高效液相色谱法测定芹菜籽中3正丁基苯酞的含量
摘要：目的高效液相色谱(HPLC)法测定芹菜籽中3-正丁基苯酞的含量。方法采用YMC ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈酯酸钠(45∶55)，酯酸钠0.05 mol·L-1，冰酯酸调节pH4.6；检测波长为228 nm；流速为1.0 ml·min-1；柱温：40℃。结果3-正丁基苯酞在0.044 1 ~0.161 7μg范围内线性关系良好，r= 0.999 7，方法的回收率为98.19%，RSD为1.38%(n=5)。结论 该方法能够准确可靠地测定3-正丁基苯酞的含量，可作为芹菜籽的质量控制指标之一。
关键词：芹菜籽； 3-正丁基苯酞； 高效液相色谱法
Determination of 3-n-Butylphthalide in Celery Seed by HPLC
GU Dongyu，L Jinliang，GULINAR Sabir，HajiAkber Aisa*
(Xinjiang Key Laboratory of Plant Resources and Natural Products Chemistry，Xinjiang Technological Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011，China；Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China；Xinjiang Institute of Chinese Material Medica and Ethica, Urumqi 830002，China)
Abstract：ObjectiveTo establish a method for determining 3-n-butylphthalide in Celery Seed by HPLC.MethodsYMC C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm) was used. The mobile phase consisted of acetonitrile-sodium acetate(45∶55) with flow rate 1.0 ml·min-1. The detection wavelength was set at 228 nm and the column temperature was 40℃. ResultsThe linear range of 3-n-butylphthalide was at the range of 0.044 1 ~0.161 7 μg (r=0.999 7，n=5) ，the average recovery was 98.19%，and RSD was 1.38%(n=5). ConclusionThe method is rapid, highly accurate and precise. It can be used to control the quality of Celery Seed.
Key words：Celery Seed; 3-n-butylphthalide; HPLC
芹菜籽是伞形科旱芹属植物芹菜Apium graveolens L.的种子。在我国维吾尔医药中主要用于治疗高血压病、关节炎、类风湿关节炎、气滞性子宫炎、腹水、肾脏等疾病[1]。3正丁基苯酞(3nbutylphthalide)是从芹菜籽中提取的药理活性成分，目前已经被开发成脑血管病领域的国家一类新药，具有抗脑缺血、减轻脑损伤等作用[2，3]。因此有必要对芹菜籽中特征性成分进行定性、定量研究。本实验以HPLC法测定芹菜籽中3-正丁基苯酞，为科学评价芹菜籽的药材质量，制定规范、合理、可行的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
Waters公司MICROMASS ZQ液质联用仪(Waters 996型二极管阵列检测器，Waters 2690液相分离系统)； METTLER TOLEDO DELTA 320 pH计。乙腈(色谱纯，USA Tedia公司)；Triton X-100(Sigma公司)；三水乙酸钠(C2H3NaO2·3H2O，优级纯，天津市光复精细化工研究所)；冰乙酸(分析纯，北京化工厂)。 3正丁基苯酞对照品(自制，质量分数99%)。芹菜籽经中科院新疆生态与地理研究所克力木副研究员鉴定。
2 方法与结果
2.1 色谱条件YMC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈酯酸钠(V∶V=45∶55)；酯酸钠0.05 mol·L-1，冰酯酸调节pH 4.6；体积流量1.0 ml·min-1；检测波长228 nm；柱温40℃。
2.2 对照品溶液的制备取标准品14.7 mg，置于10 ml容量瓶中，加入1 ml 10% Triton X-100振摇使溶解后用流动相定容，摇匀，作为贮备液；移取贮备液1 ml置于100 ml容量瓶中，用流动相定容，摇匀，制成3正丁基苯酞质量浓度为0.014 7 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备称取干燥的芹菜籽10 g，分别用100，80 ml和60 ml的70%乙醇回流3，2 h和1 h，总共提取3次，合并滤液，浓缩得到的粗提物水分散后用8倍体积的石油醚萃取5次，得到石油醚萃取的样品。取38.7 mg样品， 置于25 ml容量瓶中，加入2 ml 10% Triton X-100振摇使溶解后用流动相定容，摇匀，作为贮备液；移取贮备液1 ml置于10 ml容量瓶中，用流动相定容，摇匀，作为供试品的溶液(0.155 mg/ml)。
