气相色谱/质谱化学计量学法分析测定药对桃仁红花挥发油
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李晓如 梁逸曾 郭方遒 李晓宁 曾仲大
药对桃仁红花,挥发油,气相色谱,质谱,化学计量学解析法,,药对桃仁红花，挥发油，气相色谱,质谱，化学计量学解析法,1引言,2实验部分,3结果与讨论,References
参见附件(1kb)。
摘要 药对是中药配伍中最基本、最常用的形式，具有中药配伍的基本特点。药对化学是复方化学的核心内容。联用色谱和化学计量学方法是分析中药复方复杂体系的有效工具。采用GC/MS法分离测定了药对桃仁红花、单味药桃仁和红花的挥发油成分，并对其重叠色谱峰采用化学计量学解析法进行了分辨，得到药对和各单味药的纯色谱曲线和质谱。药对桃仁红花、单味药桃仁和红花分辨出的色谱峰，通过质谱库对其进行定性，分别得到84、27和52个定性结果，占总含量的92.06%、89.43%和94%。实验结果表明：桃仁红花挥发油成分与单味药桃仁和红花的存在较大差别，也不是两者挥发油成分之加和。
关键词 药对桃仁红花，挥发油，气相色谱/质谱，化学计量学解析法
1 引言
配伍理论是中药复方的核心问题。配伍有两种形式，即两药之间的配伍(形成药对和对药方)和多药之间的配伍(构成复方)。显然，前者是后者的基础。可以说，药对是中药配伍的基本单位，其组成虽然简单，却具有中药配伍的基本特点，是从单味药到复方的桥梁，是中药配伍中最基本、最常用的形式[1~3]。所以，药对的研究将为中药复方的配伍研究提供最基本的依据，并揭示配伍理论的规律。另外，药对既是复方的一种特殊形式(对药方)，又是复方的组方基础。通过药对化学成分的研究，有利于复方的化学成分、特别是活性成分的研究，有利于复方的剖析与理解。药对桃仁红花源自《医宗金鉴》中的桃红四物汤，二药伍用，是活血化瘀常用药对之一[1~3]。桃仁苦甘性平，可破瘀行血，润燥滑肠，为破瘀行血常用之品；红花辛散温通，有活血通经，祛瘀止痛之功[4]。两药相须配对后祛瘀力增强，作用范围较单味药扩大，适用于全身各处瘀血，且有消肿止痛祛瘀生新之功，用于临床血脉瘀滞之症。本研究分别提取单味药桃仁、红花和药对桃仁红花的挥发油，利用气相色谱/质谱方法对挥发油进行检测，并采用化学计量学解析方法(chemometric resolution method, CRM)[5~12]对二维GC/MS数据进行处理，得到药对和两个单味药的纯色谱曲线和质谱，继而借质谱库对分辨的纯组分进行定性检索，用总体积积分法进行定量，最后比较了药对与单味药挥发油成分, 分析了单味药配伍后挥发油成分的变化。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂QP2010型气相色谱仪质谱仪(日本岛津公司)。桃仁、红花(河南南阳药材公司)，经湖南中医药研究院中药研究所鉴定。正己烷(分析纯，北京化工厂)。
2 药对挥发油提取称取干燥的桃仁(Semen persicae，SP),红花(Flos carthami, FC)各100 g，以1∶7加水混合，加热至沸腾，维持沸腾40 min，然后按中华人民共和国药典(2000年版)挥发油测定法甲法提取[13]。提取的挥发油溶于正己烷并置于冰箱保存。用相同的方法提取单味药挥发油。
2.3 气相色谱/质谱条件OV1 30 m 0.25 mm 色谱柱。 柱起始温度40℃2℃/min120℃10℃/min230℃(20 min)。He载气流速1.0 mL/min；进口温度250℃，界面温度280℃。EI源电子能量70 eV，离子源温度：230℃。倍增电压：1.28 kV，扫描范围20~600 amu；扫描速率：3.8 scans/s，溶剂延迟2 min。数据分析在PentiumШ850(Intel)计算机上进行，程序用Matlab6.1编写，所分辨的质谱在NIST107标准质谱库中检索。
