同柱温条件的高效毛细管电泳分离数据 略

    析时间，提高分离度。当电压为20 kV时，Ⅰ于6.5 min出峰，分离度达到1.21。当电压为20 kV时，Ⅱ于18 min出峰，与12 kV的结果相比缩短分离时间17 min，分离度达到2.25，因此优选20 kV。如表3所示。

    表3 样品在不同电压条件的高效毛细管电泳分离数据 略

    3.4 样品的测定两组D取代胸腺五肽类似物溶液Ⅰ、Ⅱ在上述优化实验条件下，以DMβCD浓度为20 mmol/L的40 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH分别为5.05, 6.03)为运行液，柱温分别为25℃、15℃，电压20 kV条件下的电泳结果与如图1所示。Ⅰ、Ⅱ两组样品的分离度分别达到1.21、2.25。

    图1 两组胸腺五肽类似物的高效毛细管电泳分析图谱 略

    分析结果发现，两组样品的D氨基酸取代物均比L氨基酸取代物出峰早，提示D氨基酸取代物的电泳移动速度较快，与DMβCD的结合稳定性较弱。

    References

    1 Huang Zhidong (黄志东). Chinese Journal of Chromatography(色谱), 2000, 18(1): 80~81

    2 Li J, Waldron K C. Electrophoresis, 1999, 20(1): 171~179

    3 Wang Ling(王 玲), Wei Hao(魏 浩), Wei Ping(韦 萍), Zhu Yishen(朱颐申), Ouyang Pingkai(欧阳平凯). Chemical Industry and Engineering Progress(化工进展), 2003, 22(2): 153~156

    4 Tu Chunyan(屠春燕), Lin Min(林 敏), Zhu Yishen(朱颐申), Jin Miao(金 苗), Ouyang Pingkai(欧阳平凯). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2006, 34(12): 1737~1740

    5 Kang J, Bischoff D, Jiang Z, Bister B, Sussmuth R D, Schurig V. Anal. Chem., 2004, 76(8): 2387~2392

    6 Zhu Yishen(朱颐申), Yao Zhong(姚 忠), Qiu Qian(邱 芊), Tu Chunyan(屠春燕), Wei Ping(韦 萍), Ying Hanjie(应汉杰). Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics(中国生化药物杂志), 2005, 26(5): 257~260

    7 Deng Yanzhuo(邓延倬), He Jinlan(何金兰). High Performance Capillary Electroresis(高效毛细管电泳). Beijing(北京): Science Press(科学出版社), 2000: 75

    1(南京工业大学制药与生命科学学院, 南京 210009)

    2(南京中医药大学药学院，南京 210029), 百拇医药(朱颐申 屠春燕 顾薇 韦萍 欧阳平凯)