林蛙卵粗提物改善迟发型变态反应性肝损伤的作用机制
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王丽，邬纯鑫，吕 集，杜景新，翟丽红
林蛙卵；迟发型变态反应；肝损伤,,],林蛙卵；迟发型变态反应；肝损伤,1材料与方法,2结果,3讨论,[参考文献]
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林蛙卵粗提物改善迟发型变态反应性肝损伤的作用机制 (pdf)
[摘要] 目的 研究林蛙卵粗提物对迟发型变态反应性肝损伤的作用机制。 方法 采用林蛙卵粗提物作用于四氯化碳(CCl4)作为肝脏毒物所致的迟发型变态反应性肝损伤模型，在肝损伤12 h分离的肝实质细胞和肝细胞共培养体系中，林蛙卵粗提物预处理肝非实质细胞；采用CCl4所致的脾淋巴细胞转化，制备脾细胞悬液与不同浓度的林蛙卵粗提物共培养，测定脾细胞的刺激指数。结果 林蛙卵粗提物预处理肝非实质细胞明显地阻断了上清液中谷丙氨酸氨基转移酶的释放，作用呈量效关系和时效关系；而预处理肝细胞则无影响。同样，林蛙卵粗提物对CCl4引起的脾淋巴细胞增殖无抑制活性，诱导相给药对肝损伤具有保护作用。 结论 林蛙卵粗提物不仅能有效地对肝细胞膜起保护作用，而且对清除或减轻引起肝毒性的因素起到重要的治疗作用。改善迟发型变态反应性肝损伤，林蛙卵粗提物能有效地改善肝损伤的作用主要与选择性地抑制肝损伤时肝非实质细胞的功能有关。
[关键词] 林蛙卵；迟发型变态反应；肝损伤
保护肝细胞不受损害对预防和治疗肝炎病十分重要，这些保护包括经典的细胞膜保护[1]，但更重要的是清除或减轻引起肝毒性因素作用。目前已知，T细胞介导的细胞免疫反应是许多肝病中引起肝细胞损坏的主要原因之一[2~4]有关研究已模拟这种细胞免疫机制建立了迟发型变态反应诱导的肝损伤动物模型，证实其主要效应细胞为CD4+T、CD8+T细胞，而特异性细胞免疫的效应细胞主要是Th1型CD4+T细胞和CD8+CTL细胞[5]，并证实肝损伤小鼠肝内浸润T淋巴细胞释放谷丙转氨酶的能力而对正常肝细胞并无影响，这种杀伤能力在肝损伤后12 h达到高峰，但从正常小鼠中分离的肝非实质细胞不具有这种能力，表明肝损伤时非实质细胞中浸润的T淋巴细胞是造成肝细胞损伤的主要因素之一。
为此，本文拟运用肝实质细胞与肝细胞相互作用的实验体系，从影响非实质细胞的功能，消除造成肝细胞损伤的免疫因素角度探讨进行药物治疗的可能性。鉴于前期研究已发现林蛙卵粗提物对迟发型变态反应肝损伤有显著改善作用[6]，本研究进一步探讨了其改善肝损伤的作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂 林蛙卵(wood frug egg)购于长白山区通化集安清河林蛙生态沟，经我院林蛙研究所吕集教授鉴定为中国林蛙长白山亚种。用95%的乙醇浸渍48 h(4倍量)提取2次，过滤，合并滤液，回收乙醇，得粗提物，收率为15%，实验中所用的林蛙卵粗提物均以此计算。CCl4(分析纯，由通化市中心医院化验室提供)；胶原酶(通化市中心医院化验室提供，182 units/mg)；戊巴比妥钠(通化市中心医院提供)；血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；无钙镁Hanks液的配制:NaCl 8.175 g、KCl 0.403 g、Na2HPO40.114 g溶于950 ml注射用水，加HEPES调pH至7.4，定容至1000 ml。Hanks液的配制:KCl 0.403 g、MgCl2 0.102 g、NaCl 8.00 g、Dglucose 1.110 g、0.02%phenol red溶于950 ml注射用水中，加HEPES调pH值至7.4，定容至1000 ml。RPMI(GIBCO)培养液：用注射用水溶解，加入100 u/ml青霉素和100 u/ml的链霉素，过滤灭菌，临用前加入10%灭活除菌的新生牛血清(new born serum，NBS)即为RPMI-1640-10%NBS液。
