胚胎冷冻保存技术的发展
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由于体外受精-胚胎移植的高昂费用、有限成功率和多余胚胎的存在,以及政策和伦理对胚胎移植数目的限制,从最大限度地保护患者利益出发,应尽可能提高每一取卵周期的临床妊娠率,因而胚胎冷冻技术极为重要。
胚胎冷冻造成细胞损伤机制
胚胎冷冻对活组织和细胞进行冷冻保存时,冷冻过程将可能对细胞造成损伤。主要的损伤机制包括:①溶液效应造成化学损伤。在冷却速度较慢的情况下,胞外溶液中水分大量结冰。与海水中的冰山主要是淡水形成而盐分很低的情况相类似,细胞外溶液结成的冰中溶质很少,这样就造成胞外溶液浓度提高,从而使胞内水分大量渗出,细胞强烈收缩,并使细胞长时间处于高浓度溶液中;②细胞内结冰造成物理损伤。冷却速度过快时,胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出,胞内溶液过冷而结冰,从而造成物理损伤。另外,在复温(解冻)过程中,如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰(重结冰)而损伤;③细胞渗透压异常损伤。抗冻保护剂的加入或去除不当,则会引起细胞渗透压明显变化、细胞内外电解质浓度改变等,从而造成细胞或胚胎损伤。为解决上述问题,发展出了各种冷冻方法,目前应用比较广泛的是程序冷冻法和玻璃化冷冻法。
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程序冷冻法
程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。在这一过程中胚胎逐步脱水,希望能够解决胚胎冷冻造成细胞损伤机制中存在的3个问题。但是,程序冷冻也存在一些问题。首先,冷冻和复苏时2次冰晶形成,增加了损伤的机会,溶液效应(冷冻时,细胞外渗透压高)和渗透性休克(复苏时,细胞外渗透压低)依然没有彻底解决;其次程序冷冻耗时(3小时)且需要昂贵的程序冷冻仪。
玻璃化冷冻法
慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示,科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻,而在春季解冻,且机体没有任何损伤。研究认识到,这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇,代替水作为细胞内溶剂,而在春天苏醒后体内丙三醇消失。“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时,形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来,经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。1985年,玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。目前,玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎,眼角膜、皮肤、血管等组织中,而人类胚胎中的应用始于1990年,目前已经获得广泛成功。
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玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。快速冷却,低温时形成透明的玻璃状固体,冷却过程中黏度很高,但无冰晶形成,避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤,保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。玻璃化冷冻主要操作步骤简单,包括:高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液,快速降温,使溶液黏稠度极度提高并固化,放置液氮保存。
影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括:①冷冻保护剂。同一种组织细胞,冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质,如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll等;细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质,如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题,但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响;②温度下降速度。降温速度越快越好,可直接沁入液氮的方法,降温速度约为2500 ℃/min,而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min;③胚胎载体。对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小,与液氮间隔尽量少,操作简便且不易丢失胚胎,目前常用的有:拉细的麦管、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、直接微滴法、电镜网和Cryoloop。目前已有很多文献表明,玻璃化胚胎冷冻技术可明显提高胚胎的复苏率和移植后患者的临床妊娠率,是一种很有前途的方法。, http://www.100md.com