三明市318名汉族骨髓捐献志愿者HLA的多态性
摘要: 目的 分析三明市汉族骨髓捐献志愿者HLA-A、B和DRBl多态性。 方法 用聚合酶链反应结合序列特异性寡核苷酸探针反向杂交和序列特异性引物为基础的聚合酶链反应技术，鉴定318名三明市汉族骨髓捐献志愿者HLA-A、B、DRB1座位的等位基因，计算基因频率。 结果 三明市汉族人群中HLA-A*01、A*02、A*11、A*24、A*26、A*30、A*31、A*33基因频率在0.0158～0.3656，HLA-B*13、B*27、B*35、B*38、B*39、B*46、B*48、B*51、B*54、B*55、B*56、B*58、B*4001组、B*4002组、B*1501组、B*1502组基因频率在0.0127～0.1971，HLA-DRB1*0301组、DRB1*04、DRB1*07、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*11、DRB1*12、DRB1*13、DRB1*14、DRB1*15、DRB1*16等基因频率在0.0336～0.1422。A、B、DRB1的空白基因频率分别为0.74%、2.79%、0.14%。 结论 三明市汉族骨髓捐献志愿者具有中国汉族人群HLA-A、B和DRBl基因共有的遗传特征，但也有其自身的特点。带有达到多态水平的HLA等位基因的患者在三明市汉族人群中寻找到HLA相匹配的供者的机会较大。
关键词: HLA;多态现象(遗传学);基因频率;汉族
人类白细胞抗原(HLA)系统，是迄今为止已发现的多态性最复杂的人类免疫遗传系统，具有明显的人种和地区差异。HLA分型及HLA基因频率数据，被广泛地应用于人体移植中寻找HLA相匹配的供者，也是研究群体遗传学、亲权关系鉴定、个体识别和HLA与疾病相关等所必需的基本资料 [1] 。笔者采用序列特异性引物为基础的聚合酶链反应(PCR-SSP)和聚合酶链反应结合序列特异性寡核苷酸探针反向杂交(PCR-SSOP)等HLA基因分型方法，鉴定了318名福建省三明市汉族骨髓捐献志愿者HLA-A、B和DRBl座位的等位基因，取得了部分三明市汉族人群HLA基因频率资料。
1 对象和方法
1.1 对象 福建省三明市汉族骨髓捐献志愿者318人，这些志愿者三代内均为汉族并居住在该市。
1.2 基因组DNA的制备 取EDTA抗凝全血0.3mL，用美国Gentra公司试剂盒制备基因组DNA，DNA的D 260nm /D 280nm 在1.6～1.8，DNA浓度在50～100ng/μL。
1.3 HLA分型
1.3.1 PCR-SSOP 采用HLA-A、B、DRB1基因分型试剂盒(挪威Dynal Biotech公司)。PCR扩增、扩增产物的变性按照说明书操作。扩增产物的杂交、杂交膜的洗涤和显色按照Auto RELI48自动杂交分型仪的操作规程进行。扫描杂交条，用Dynal软件分析及判读结果。
1.3.2 PCR-SSP 采用HLA-A、B、DRB1基因分型试剂盒(美国G&T Biotech公司)。通过PCR反应特异性扩增HLA等位基因片段，然后在20g/L琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物。在紫外灯下拍照，根据是否有PCR产物以及PCR产物大小指定相应基因。
1.3.3 对于用上述分型方法无法确定分型结果的样品，用PCR-SSP试剂盒(美国PEL-FREEZ或德国BAG公司)进行HLA-A、B、DRB1分型，直至得到确切结果。
1.4 HLA基因的命名和特异性的指定 HLA基因命名采用WHO HLA因子命名委员会2002年发布的命名原则，并将HLA基因转换为相应的HLA特异性 [2] 。
1.5 统计学处理 用方根法计算基因频率 [1] :未被检测出的空白基因频率=1-所有基因频率之和。
2 结果
三明市汉族HLA-A、B、DRB1抗原型的观察数和基因频率见表1～3。
表1 三明市汉族人群HLA-A座位基因频率(×10 4 )(略)
表2 三明市汉族人群HLA-DRB1座位基因频率(×10 4 )(略)
DRB1*0301组包括DRB1*0301，0304，0305，0310，0311.