3 结果与讨论
3.1 CRM解析CRM是对二维色谱/光谱矩阵数据进行解析的一种有效方法。它利用二维矩阵数据包含的色谱/光谱信息，采用局部因子分析以分辨出个组分的纯色谱曲线和光谱，其原理与解析方法见文献[5~12]。该方法已成功地应用于单味药苍术、厚朴和复方平胃散等挥发油的分析[8~11,14，15]。
3.2 挥发油化学成分的定性分析图1(a)、图1(b)和图1(c)分别是药对桃仁红花、桃仁和红花的挥发油化学成分GC/MS总离子流图(TIC)，其中许多色谱峰产生重叠, 甚至有些看似纯的色谱峰也是几个组分的重叠峰，所以，中药的挥发油是一个非常复杂的分析体系。 总离子流图1(b)中峰簇A的保留时间段为20.62~20.77 min，放大为图2 (b)。
图1 药对桃仁红花(a)、桃仁(b)和红花(c)挥发油的总离子流图(略)
Fig.1 TICs of volatile components of herbal pair Semen persicaeFlos carthami(HP SPFC)(a), SP(b) and FC(c)
图1b中的A峰簇看起来像是一个纯色谱峰，若直接从色谱库中进行检索，A峰簇前半部分不同位置质谱变化很大，且检索结果与被测质谱相似程度都很低。其中一个为Bicyclo[3.1.1]heptane6,6dimethyl3methylene，相似度仅为47%；而后半部分不同位置检索结果也不同，有的相似度较高，有的很低。如检索结果为betamyrene的化合物，相似度仅为53%。这样检索的定性结果其可靠程度和准确度都很低，同时由于色谱峰重叠，难以进行定量分析。利用CRM[5～12]分析，A峰簇是一个二组分体系(图2)。根据各组分的纯色谱曲线和质谱，再将它们与NIST标准库进行匹配，可检索到组分1、2分别为Vanillic acid 和Alphabutylbenzeneethanol,，相似度分别为90.26%，93.45%，其相应的质谱图如图3(a~d)。因为得到的是纯组分的质谱，定性结果的准确性和可靠程度大为增加。
图2 经解析后A峰的总离子流图(含组分1和2)(略)
Fig.2 Resolved chromatograms of the A peak cluster (containing component 1 and 2)
与上述解析A峰簇过程相似，对桃仁TIC图中其它保留时间段的组分和桃仁红花、红花TIC图，利用CRM逐步进行分辨，可得到组分的纯质谱，再用质谱库对分辨出的组分进行质谱定性检索，得到组分定性结果如表1。桃仁红花、桃仁和红花挥发油共分别分离出95,43和76个色谱峰，定性鉴定的组分分别为84,27和52个。
图3 A峰经CRM解析所得的质谱图(略)
Fig.3 Mass spectrum of the A peak cluster by chemometric resolution method (CRM)
a. 凡尼酸的标准质谱(sandard mass specrum of vanillic acid)； b. 凡尼酸的解析质谱(resolved mass spectrum of vanillic acid)； c. α丁基苯乙醇的标准质谱(standard mass spectrum of alphabutylbenzeneethanol)； d ......
