金贝清肺颗粒体内抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究
摘要：目的观察金贝清肺颗粒的体内抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用。方法采用小鼠体内感染呼吸道合胞病毒实验观察金贝清颗粒的抗病毒作用。结果金贝清肺颗粒能抑制呼吸道合胞病毒在小鼠体内的增殖。结论金贝清肺颗粒具有明显的体内抗呼吸道合胞病毒作用。
关键词：金贝清肺颗粒； 呼吸道合胞病毒； 小鼠； 抗病毒
Study on in Vivo Anti-respiratory Syncyntial Virus Activity of Jinbeiqingfei Granule (JBKL)
XU Xia, SUI Zaiyun, SUI Liyun
(Shandong Chest Hospital ,Jinan 250013,China; Shandong Academy of TCM,Jinan 250014,China; Weifang Medical College,Weifang 261042,China)
Abstract：ObjectiveThe anti-RSV effect of Jinbeiqingfei Granule (JBKL) in vivo was studied in this paper.MethodsThe amount of RSV in lung and the death rate of mice were observed in the mice infected with virus from nose.The antiRSV activity of JBKL was study in vivo.ResultsThe JBKL had significant antiRSV effects in vivo.ConclusionThe JBKL has antiRSV effects.
Key words：Jinbeiqingfei KeLi(JBKL); Respiratory syncyntial virus; Mouse; Antivirus
金贝清肺颗粒由金银花、连翘、桔梗、枇杷、石膏等10味中药组成，具有清热解毒、化痰止咳、宣肺平喘之功效，对风热感冒具有良好疗效。本文报道其体内抗病毒作用的实验研究。
1 材料与仪器
1.1 受试药物金贝清肺颗粒，由山东省中医药研究院制剂室提供，批号20040328；病毒唑，烟台第二制药厂，批号20040221；苦甘冲剂，青岛国风药业有限公司，批号，20031119；2.4二硝基苯酚，上海试剂三厂，危规号71016，批号000522。
1.2 病毒毒种呼吸道合胞病毒(RSV)Long株引自中国预防医学科学院病毒所毒种室。
1.3 细胞Hep2(人喉癌细胞系)，山东省医学科学院基础所微生物室提供。
1.4 试剂RPMI1640细胞培养液，GIBCO产品，含10%新生牛血清；RPMI1640细胞维持液，GIBCO公司产品，含2%新生牛血清。
1.5 仪器CO2恒温培养箱，美国Fomas公司产品；净化工作台，济南隆宏公司产品；台式低温离心机，贺立氏公司产品；-80℃冰箱，美国FOMAS公司产品；-20℃冰箱，中国青岛得贝公司产品；酶标仪，芬兰雷勃公司产品；多孔培养板，GIBCO公司产品。
1.6 动物BALB/C小鼠，雄性，体重16～18 g，引自山东大学生动物中心，SPF级动物许可证号：SCXX(鲁)2003004，实验动物质量合格证：No.0000135。
2 方法和结果
2.1 病毒体内毒力滴定方法和结果BALB/C小鼠60只，雄性，体重16～18 g。将动物随机分为6组，乙醚麻醉下按表1鼻腔接种不同剂量呼吸道合胞病毒(RSV)，普通饲料喂养7 d。结果见表1。根据表1毒力滴定结果，选择15 μl剂量动物(存活率80%)用于动物体内感染模型。
表1 体内抗病毒力滴定结果(略)
2.2 金贝清肺颗粒体内抗病毒实验[1]