表3 三明市汉族人群HLA-B座位基因频率(×10 4 )(略)
B*4001组包括4001，07，10，31，34;B*4002组包括4002，03，04，06，09，16，27，29;B*1501组包括1501，04，05，06，07，15，20，24，25，27，28，30，32，35，39，45，48，70，71，73;B*1502组包括1502，08，11，21，31;B*1503组包括1503，09，10，18，37，46，51;B*1512组包括1512，14，19;1516组包括1516，17.
3 讨论
三明市汉族人群中HLA-A*01，A*02，A*11，A*24，A*26，A*30，A*31，A*33等基因频率在0.0158～0.3656，达到多态水平;HLA-A座位中以A*11，A*02，A*24等位基因为主;HLA-B*13，B*27，B*35，B*38，B*39，B*46，B*48，B*51，B*54，B*55，B*56，B*58，B*4001组、B*4002组、B*1501组、B*1502组等基因频率在0.0127～0.1971，达到多态水平;HLA-B座位中以B*40(B*4001组和4002组)，B*46，B*58，B*15(B*1501组和1501组)，B*13，B*51，B*54等位基因为主;HLA-DRB1*0301组，DRB1*04，DRB1*07，DRB1*08，DRB1*09，DRB1*11，DRB1*12，DRB1*13，DRB1*14，DRB1*15，DRB1*16等基因频率在0.0336～0.1422，达到多态水平;HLA-DRB1座位中以DRB1*04，DRB1*15，DRB1*12，DRB1*09，DRB1*08，DRB1*11，DRB1*0301组等位基因为主。
虽然在三明市汉族骨髓捐献志愿者中未发现HLA-A*23，A*25，A*29，A*32，A*34，A*36，A*43，A*66，A*69，A*74，A*80，B*14，B*3542，B*4005，B*41，B*42，B*45，B*47，B*49，B*53，B*59，B*73，B*78，B*82，DRB1*0302等基因，但是由于可能取样误差，尚不能下结论说在三明市汉族人中不存在这些基因。目前，在中国人群中未检出A*36，A*43，A*80，B*78，B*82，B*3542，B*4005，DRBl*0302。虽然在中国其他人群中曾经检出A*23，A*25，A*34，A*66，A*69，A*74，B*14，B*41，B*42，B*45，B*47，B*49，B*53，B*59，B*73等HLA基因，但是基因频率都很低，在0.0001～0.0024之间 [3] 。从这些基因的分布和基因频率特点来看，在三明市汉族骨髓捐献志愿者中未检测到这些基因是完全可能的。在北方人群中A*32基因频率达0.0161 [3] ，但是在三明市汉族人群中未检出，这可能是该基因在三明市汉族人群较罕见，而且该基因在南方汉族人群的频率也只达0.0047 [3] 。
在三明市汉族人群中HLA-A、B、DRB1的空白基因频率分别为0.74%，2.79%，0.14%。笔者检测到的HLA基因基本上涵盖了三明市汉族人>99.2%的HLA-A基因，>97.2%的HLA-B基因和99.8%的HLA-DRB1基因。在三明市汉族人群中是否有较多的空白HLA-B基因有待深入研究。
HLA基因分布特点说明，带有达到多态水平的HLA等位基因，尤其是带有HLA-A、B、DRB1座位中主要的等位基因的患者在三明市汉族人群中寻找到供者的机会较大。为了使需要骨髓移植治疗的患者获得更高的与骨髓供者相配合的机会，中国造血干细胞捐献者资料库有必要在全国各地征募造血干细胞捐献志愿者。
参考文献:
[1] 潭建明，周永昌，唐孝达. 组织配型技术与临床应用 [M].北京:人民卫生出版社，2002:86-88，494-643.