1.2 实验动物 4~6周龄[体重(25±1)g]的健康雌性昆明种小鼠，由吉林大学实验动物部提供。
1.3 肝损伤模型 CCl4致迟发型变态反应(CCl4-DTH)诱发小鼠肝损伤：取昆明小鼠，刮去小鼠腹毛，用1%(W/V)CCl4的乙醇溶液100 μl致敏，5天后再次同样致敏，再5天后，用0.2% CCl4的花生油溶液10 μl肝内注射，于注射后18 h采血，血清用于测定丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶的活力。或于注射后12 h按下述方法分离肝实质细胞和非实质细胞。药物于诱导相给药时，从CCl4首次致敏起，连续10天。
1.4 肝实质细胞和非实质细胞的分离 采用修改的两步灌流法分离肝损伤12 h后小鼠的肝实质细胞与非实质细胞。即给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉开腹，肝门脉插管，先用无钙镁Hanks内含0.5 mmol/L，EDTA25 mmol/L，HEPES，pH7.4灌流至肝脏中血被冲洗干净，再换用0.1%的胶原酶液继续灌流至几分钟，然后摘出肝脏置冰冷的RPMI-1640-10%NBS液中，分散肝细胞，100目筛网过滤，离心2 min，得肝细胞(HC)，上清于300 g离心5 min，得肝非实质细胞(NPC)。肝细胞、肝非实质细胞经两次洗涤后，以台酚蓝按下述方法分离肝染色，计算存活率分别为80%和90%，通常在分离后立即用于培养。
1.5 细胞培养与转氨酶释放实验 采用肝损伤12 h时分离得到的细胞。肝细胞经计数调成1.08×105 cells/ml，在96孔板上接种细胞悬液0.2 ml/well，至37 ℃，5%CO2下预培养3 h，弃上清液，用RPMI-1640培养液洗两次后，加入1.0×106 cells/ml的肝非实质细胞0.1 ml或0.1 mlRPMI-1640培养液，共同培养前，用林蛙卵粗提物与肝细胞或非实质细胞在37 ℃培养1 h，洗去药液，再进行上述共培养。
1.6 CCl4致小鼠脾淋巴细胞转化试验 取正常小鼠无菌摘除脾脏，于5 ml Hanks液中制备获得脾细胞悬液1000 r/min离心5 min后，用0.17 mol/L Tris-0.75%氯化钠去除红细胞，再用RPMI-1640-10%NBS培养液洗涤两次，调成107 cells/ml。置96孔培养板中，在5 μg/ml CCl4及不同浓度的林蛙卵粗提物的共存下于37 ℃，5%CO2，培养72 h。然后加入MTT的培养基溶液20 μl、37 ℃、5%CO2，再培养4 h，吸去上清，每孔加入0.2 ml DNSO振荡，使沉淀完全溶解，540 nm处测吸光度。将加CCl4时的吸光度除以不加CCl4时的吸光度作为CCl4对脾细胞的刺激指数。
1.7 统计学方法 实验数据应用SSPS 9.0统计软件处理，进行方差分析。各组间比较应用LSD法，P<0.05为差异有显著性。血清丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶的水平以均数±标准差(x±s)表示。
2 结果
2.1 林蛙卵粗提物对迟发型变态反应性肝损伤小鼠肝非实质细胞杀伤肝细胞的影响 与肝细胞的自动释放值相比，肝非实质细胞显著增加了上清中丙氨酸氨基转移酶的水平。对于这种增加，用10-7、10-6、10-5、10-4g/ml的林蛙卵油粗提物预处理肝非实质细胞剂量依赖性抑制了丙氨酸氨基转移酶的释放，其抑制率分别为33.5%、55.0%、67 ......
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