凝胶过滤色谱多角度激光散射法测定琥珀酰明胶自由氨基修饰度
琥珀酰明胶,修饰度,凝胶过滤色谱,多角度激光散射,三硝基苯磺酸,,琥珀酰明胶，修饰度，凝胶过滤色谱，多角度激光散射，三硝基苯磺酸,关键词琥珀酰明胶，修饰度，凝胶过滤色谱，多角度激光散射，三硝基苯磺酸,1引言,2理论部分,3实验部分,4
摘 要 琥珀酰明胶作为血浆代用品的临床疗效与其分子量分布和修饰度密切相关。本研究利用高效凝胶过滤色谱多角度激光散射法(HPSECMALLS)并结合2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)衍生法，探索建立一种测定琥珀酰明胶修饰度的方法。实验利用TNBS将琥珀酰明胶衍生，通过HPSECMALLS测定琥珀酰明胶的分子量变化，计算出琥珀酰明胶的修饰度。实验以人血清白蛋白为模型进行了方法验证，结果表明:该方法能较好地表征人血清白蛋白在TNBS衍生过程中的分子量变化，实验值与根据其氨基酸组成计算值一致。实验在HPSECMALLS测定琥珀酰明胶及TNBS衍生后琥珀酰明胶分子量及分布的基础上，利用凝胶过滤色谱分子量保留时间拟合曲线，计算得到琥珀酰明胶的自由氨基修饰度为38%。 结果表明利用高效凝胶过滤色谱多角度激光散射法结合2,4,6三硝基苯磺酸衍生法测定琥珀酰明胶的修饰度是可行的。关键词 琥珀酰明胶，修饰度，凝胶过滤色谱，多角度激光散射，三硝基苯磺酸
1 引 言
琥珀酰明胶是通过明胶的琥珀酰化而得到的改性明胶，是临床使用最为广泛的血浆代用品之一，具有扩容和抗休克效果好、免疫源性低以及无干涉凝血等优点。主要用于增加血容量，防止失血性休克，降低血液粘度，改善微循环，防止血栓形成等。明胶直接用作血浆扩容剂存在凝固点和有效渗透压低以及粘度高等缺陷，通过化学方法改变明胶性质可有效解决凝固点、分子量、粘度之间的矛盾关系[1]。利用在热碱性环境下琥珀酸酐与明胶赖氨酸残基上的ε氨基反应，是对明胶分子进行修饰以改变其性质的常用方法。其中明胶分子上ε氨基的修饰度是影响琥珀酰明胶凝固点、渗透压等性质的重要因素。建立明胶修饰度的定量分析方法对于琥珀酰明胶产品开发和质量控制具有重要意义。目前常用的蛋白质修饰度分析方法，主要有色谱法、凝胶电泳法、质谱法、红外光谱法及拉曼光谱法等[2]。这些方法一般用于分子量均一的蛋白质修饰度分析，直接用于测定明胶的修饰度有一定难度。主要原因是明胶是胶原蛋白降解得到的多肽混合物，分子量分布具有高度分散性(几千～十几万)。自从1960 年Satake 等[3]提出利用2,4,6三硝基苯磺酸(2,4,6trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)分光光度法测定蛋白质中自由氨基修饰度基本原理后，TNBS法已被证明是用来监测作用于自由氨基的修饰剂对蛋白质修饰程度的最为有效的方法之一[4～6]。该法利用蛋白质中的赖氨酸残基的ε氨基与TNBS的磺酸基发生特异性不可逆取代反应 ......
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