大枣中性多糖的化学研究
摘要：目的：对大枣的多糖化学成分进行较系统研究。方法：大枣用乙醇回流脱脂，80～100℃温水浸取，提取液减压浓缩，乙醇分级沉淀，三氯乙酸脱蛋白，透析，透析内液减压浓缩，再醇沉得到三个级分ZJ-A，ZJ-B，ZJ-C；ZJ-C多糖经DEAE-Cellulose柱、Sepchcryls-300柱层析纯化。结果与结论：分离提取的大枣多糖ZJ-9，ZJ-10,GPC法测定其相对分子量为5 244，4 615。经光谱和色谱分析(13C NMR,HPLC)表明ZJ-10是以β-(1→2)-阿拉伯呋喃糖为主链，葡萄糖、半乳糖在末端或支链相联的均一组分， ZJ-9以β-(1→3)-甘露糖为主链，岩藻糖在末端或支链相联。
关键词：大枣； 多糖； 分离纯化； 结构测定
Studies on the Neutral Polysaccharides of Zizyphus jujube Mill
YANG Yun, GONG Jianhong, FENG Weisheng, MA Xiangbin
(Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou, Henan 450008, Chinan; People's Hospital of Fan County,Fanxian ,Henan 457500,China)
Abstract:Objective:Systematic chemical studies on polysaccharide ,the main activity components in Zizyphus Jujube Mill were done.Methods:Zizyphus Jujuba Mill was extracted with ethanol and 80-100℃water,the water elution was concentrated at reduce pressure, fractions ZJ-A，ZJ-B，ZJ-C were obtained by fractional precipitation of the water elution with ethanol. And then protein was cleared by CCl3COOH.Results:While ZJ-9 and ZJ-10 were obtained by further purification of ZJ-C with DEAE-Cellulose and Sepchcryls-300, the molecular weight of ZJ-9 and ZJ-10 were estimated to be 5 244, 4 615 with GPC. Spectral analysis (UV, IR,13C NMR, HPLC) were used to investigated the structural characterization of polysaccharides.Conclusion:The ZJ-10'main chain is (1→2)-linked β-D-anabinofuranose , and its side chains include glucose,galactose. The ZJ-9'main chain is (1→3)-linked β-D-mannose , and its side chains include fucose.
Key words:Zizyphus Jujuba Mill; Polysaccharide; Purification; Structure
大枣为鼠李科植物枣(Zizyphus jujube Mill)的干燥成熟果实，为中医临床常用的医疗保健药材,具有补中益气，养血安神之功效，用于脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁之症。本课题组的药理研究表明：大枣多糖可以提高衰老模型小鼠血SOD，CAT，GSH-PX活力，降低血浆肝匀浆及脑匀浆中LPO水平；促进正常及免疫抑制小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬功能, 促进溶血素和溶血空斑形成，促进淋巴细胞转化；对大小鼠血虚模型、气血双虚模型有较好改善作用。新郑大枣为河南特产，对其多糖的研究国内外未见报道，为深入开发大枣这一丰富的自然资源，本文对其多糖成分进行了较系统研究，从中分离得到均一多糖ZJ-9，ZJ-10，并对其进行结构表征。
1 材料与仪器
DEAE Cellulose为Whatman产品; Sephacryl S-300为Pharmacia产品; 测定分子量所用标准糖为Shodex Standard Pullulan P-82系列; 各种单糖标准品为Merck出品; CF3COOH为Flank出品; 其它试剂均为国产AR级。