[2] Marsh SGE，Albert ED，Bodmer WF，et al.Nomenclature for factors of the HLA system2002[J].Tissue Antigens，2002，60(5):407-464.
[3] 吴国光，邓志辉，高素青，等.6965名汉族骨髓供者HLA多态性分析[J]. 中华血液学杂志， 2004，25(8):473-477.
(编辑:常志卫)
作者单位: 福建省血液中心，福州 350004
中国造血干细胞捐献者资料库福建省分库，福州 350001, 百拇医药(卓孝福 ，王长青 ，郑莹 ，郭永建 ，庄丽娟)
关键词: HLA;多态现象(遗传学);基因频率;汉族
人类白细胞抗原(HLA)系统，是迄今为止已发现的多态性最复杂的人类免疫遗传系统，具有明显的人种和地区差异。HLA分型及HLA基因频率数据，被广泛地应用于人体移植中寻找HLA相匹配的供者，也是研究群体遗传学、亲权关系鉴定、个体识别和HLA与疾病相关等所必需的基本资料 [1] 。笔者采用序列特异性引物为基础的聚合酶链反应(PCR-SSP)和聚合酶链反应结合序列特异性寡核苷酸探针反向杂交(PCR-SSOP)等HLA基因分型方法，鉴定了318名福建省三明市汉族骨髓捐献志愿者HLA-A、B和DRBl座位的等位基因，取得了部分三明市汉族人群HLA基因频率资料。
1 对象和方法
1.1 对象 福建省三明市汉族骨髓捐献志愿者318人，这些志愿者三代内均为汉族并居住在该市。
1.2 基因组DNA的制备 取EDTA抗凝全血0.3mL，用美国Gentra公司试剂盒制备基因组DNA，DNA的D 260nm /D 280nm 在1.6～1.8，DNA浓度在50～100ng/μL。
1.3 HLA分型
1.3.1 PCR-SSOP 采用HLA-A、B、DRB1基因分型试剂盒(挪威Dynal Biotech公司)。PCR扩增、扩增产物的变性按照说明书操作。扩增产物的杂交、杂交膜的洗涤和显色按照Auto RELI48自动杂交分型仪的操作规程进行。扫描杂交条，用Dynal软件分析及判读结果。
1.3.2 PCR-SSP 采用HLA-A、B、DRB1基因分型试剂盒(美国G&T Biotech公司)。通过PCR反应特异性扩增HLA等位基因片段，然后在20g/L琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物。在紫外灯下拍照，根据是否有PCR产物以及PCR产物大小指定相应基因。
1.3.3 对于用上述分型方法无法确定分型结果的样品，用PCR-SSP试剂盒(美国PEL-FREEZ或德国BAG公司)进行HLA-A、B、DRB1分型，直至得到确切结果。
1.4 HLA基因的命名和特异性的指定 HLA基因命名采用WHO HLA因子命名委员会2002年发布的命名原则，并将HLA基因转换为相应的HLA特异性 [2] 。
1.5 统计学处理 用方根法计算基因频率 [1] :未被检测出的空白基因频率=1-所有基因频率之和。
2 结果
三明市汉族HLA-A、B、DRB1抗原型的观察数和基因频率见表1～3。
表1 三明市汉族人群HLA-A座位基因频率(×10 4 )(略)
表2 三明市汉族人群HLA-DRB1座位基因频率(×10 4 )(略)
DRB1*0301组包括DRB1*0301，0304，0305，0310，0311.
表3 三明市汉族人群HLA-B座位基因频率(×10 4 )(略)
B*4001组包括4001，07，10，31，34;B*4002组包括4002，03，04，06，09，16，27，29;B*1501组包括1501，04，05，06，07，15，20，24，25，27，28，30，32，35，39，45，48，70，71，73;B*1502组包括1502，08，11，21，31;B*1503组包括1503，09，10，18，37，46，51;B*1512组包括1512，14，19;1516组包括1516，17.