2.2.1 体内染病毒及给药方法 BALB/C小鼠80只，雄性，体重16～18 g。将动物按体重随机分为8组：正常对照组、病毒模型对照组、病毒唑对照组和金贝清肺颗粒2.89，1.45， 0.72， 0.36， 0.18 g/kg5个剂量组，每组10只，普通饲料喂养。动物分组后，灌胃给予相应药物，病毒唑组动物每日肌肉注射病毒唑(每公斤体重量10 mg，即：0.1 ml/20 g体重鼠)，正常组和模型组灌胃以生理盐水。3 d后，除正常组外其余各组动物均乙醚麻醉下鼻腔接种呼吸道合胞病毒(TCID50为10-9/ml)15 μl，正常组接种等容量的生理盐水，继续给药7 d。每日观察动物存活情况，死亡动物及时做解剖，无菌条件下取肺组织-80℃冻存，备做病毒含量检测。在末次给药40 min后，将动物眼静脉丛取血，牵颈臼处死，无菌取肺组织，做肺组织病毒含量检测。
2.2.2 动物肺组织病毒定量检测方法[2]将肺组织用玻璃匀浆器匀浆，加等体积(加300 μl，为1∶1比例稀释)的细胞维持液吹打悬浮，高速离心(10 000 r/min)10 min，然后按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释度依次加入96孔板内已经长成单层的Hep-2细胞上。第11，12列为细胞对照。37℃，5%CO2培养，每日观察细胞病变，连续观察7 d。7 d后，将细胞维持液吸弃，用中性红染液染色，用酶标仪在540 nm读取OD值，用公式1，2计算细胞病变率，然后公式3计算比距，Reed，Muench方法获得TCID50，然后求得每组动物肺组织病毒含量指数的几何均数，肺组织含病毒毒力下降一个指数判断有效。
细胞存活率=(各组OD值空白对照OD值) (正常细胞OD值空白对照OD值)……(公式1)
细胞病变率=1-细胞存活率……(公式2)
细胞比距= (高于50%病变率-50%) (高于50%病变率低于-50%病变率)……(公式3)
G=(G1G2……Gn)1/n
2.3 金贝清肺颗粒体内抗病毒结果
2.3.1 动物一般情况病毒对照组动物于接种病毒后4 d开始有病死发生，死亡率经χ2检验。结果见表2。金贝清肺颗粒2.89，1.45 g/kg剂量组动物死亡率为0，与模型组的30%比死亡率明显减少。
表2 金贝清肺颗粒的体内抗病毒实验结果(略)
与模型组比较*P<0.05；n=10
2.3.2 动物肺组织病毒含量金贝清肺颗粒2.89，1.45 g/kg剂量组动物肺组织病毒含量都下降为零，金贝清肺颗粒0.72，0.36 g/kg剂量组动物肺组织病毒含量分别为0.897， 1.346，以上4个剂量组动物的肺组织病毒含量与模型对照组(2.689)比较下降均超过一个指数。而前3个剂量组2.89，1.45，0.72 g/kg的动物肺组织病毒含量与病毒唑组(2.202)比较下降均超过一个指数。表明金贝清肺颗粒从0.36 g/kg剂量开始对小鼠体内呼吸道合胞病毒具有明显的抑制作用，该作用在0.72 g/kg以上明显优于病毒唑 。
3 讨论
呼吸道合胞病毒是引起呼吸道感染的重要病原，幼儿感染可发生严重肺炎。金贝清肺颗粒所含金银花、连翘等具有抗病毒作用[3，4]。将金贝清肺颗粒用于病毒肺炎动物模型，在0.18～2.89 g/kg间选5个剂量观察金贝清肺颗粒对小鼠体内感染呼吸道合胞病毒性肺炎的影响。结果显示该药物在0.36 g/kg剂量开始对呼吸道合胞病毒有抑制作用，到1.45 g/kg剂量即可完全抑制呼吸道合胞病毒在肺组织的增殖，而使动物免于感染呼吸道合胞病毒性肺炎，该作用在0.72 g/kg剂量以上明显优于病毒唑。
参考文献：
[1] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991：311.
[2] 邓文龙，徐嘉红. 热毒平解热作用研究[J].中药药理与临床，1995，11(3)：12.
[3] 张美芳，董 岩.金银花黄芪溶液抑制水痘带状疱疹病毒作用的实验研究[J].齐鲁医学杂志，2003，18(2)：156.
[4] 刘颖娟，杨占秋，肖 红，等.中药连翘有效成分体外抗单纯疱疹病毒的实验研究[J].湖北中医学院学报，2004，6(1)：36.