2.4 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液，分别进样3，5，7，9，11 μl，记录各样品的色谱图。以对照品溶液进样量C为横坐标，峰面积A为纵坐标作标准曲线，结果表明3-正丁基苯酞在0.044 1 ~0.161 7μg范围内线性关系良好，回归方程：A =21 734 000 C + 23 475，r= 0.999 7。空白对照、对照品和供试品的色谱图分别见图1~3。
图1 空白对照色谱图(略)
图2 对照品色谱图(略)
图3 供试品色谱图(略)
2.5 精密度实验精密吸取0.014 7 mg/ml 3正丁基苯酞对照品溶液，连续进样6次，5μl/次，按上述色谱条件测定，峰面积分别为1 647 597，1 626 279，1 645 968，1 665 844，1 639 422，1 614 002，RSD=1.10%，表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性实验 精密吸取供试品溶液(0.155 mg/ml)5 μl，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，按上述色谱条件测定，峰面积分别为1 568 873，1 622 012，1 588 530，1 615 787，1 600 297，1 622 424，RSD为1.33%，表明供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.7 重现性实验取同一批的样品5份，按上述样品溶液的制备操作和色谱条件测定，RSD=0.77%(n=5)。结果显示，该方法具有较好的重现性。
2.8 加样回收率实验取已知含量的样品，精密加入一定量的对照品，平行操作5份，按上述条件进行测定。结果见表1。
表1 加样回收率实验(略)
2.9 样品的测定按2.3方法制备样品，按2.1色谱条件对3批样品进行含量测定。结果见表2。
表2 样品测定结果(略)
3 讨论
3.1 本实验考察冷浸和热提萃取处理两种提取方式，结果采用乙醇提取石油醚萃取得到的含量比冷浸处理得到的含量高，提取更完全，故采用热提萃取法。
3.2 对照品和供试品均为油状物，所以加入表面活性剂Triton X-100促其溶解，为保证基线平稳，Triton X-100的加入量控制在1%。
参考文献：
[1] 新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准(上册)[S].1993：8.
[2] 赵春顺，崔升淼，刘晓红，等. 3正丁基苯酞含量及有关物质测定的方法学研究[J].沈阳药科大学学报，2004,21(1):24.
[3] Chang Q, Wang X L. Effects of chiral 3-n-butylphthalide on apoptosis induced by transient focal cerebral ischemia in rats[J].Acta Pharmacol Sin ,2003 , 24 (8): 796.
基金项目：中国科学院中药现代化资助项目(No.KGCX2-SW-213-08)
新疆自治区高技术研究与发展计划项目(No.200515123)
(中国科学院新疆理化技术研究所,新疆植物资源化学重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830011；中国科学院研究生院,北京 100039；新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002), http://www.100md.com(顾冬雨， 吕金良， 古丽娜·沙比尔， 阿吉艾克拜尔·艾萨)
关键词：芹菜籽； 3-正丁基苯酞； 高效液相色谱法
Determination of 3-n-Butylphthalide in Celery Seed by HPLC
GU Dongyu，L Jinliang，GULINAR Sabir，HajiAkber Aisa*
(Xinjiang Key Laboratory of Plant Resources and Natural Products Chemistry，Xinjiang Technological Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011，China；Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China；Xinjiang Institute of Chinese Material Medica and Ethica, Urumqi 830002，China)
Abstract：ObjectiveTo establish a method for determining 3-n-butylphthalide in Celery Seed by HPLC.MethodsYMC C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm) was used. The mobile phase consisted of acetonitrile-sodium acetate(45∶55) with flow rate 1.0 ml·min-1. The detection wavelength was set at 228 nm and the column temperature was 40℃. ResultsThe linear range of 3-n-butylphthalide was at the range of 0.044 1 ~0.161 7 μg (r=0.999 7，n=5) ，the average recovery was 98.19%，and RSD was 1.38%(n=5). ConclusionThe method is rapid, highly accurate and precise. It can be used to control the quality of Celery Seed.