BS-1OOA型自动部分收集器及HL-2型恒流泵为上海沪西机电厂产品; 721型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品; 核磁共振仪为Bruker AC-300; UV-2201紫外扫描仪为日本岛津产品; GPC测定仪为HP-1090M (带GPC软件); 示差折光仪为HP-1037A RI, 柱为u-Bondagel E-1000，均为美国惠普公司产品; 医用冷冻干燥机LGJ-II型为上海医用仪器厂。
2 实验方法
2.1 提取分离纯化 大枣干燥成熟果肉 (4.0kg) 以95%乙醇回流提取三次，药渣置于通风处晾干，用水于80～100℃连续温浸提取四次，合并提取液，浓缩至约4 000 m1，分别以20%，50%，80%乙醇依次分级沉淀，静置，虹吸上清液，下层沉淀离心，收集沉淀物，分别得到分级沉淀的褐色粗多糖。取80%醇沉粗多糖加水溶解，以30% CCl3COOH脱蛋白，静置，离心，上清液以碱液调pH=7，减压浓缩，浓缩液对水透析, 将透析袋内的溶液减压浓缩至适当体积，加入95%乙醇使其含醇量达85%，收集沉淀物，相继以高浓度乙醇、无水乙醇、丙酮及无水乙醚处理，迅速置P2O5真空干燥器中减压干燥，得除去部分杂质的粗多糖ZJ-C。
ZJ-C进行DEAE-Cellulose柱层析，0～1 mol/L NaAc溶液梯度洗脱，分部收集流份，以苯酚-硫酸法测定，合并单一峰位，再分别经Sephacryl s-300反复柱层析，合并主峰部位，得到白色无定形粉末状的ZJ-9，ZJ-10两个多糖组分。
2.2 纯度测定
2.2.1 HPGPC法分别取ZJ-9，ZJ-10加水溶解, 进样，流动相为0.02%NaN3水溶液，流速为0.5 ml/min，示差折光检测。结果显示洗脱峰均为单一对称峰，说明为均一组分。
2.2.2 Sephacryl s-300凝胶柱层析法取ZJ-9、ZJ-10各10mg溶于10 ml水中，上样于预先平衡好的Sephacryl s-300(3 cm×60 cm)柱，用0.2 mol/LNaAc洗脱, 以苯酚-硫酸法显色，于721分光光度计上测定吸收度，测定波长为490 nm，结果洗脱峰均为单一峰，进一步表明两个样品为均一组分。
2.3 分子量测定称取Pullulan P-82系列多糖标样，溶于0.02% NaN3中，进行HPGPC分析，以LogMW对RT作图得标准曲线, 同法测出ZJ-9，ZJ-10的保留时间，从标准曲线上求出分子量。
2.4 结构研究
2.4.1 完全酸水解取ZJ-9，ZJ-10各5 mg，分别加2 mol/L CF3COOH溶液5 ml，封管，110℃水解5 h，减压浓缩，以甲醇处理多次，抽干，加1 ml水溶解，得完全酸水解产物水溶液。
2.4.2 纸层析检测多糖组成取各单糖标准品及样品的完全酸水解产物水溶液，进行纸层析。展开剂Ⅰ：醋酸乙酯吡啶乙酸水(5∶5∶1∶3，V/V)；展开剂Ⅱ：正丁醇-乙醇-水(4∶1∶5，V/V)。显色剂：苯胺邻苯二甲酸。
2.4.3 HPLC检测多糖组成取完全酸水解产物水溶液，过0.45 μm滤膜，用HPLC进行分析测定。同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡葡糖、岩藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸进行对照，在相同的色谱条件下根据标准糖的保留时间确定单糖的组成，根据峰面积积分得出各组分的摩尔比。
HPLC条件：色谱仪用日本岛津公司LC-10A；CLASS-LC10液相色谱工作站；检测器用RID-10A；色谱柱用Shim-pack SCR-101C(7.9 mm×30 cm)；柱温80℃；流动相高纯水；流速10 ml/min。
2.4.4 NMR的测定取ZJ-9，ZJ-10约10 mg溶于0.5 ml D2O, 于常温测定,TMS为内标。
3 实验结果
3.1 分子量测定HPGPC测定各多糖标准品系列在μ-Bondagel E-1000柱上的保留时间，以LogMW对RT作图得标准曲线见图1。同法测出ZJ-9，ZJ-10的保留时间，从标准曲线上求出其分子量为5 244，4 615。
图1 HPGPC测定各多糖的分子量的标准曲线(略)
3.2 单糖组成分析酸水解产物经PC、HPLC分析表明，ZJ-9由甘露糖和岩藻糖组成，摩尔比为2.37∶1；ZJ-10由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为1∶6.9∶10.3。
3.3 13C NMR谱图分析见图2～3。ZJ-10:13C NMR(δ，ppm，CDCl3)样品主链数据为：107.1，81.3，76.6，83.9，61.1，107.1(C-1)说明端基碳的构型为β-苷键。与文献[1]甲基βL阿拉伯呋喃糖化学位移比较接近，其中C-2向低场移动4 ppm，说明在C-2位发生取代。因此，ZJ-10是以β(1→2) -阿拉伯呋喃糖为主链的中性杂多糖。