(山东省胸科医院，山东 济南 250013； 山东省中医药研究院，山东 济南 250014；潍坊医学院，山东 潍坊 261042), http://www.100md.com(徐霞，隋在云，隋丽云)
关键词：金贝清肺颗粒； 呼吸道合胞病毒； 小鼠； 抗病毒
Study on in Vivo Anti-respiratory Syncyntial Virus Activity of Jinbeiqingfei Granule (JBKL)
XU Xia, SUI Zaiyun, SUI Liyun
(Shandong Chest Hospital ,Jinan 250013,China; Shandong Academy of TCM,Jinan 250014,China; Weifang Medical College,Weifang 261042,China)
Abstract：ObjectiveThe anti-RSV effect of Jinbeiqingfei Granule (JBKL) in vivo was studied in this paper.MethodsThe amount of RSV in lung and the death rate of mice were observed in the mice infected with virus from nose.The antiRSV activity of JBKL was study in vivo.ResultsThe JBKL had significant antiRSV effects in vivo.ConclusionThe JBKL has antiRSV effects.
Key words：Jinbeiqingfei KeLi(JBKL); Respiratory syncyntial virus; Mouse; Antivirus
金贝清肺颗粒由金银花、连翘、桔梗、枇杷、石膏等10味中药组成，具有清热解毒、化痰止咳、宣肺平喘之功效，对风热感冒具有良好疗效。本文报道其体内抗病毒作用的实验研究。
1 材料与仪器
1.1 受试药物金贝清肺颗粒，由山东省中医药研究院制剂室提供，批号20040328；病毒唑，烟台第二制药厂，批号20040221；苦甘冲剂，青岛国风药业有限公司，批号，20031119；2.4二硝基苯酚，上海试剂三厂，危规号71016，批号000522。
1.2 病毒毒种呼吸道合胞病毒(RSV)Long株引自中国预防医学科学院病毒所毒种室。
1.3 细胞Hep2(人喉癌细胞系)，山东省医学科学院基础所微生物室提供。
1.4 试剂RPMI1640细胞培养液，GIBCO产品，含10%新生牛血清；RPMI1640细胞维持液，GIBCO公司产品，含2%新生牛血清。
1.5 仪器CO2恒温培养箱，美国Fomas公司产品；净化工作台，济南隆宏公司产品；台式低温离心机，贺立氏公司产品；-80℃冰箱，美国FOMAS公司产品；-20℃冰箱，中国青岛得贝公司产品；酶标仪，芬兰雷勃公司产品；多孔培养板，GIBCO公司产品。
1.6 动物BALB/C小鼠，雄性，体重16～18 g，引自山东大学生动物中心，SPF级动物许可证号：SCXX(鲁)2003004，实验动物质量合格证：No.0000135。
2 方法和结果
2.1 病毒体内毒力滴定方法和结果BALB/C小鼠60只，雄性，体重16～18 g。将动物随机分为6组，乙醚麻醉下按表1鼻腔接种不同剂量呼吸道合胞病毒(RSV)，普通饲料喂养7 d。结果见表1。根据表1毒力滴定结果，选择15 μl剂量动物(存活率80%)用于动物体内感染模型。
表1 体内抗病毒力滴定结果(略)
2.2 金贝清肺颗粒体内抗病毒实验[1]