Key words：Celery Seed; 3-n-butylphthalide; HPLC
芹菜籽是伞形科旱芹属植物芹菜Apium graveolens L.的种子。在我国维吾尔医药中主要用于治疗高血压病、关节炎、类风湿关节炎、气滞性子宫炎、腹水、肾脏等疾病[1]。3正丁基苯酞(3nbutylphthalide)是从芹菜籽中提取的药理活性成分，目前已经被开发成脑血管病领域的国家一类新药，具有抗脑缺血、减轻脑损伤等作用[2，3]。因此有必要对芹菜籽中特征性成分进行定性、定量研究。本实验以HPLC法测定芹菜籽中3-正丁基苯酞，为科学评价芹菜籽的药材质量，制定规范、合理、可行的质量控制提供依据。
1 仪器与试药
Waters公司MICROMASS ZQ液质联用仪(Waters 996型二极管阵列检测器，Waters 2690液相分离系统)； METTLER TOLEDO DELTA 320 pH计。乙腈(色谱纯，USA Tedia公司)；Triton X-100(Sigma公司)；三水乙酸钠(C2H3NaO2·3H2O，优级纯，天津市光复精细化工研究所)；冰乙酸(分析纯，北京化工厂)。 3正丁基苯酞对照品(自制，质量分数99%)。芹菜籽经中科院新疆生态与地理研究所克力木副研究员鉴定。
2 方法与结果
2.1 色谱条件YMC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈酯酸钠(V∶V=45∶55)；酯酸钠0.05 mol·L-1，冰酯酸调节pH 4.6；体积流量1.0 ml·min-1；检测波长228 nm；柱温40℃。
2.2 对照品溶液的制备取标准品14.7 mg，置于10 ml容量瓶中，加入1 ml 10% Triton X-100振摇使溶解后用流动相定容，摇匀，作为贮备液；移取贮备液1 ml置于100 ml容量瓶中，用流动相定容，摇匀，制成3正丁基苯酞质量浓度为0.014 7 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备称取干燥的芹菜籽10 g，分别用100，80 ml和60 ml的70%乙醇回流3，2 h和1 h，总共提取3次，合并滤液，浓缩得到的粗提物水分散后用8倍体积的石油醚萃取5次，得到石油醚萃取的样品。取38.7 mg样品， 置于25 ml容量瓶中，加入2 ml 10% Triton X-100振摇使溶解后用流动相定容，摇匀，作为贮备液；移取贮备液1 ml置于10 ml容量瓶中，用流动相定容，摇匀，作为供试品的溶液(0.155 mg/ml)。
2.4 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液，分别进样3，5，7，9，11 μl，记录各样品的色谱图。以对照品溶液进样量C为横坐标，峰面积A为纵坐标作标准曲线，结果表明3-正丁基苯酞在0.044 1 ~0.161 7μg范围内线性关系良好，回归方程：A =21 734 000 C + 23 475，r= 0.999 7。空白对照、对照品和供试品的色谱图分别见图1~3。
图1 空白对照色谱图(略)
图2 对照品色谱图(略)
图3 供试品色谱图(略)
2.5 精密度实验精密吸取0.014 7 mg/ml 3正丁基苯酞对照品溶液，连续进样6次，5μl/次，按上述色谱条件测定，峰面积分别为1 647 597，1 626 279，1 645 968，1 665 844，1 639 422，1 614 002，RSD=1.10%，表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性实验 精密吸取供试品溶液(0.155 mg/ml)5 μl，分别在0，2，4，6，8，10 h进样，按上述色谱条件测定，峰面积分别为1 568 873，1 622 012，1 588 530，1 615 787，1 600 297，1 622 424，RSD为1.33%，表明供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.7 重现性实验取同一批的样品5份，按上述样品溶液的制备操作和色谱条件测定，RSD=0.77%(n=5)。结果显示，该方法具有较好的重现性。
2.8 加样回收率实验取已知含量的样品，精密加入一定量的对照品，平行操作5份，按上述条件进行测定。结果见表1。
表1 加样回收率实验(略)
2.9 样品的测定按2.3方法制备样品，按2.1色谱条件对3批样品进行含量测定。结果见表2。
表2 样品测定结果(略)
3 讨论
3.1 本实验考察冷浸和热提萃取处理两种提取方式，结果采用乙醇提取石油醚萃取得到的含量比冷浸处理得到的含量高，提取更完全，故采用热提萃取法。
3.2 对照品和供试品均为油状物，所以加入表面活性剂Triton X-100促其溶解，为保证基线平稳，Triton X-100的加入量控制在1%。
参考文献：
[1] 新疆维吾尔自治区卫生厅.维吾尔药材标准(上册)[S].1993：8.
[2] 赵春顺，崔升淼，刘晓红，等. 3正丁基苯酞含量及有关物质测定的方法学研究[J].沈阳药科大学学报，2004,21(1):24.
[3] Chang Q, Wang X L. Effects of chiral 3-n-butylphthalide on apoptosis induced by transient focal cerebral ischemia in rats[J].Acta Pharmacol Sin ,2003 , 24 (8): 796.
基金项目：中国科学院中药现代化资助项目(No.KGCX2-SW-213-08)
新疆自治区高技术研究与发展计划项目(No.200515123)
(中国科学院新疆理化技术研究所,新疆植物资源化学重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830011；中国科学院研究生院,北京 100039；新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002), http://www.100md.com(顾冬雨， 吕金良， 古丽娜·沙比尔， 阿吉艾克拜尔·艾萨)