ZJ-9:13C NMR(δ，ppm, CDCl3)主链数据为: 107.418(C-1), 81.24(C-2), 76.54(C-3), 83.88(C-4), 61.08(C-5)。与文献[1]甲基β甘露糖化学位移接近，其中C-3向低场移动5.5 ppm，说明在C-3位发生取代，该数据与文献[2]中-[βMan((1→3)]结构的碳化学位移数据一致,说明ZJ-9是以βMan(1→3)为主链，岩藻糖在末端或支链相联。
图2 ZJ-10的13C NMR谱(略)
图3 ZJ-9的13C NMR谱(略)
4 讨论
ZJ-9、ZJ-10均为白色粉末，极易吸潮, 易溶于水，尤易溶于热水，不溶于无水乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂，水溶液呈透明粘稠状。硫酸-苯酚法中显紫红色，说明为糖类化合物。咔唑-硫酸反应呈蓝绿色,说明不含糖醛酸。紫外光谱在200～400 nm没有吸收，说明不含核酸、蛋白质。
ZJ-9、ZJ-10的HPGPC及Sephacryls-300凝胶柱层析显示单一对称峰，说明为均一组分，完全酸水解产物经PC和HPLC分析表明，ZJ-9由甘露糖和岩藻糖组成，摩尔比为2.37∶1,13C NMR分析得出ZJ-9以β-Man(1→3)为主链，岩藻糖在末端或支链相联； ZJ-10由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1∶6.9∶10.3，即以阿拉伯糖为主链，13C NMR分析得出ZJ-10以β-(1→2) -阿拉伯呋喃糖为主链，葡萄糖、半乳糖在末端或支链相联。
参考文献：
[1] 于德泉，杨峻山，谢晶曦.分析化学手册(第5分册)[M].北京：化学工业出版社，1989：824824.
[2] 张维杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社,1994：246250.
基金项目：河南省重大科技攻关资助项目(No.984021200)
(河南中医学院，河南 郑州 450008； 河南省范县人民医院 457500), 百拇医药(杨云， 弓建红， 冯卫生， 马相斌)
关键词：大枣； 多糖； 分离纯化； 结构测定
Studies on the Neutral Polysaccharides of Zizyphus jujube Mill
YANG Yun, GONG Jianhong, FENG Weisheng, MA Xiangbin
(Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou, Henan 450008, Chinan; People's Hospital of Fan County,Fanxian ,Henan 457500,China)
Abstract:Objective:Systematic chemical studies on polysaccharide ,the main activity components in Zizyphus Jujube Mill were done.Methods:Zizyphus Jujuba Mill was extracted with ethanol and 80-100℃water,the water elution was concentrated at reduce pressure, fractions ZJ-A，ZJ-B，ZJ-C were obtained by fractional precipitation of the water elution with ethanol. And then protein was cleared by CCl3COOH.Results:While ZJ-9 and ZJ-10 were obtained by further purification of ZJ-C with DEAE-Cellulose and Sepchcryls-300, the molecular weight of ZJ-9 and ZJ-10 were estimated to be 5 244, 4 615 with GPC. Spectral analysis (UV, IR,13C NMR, HPLC) were used to investigated the structural characterization of polysaccharides.Conclusion:The ZJ-10'main chain is (1→2)-linked β-D-anabinofuranose , and its side chains include glucose,galactose. The ZJ-9'main chain is (1→3)-linked β-D-mannose , and its side chains include fucose.
