细胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定
CYP3A4;,合成肽;,多克隆抗体,,\]CYP3A4;,合成肽;,多克隆抗体,细胞色素P4503A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定,\[关键词\]CYP3A4;合成肽;多克隆抗体,1材料和方法,2结果,3讨论,参考文献:
\[摘 要\] 目的: 制备兔抗人细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抗体及其特性鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列, 根据亲水性、 抗原性、 柔韧性及表面性等指标选择多肽序列, 合成CYP3A4多肽, 与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联, 免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体, 间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数, Western blot鉴定其特异性, 免疫组化进行定位。结果: 获得针对小分子CYP3A4的抗体。该抗体效价为1∶16000; 相对亲和力常数在105～106 M-1, 具有实用价值; 可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应; 可识别正常人肝脏组织CYP3A4; Western blot的结果显示, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为46000。结论: 合成的多肽KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、 Western blot和免疫组化实验。\[关键词\]CYP3A4; 合成肽; 多克隆抗体
细胞色素3A4(CYP3A4)是细胞色素P450 超家族成员之一, 主要存在于肝脏中、 小肠中。它是人类药物代谢酶中的最重要的酶, 在临床上超过半数的药物完全或部分地被该酶代谢\[1\]。CYP3A4与外源性致癌物、 抗癌药物和内源性类固醇激素、 维生素、 脂肪酸的代谢转化密切相关\[2, 3\]。目前, 国外已研制出抗CYP3A4的抗体并且应用试验中; 而国内在研制CYP450抗体领域属于空白阶段, 我们研制出针对278-292 位的抗人CYP3A4抗体, 并将对CYP3A4功能的研究、 体外药物代谢及对其基因表达调控的肿瘤防治提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料 日本大耳白兔, 雄性, 6周龄, 由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺(TMB)均购自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购自Jackson ImmunoResearch公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜(NC)购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供 ......
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