3 讨论
三明市汉族人群中HLA-A*01，A*02，A*11，A*24，A*26，A*30，A*31，A*33等基因频率在0.0158～0.3656，达到多态水平;HLA-A座位中以A*11，A*02，A*24等位基因为主;HLA-B*13，B*27，B*35，B*38，B*39，B*46，B*48，B*51，B*54，B*55，B*56，B*58，B*4001组、B*4002组、B*1501组、B*1502组等基因频率在0.0127～0.1971，达到多态水平;HLA-B座位中以B*40(B*4001组和4002组)，B*46，B*58，B*15(B*1501组和1501组)，B*13，B*51，B*54等位基因为主;HLA-DRB1*0301组，DRB1*04，DRB1*07，DRB1*08，DRB1*09，DRB1*11，DRB1*12，DRB1*13，DRB1*14，DRB1*15，DRB1*16等基因频率在0.0336～0.1422，达到多态水平;HLA-DRB1座位中以DRB1*04，DRB1*15，DRB1*12，DRB1*09，DRB1*08，DRB1*11，DRB1*0301组等位基因为主。
虽然在三明市汉族骨髓捐献志愿者中未发现HLA-A*23，A*25，A*29，A*32，A*34，A*36，A*43，A*66，A*69，A*74，A*80，B*14，B*3542，B*4005，B*41，B*42，B*45，B*47，B*49，B*53，B*59，B*73，B*78，B*82，DRB1*0302等基因，但是由于可能取样误差，尚不能下结论说在三明市汉族人中不存在这些基因。目前，在中国人群中未检出A*36，A*43，A*80，B*78，B*82，B*3542，B*4005，DRBl*0302。虽然在中国其他人群中曾经检出A*23，A*25，A*34，A*66，A*69，A*74，B*14，B*41，B*42，B*45，B*47，B*49，B*53，B*59，B*73等HLA基因，但是基因频率都很低，在0.0001～0.0024之间 [3] 。从这些基因的分布和基因频率特点来看，在三明市汉族骨髓捐献志愿者中未检测到这些基因是完全可能的。在北方人群中A*32基因频率达0.0161 [3] ，但是在三明市汉族人群中未检出，这可能是该基因在三明市汉族人群较罕见，而且该基因在南方汉族人群的频率也只达0.0047 [3] 。
在三明市汉族人群中HLA-A、B、DRB1的空白基因频率分别为0.74%，2.79%，0.14%。笔者检测到的HLA基因基本上涵盖了三明市汉族人>99.2%的HLA-A基因，>97.2%的HLA-B基因和99.8%的HLA-DRB1基因。在三明市汉族人群中是否有较多的空白HLA-B基因有待深入研究。
HLA基因分布特点说明，带有达到多态水平的HLA等位基因，尤其是带有HLA-A、B、DRB1座位中主要的等位基因的患者在三明市汉族人群中寻找到供者的机会较大。为了使需要骨髓移植治疗的患者获得更高的与骨髓供者相配合的机会，中国造血干细胞捐献者资料库有必要在全国各地征募造血干细胞捐献志愿者。
参考文献:
[1] 潭建明，周永昌，唐孝达. 组织配型技术与临床应用 [M].北京:人民卫生出版社，2002:86-88，494-643.
[2] Marsh SGE，Albert ED，Bodmer WF，et al.Nomenclature for factors of the HLA system2002[J].Tissue Antigens，2002，60(5):407-464.
[3] 吴国光，邓志辉，高素青，等.6965名汉族骨髓供者HLA多态性分析[J]. 中华血液学杂志， 2004，25(8):473-477.
(编辑:常志卫)
作者单位: 福建省血液中心，福州 350004
中国造血干细胞捐献者资料库福建省分库，福州 350001, 百拇医药(卓孝福 ，王长青 ，郑莹 ，郭永建 ，庄丽娟)