Key words:Zizyphus Jujuba Mill; Polysaccharide; Purification; Structure
大枣为鼠李科植物枣(Zizyphus jujube Mill)的干燥成熟果实，为中医临床常用的医疗保健药材,具有补中益气，养血安神之功效，用于脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁之症。本课题组的药理研究表明：大枣多糖可以提高衰老模型小鼠血SOD，CAT，GSH-PX活力，降低血浆肝匀浆及脑匀浆中LPO水平；促进正常及免疫抑制小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬功能, 促进溶血素和溶血空斑形成，促进淋巴细胞转化；对大小鼠血虚模型、气血双虚模型有较好改善作用。新郑大枣为河南特产，对其多糖的研究国内外未见报道，为深入开发大枣这一丰富的自然资源，本文对其多糖成分进行了较系统研究，从中分离得到均一多糖ZJ-9，ZJ-10，并对其进行结构表征。
1 材料与仪器
DEAE Cellulose为Whatman产品; Sephacryl S-300为Pharmacia产品; 测定分子量所用标准糖为Shodex Standard Pullulan P-82系列; 各种单糖标准品为Merck出品; CF3COOH为Flank出品; 其它试剂均为国产AR级。
BS-1OOA型自动部分收集器及HL-2型恒流泵为上海沪西机电厂产品; 721型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品; 核磁共振仪为Bruker AC-300; UV-2201紫外扫描仪为日本岛津产品; GPC测定仪为HP-1090M (带GPC软件); 示差折光仪为HP-1037A RI, 柱为u-Bondagel E-1000，均为美国惠普公司产品; 医用冷冻干燥机LGJ-II型为上海医用仪器厂。
2 实验方法
2.1 提取分离纯化 大枣干燥成熟果肉 (4.0kg) 以95%乙醇回流提取三次，药渣置于通风处晾干，用水于80～100℃连续温浸提取四次，合并提取液，浓缩至约4 000 m1，分别以20%，50%，80%乙醇依次分级沉淀，静置，虹吸上清液，下层沉淀离心，收集沉淀物，分别得到分级沉淀的褐色粗多糖。取80%醇沉粗多糖加水溶解，以30% CCl3COOH脱蛋白，静置，离心，上清液以碱液调pH=7，减压浓缩，浓缩液对水透析, 将透析袋内的溶液减压浓缩至适当体积，加入95%乙醇使其含醇量达85%，收集沉淀物，相继以高浓度乙醇、无水乙醇、丙酮及无水乙醚处理，迅速置P2O5真空干燥器中减压干燥，得除去部分杂质的粗多糖ZJ-C。
ZJ-C进行DEAE-Cellulose柱层析，0～1 mol/L NaAc溶液梯度洗脱，分部收集流份，以苯酚-硫酸法测定，合并单一峰位，再分别经Sephacryl s-300反复柱层析，合并主峰部位，得到白色无定形粉末状的ZJ-9，ZJ-10两个多糖组分。
2.2 纯度测定
2.2.1 HPGPC法分别取ZJ-9，ZJ-10加水溶解, 进样，流动相为0.02%NaN3水溶液，流速为0.5 ml/min，示差折光检测。结果显示洗脱峰均为单一对称峰，说明为均一组分。
2.2.2 Sephacryl s-300凝胶柱层析法取ZJ-9、ZJ-10各10mg溶于10 ml水中，上样于预先平衡好的Sephacryl s-300(3 cm×60 cm)柱，用0.2 mol/LNaAc洗脱, 以苯酚-硫酸法显色，于721分光光度计上测定吸收度，测定波长为490 nm，结果洗脱峰均为单一峰，进一步表明两个样品为均一组分。
2.3 分子量测定称取Pullulan P-82系列多糖标样，溶于0.02% NaN3中，进行HPGPC分析，以LogMW对RT作图得标准曲线, 同法测出ZJ-9，ZJ-10的保留时间，从标准曲线上求出分子量。
2.4 结构研究
2.4.1 完全酸水解取ZJ-9，ZJ-10各5 mg，分别加2 mol/L CF3COOH溶液5 ml，封管，110℃水解5 h，减压浓缩，以甲醇处理多次，抽干，加1 ml水溶解，得完全酸水解产物水溶液。
2.4.2 纸层析检测多糖组成取各单糖标准品及样品的完全酸水解产物水溶液，进行纸层析。展开剂Ⅰ：醋酸乙酯吡啶乙酸水(5∶5∶1∶3，V/V)；展开剂Ⅱ：正丁醇-乙醇-水(4∶1∶5，V/V)。显色剂：苯胺邻苯二甲酸。