2.2.1 体内染病毒及给药方法 BALB/C小鼠80只，雄性，体重16～18 g。将动物按体重随机分为8组：正常对照组、病毒模型对照组、病毒唑对照组和金贝清肺颗粒2.89，1.45， 0.72， 0.36， 0.18 g/kg5个剂量组，每组10只，普通饲料喂养。动物分组后，灌胃给予相应药物，病毒唑组动物每日肌肉注射病毒唑(每公斤体重量10 mg，即：0.1 ml/20 g体重鼠)，正常组和模型组灌胃以生理盐水。3 d后，除正常组外其余各组动物均乙醚麻醉下鼻腔接种呼吸道合胞病毒(TCID50为10-9/ml)15 μl，正常组接种等容量的生理盐水，继续给药7 d。每日观察动物存活情况，死亡动物及时做解剖，无菌条件下取肺组织-80℃冻存，备做病毒含量检测。在末次给药40 min后，将动物眼静脉丛取血，牵颈臼处死，无菌取肺组织，做肺组织病毒含量检测。
2.2.2 动物肺组织病毒定量检测方法[2]将肺组织用玻璃匀浆器匀浆，加等体积(加300 μl，为1∶1比例稀释)的细胞维持液吹打悬浮，高速离心(10 000 r/min)10 min，然后按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释度依次加入96孔板内已经长成单层的Hep-2细胞上。第11，12列为细胞对照。37℃，5%CO2培养，每日观察细胞病变，连续观察7 d。7 d后，将细胞维持液吸弃，用中性红染液染色，用酶标仪在540 nm读取OD值，用公式1，2计算细胞病变率，然后公式3计算比距，Reed，Muench方法获得TCID50，然后求得每组动物肺组织病毒含量指数的几何均数，肺组织含病毒毒力下降一个指数判断有效。
细胞存活率=(各组OD值空白对照OD值) (正常细胞OD值空白对照OD值)……(公式1)
细胞病变率=1-细胞存活率……(公式2)
细胞比距= (高于50%病变率-50%) (高于50%病变率低于-50%病变率)……(公式3)
G=(G1G2……Gn)1/n
2.3 金贝清肺颗粒体内抗病毒结果
2.3.1 动物一般情况病毒对照组动物于接种病毒后4 d开始有病死发生，死亡率经χ2检验。结果见表2。金贝清肺颗粒2.89，1.45 g/kg剂量组动物死亡率为0，与模型组的30%比死亡率明显减少。
表2 金贝清肺颗粒的体内抗病毒实验结果(略)
与模型组比较*P<0.05；n=10
2.3.2 动物肺组织病毒含量金贝清肺颗粒2.89，1.45 g/kg剂量组动物肺组织病毒含量都下降为零，金贝清肺颗粒0.72，0.36 g/kg剂量组动物肺组织病毒含量分别为0.897， 1.346，以上4个剂量组动物的肺组织病毒含量与模型对照组(2.689)比较下降均超过一个指数。而前3个剂量组2.89，1.45，0.72 g/kg的动物肺组织病毒含量与病毒唑组(2.202)比较下降均超过一个指数。表明金贝清肺颗粒从0.36 g/kg剂量开始对小鼠体内呼吸道合胞病毒具有明显的抑制作用，该作用在0.72 g/kg以上明显优于病毒唑 。
3 讨论
呼吸道合胞病毒是引起呼吸道感染的重要病原，幼儿感染可发生严重肺炎。金贝清肺颗粒所含金银花、连翘等具有抗病毒作用[3，4]。将金贝清肺颗粒用于病毒肺炎动物模型，在0.18～2.89 g/kg间选5个剂量观察金贝清肺颗粒对小鼠体内感染呼吸道合胞病毒性肺炎的影响。结果显示该药物在0.36 g/kg剂量开始对呼吸道合胞病毒有抑制作用，到1.45 g/kg剂量即可完全抑制呼吸道合胞病毒在肺组织的增殖，而使动物免于感染呼吸道合胞病毒性肺炎，该作用在0.72 g/kg剂量以上明显优于病毒唑。
参考文献：
[1] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1991：311.
[2] 邓文龙，徐嘉红. 热毒平解热作用研究[J].中药药理与临床，1995，11(3)：12.
[3] 张美芳，董 岩.金银花黄芪溶液抑制水痘带状疱疹病毒作用的实验研究[J].齐鲁医学杂志，2003，18(2)：156.
[4] 刘颖娟，杨占秋，肖 红，等.中药连翘有效成分体外抗单纯疱疹病毒的实验研究[J].湖北中医学院学报，2004，6(1)：36.
(山东省胸科医院，山东 济南 250013； 山东省中医药研究院，山东 济南 250014；潍坊医学院，山东 潍坊 261042), http://www.100md.com(徐霞，隋在云，隋丽云)