2.4.3 HPLC检测多糖组成取完全酸水解产物水溶液，过0.45 μm滤膜，用HPLC进行分析测定。同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡葡糖、岩藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸进行对照，在相同的色谱条件下根据标准糖的保留时间确定单糖的组成，根据峰面积积分得出各组分的摩尔比。
HPLC条件：色谱仪用日本岛津公司LC-10A；CLASS-LC10液相色谱工作站；检测器用RID-10A；色谱柱用Shim-pack SCR-101C(7.9 mm×30 cm)；柱温80℃；流动相高纯水；流速10 ml/min。
2.4.4 NMR的测定取ZJ-9，ZJ-10约10 mg溶于0.5 ml D2O, 于常温测定,TMS为内标。
3 实验结果
3.1 分子量测定HPGPC测定各多糖标准品系列在μ-Bondagel E-1000柱上的保留时间，以LogMW对RT作图得标准曲线见图1。同法测出ZJ-9，ZJ-10的保留时间，从标准曲线上求出其分子量为5 244，4 615。
图1 HPGPC测定各多糖的分子量的标准曲线(略)
3.2 单糖组成分析酸水解产物经PC、HPLC分析表明，ZJ-9由甘露糖和岩藻糖组成，摩尔比为2.37∶1；ZJ-10由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为1∶6.9∶10.3。
3.3 13C NMR谱图分析见图2～3。ZJ-10:13C NMR(δ，ppm，CDCl3)样品主链数据为：107.1，81.3，76.6，83.9，61.1，107.1(C-1)说明端基碳的构型为β-苷键。与文献[1]甲基βL阿拉伯呋喃糖化学位移比较接近，其中C-2向低场移动4 ppm，说明在C-2位发生取代。因此，ZJ-10是以β(1→2) -阿拉伯呋喃糖为主链的中性杂多糖。
ZJ-9:13C NMR(δ，ppm, CDCl3)主链数据为: 107.418(C-1), 81.24(C-2), 76.54(C-3), 83.88(C-4), 61.08(C-5)。与文献[1]甲基β甘露糖化学位移接近，其中C-3向低场移动5.5 ppm，说明在C-3位发生取代，该数据与文献[2]中-[βMan((1→3)]结构的碳化学位移数据一致,说明ZJ-9是以βMan(1→3)为主链，岩藻糖在末端或支链相联。
图2 ZJ-10的13C NMR谱(略)
图3 ZJ-9的13C NMR谱(略)
4 讨论
ZJ-9、ZJ-10均为白色粉末，极易吸潮, 易溶于水，尤易溶于热水，不溶于无水乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂，水溶液呈透明粘稠状。硫酸-苯酚法中显紫红色，说明为糖类化合物。咔唑-硫酸反应呈蓝绿色,说明不含糖醛酸。紫外光谱在200～400 nm没有吸收，说明不含核酸、蛋白质。
ZJ-9、ZJ-10的HPGPC及Sephacryls-300凝胶柱层析显示单一对称峰，说明为均一组分，完全酸水解产物经PC和HPLC分析表明，ZJ-9由甘露糖和岩藻糖组成，摩尔比为2.37∶1,13C NMR分析得出ZJ-9以β-Man(1→3)为主链，岩藻糖在末端或支链相联； ZJ-10由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，摩尔比为1∶6.9∶10.3，即以阿拉伯糖为主链，13C NMR分析得出ZJ-10以β-(1→2) -阿拉伯呋喃糖为主链，葡萄糖、半乳糖在末端或支链相联。
参考文献：
[1] 于德泉，杨峻山，谢晶曦.分析化学手册(第5分册)[M].北京：化学工业出版社，1989：824824.
[2] 张维杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社,1994：246250.
基金项目：河南省重大科技攻关资助项目(No.984021200)
(河南中医学院，河南 郑州 450008； 河南省范县人民医院 457500), 百拇医药(杨云， 弓建红， 冯卫生， 马相斌)