摘要 药对是中药配伍中最基本、最常用的形式，具有中药配伍的基本特点。药对化学是复方化学的核心内容。联用色谱和化学计量学方法是分析中药复方复杂体系的有效工具。采用GC/MS法分离测定了药对桃仁红花、单味药桃仁和红花的挥发油成分，并对其重叠色谱峰采用化学计量学解析法进行了分辨，得到药对和各单味药的纯色谱曲线和质谱。药对桃仁红花、单味药桃仁和红花分辨出的色谱峰，通过质谱库对其进行定性，分别得到84、27和52个定性结果，占总含量的92.06%、89.43%和94%。实验结果表明：桃仁红花挥发油成分与单味药桃仁和红花的存在较大差别，也不是两者挥发油成分之加和。
关键词 药对桃仁红花，挥发油，气相色谱/质谱，化学计量学解析法
1 引言
配伍理论是中药复方的核心问题。配伍有两种形式，即两药之间的配伍(形成药对和对药方)和多药之间的配伍(构成复方)。显然，前者是后者的基础。可以说，药对是中药配伍的基本单位，其组成虽然简单，却具有中药配伍的基本特点，是从单味药到复方的桥梁，是中药配伍中最基本、最常用的形式[1~3]。所以，药对的研究将为中药复方的配伍研究提供最基本的依据，并揭示配伍理论的规律。另外，药对既是复方的一种特殊形式(对药方)，又是复方的组方基础。通过药对化学成分的研究，有利于复方的化学成分、特别是活性成分的研究，有利于复方的剖析与理解。药对桃仁红花源自《医宗金鉴》中的桃红四物汤，二药伍用，是活血化瘀常用药对之一[1~3]。桃仁苦甘性平，可破瘀行血，润燥滑肠，为破瘀行血常用之品；红花辛散温通，有活血通经，祛瘀止痛之功[4]。两药相须配对后祛瘀力增强，作用范围较单味药扩大，适用于全身各处瘀血，且有消肿止痛祛瘀生新之功，用于临床血脉瘀滞之症。本研究分别提取单味药桃仁、红花和药对桃仁红花的挥发油，利用气相色谱/质谱方法对挥发油进行检测，并采用化学计量学解析方法(chemometric resolution method, CRM)[5~12]对二维GC/MS数据进行处理，得到药对和两个单味药的纯色谱曲线和质谱，继而借质谱库对分辨的纯组分进行定性检索，用总体积积分法进行定量，最后比较了药对与单味药挥发油成分, 分析了单味药配伍后挥发油成分的变化。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂QP2010型气相色谱仪质谱仪(日本岛津公司)。桃仁、红花(河南南阳药材公司)，经湖南中医药研究院中药研究所鉴定。正己烷(分析纯，北京化工厂)。
2 药对挥发油提取称取干燥的桃仁(Semen persicae，SP),红花(Flos carthami, FC)各100 g，以1∶7加水混合，加热至沸腾，维持沸腾40 min，然后按中华人民共和国药典(2000年版)挥发油测定法甲法提取[13]。提取的挥发油溶于正己烷并置于冰箱保存。用相同的方法提取单味药挥发油。
2.3 气相色谱/质谱条件OV1 30 m 0.25 mm 色谱柱。 柱起始温度40℃2℃/min120℃10℃/min230℃(20 min)。He载气流速1.0 mL/min；进口温度250℃，界面温度280℃。EI源电子能量70 eV，离子源温度：230℃。倍增电压：1.28 kV，扫描范围20~600 amu；扫描速率：3.8 scans/s，溶剂延迟2 min。数据分析在PentiumШ850(Intel)计算机上进行，程序用Matlab6.1编写，所分辨的质谱在NIST107标准质谱库中检索。
3 结果与讨论
3.1 CRM解析CRM是对二维色谱/光谱矩阵数据进行解析的一种有效方法。它利用二维矩阵数据包含的色谱/光谱信息，采用局部因子分析以分辨出个组分的纯色谱曲线和光谱，其原理与解析方法见文献[5~12]。该方法已成功地应用于单味药苍术、厚朴和复方平胃散等挥发油的分析[8~11,14，15]。
3.2 挥发油化学成分的定性分析图1(a)、图1(b)和图1(c)分别是药对桃仁红花、桃仁和红花的挥发油化学成分GC/MS总离子流图(TIC)，其中许多色谱峰产生重叠, 甚至有些看似纯的色谱峰也是几个组分的重叠峰，所以，中药的挥发油是一个非常复杂的分析体系。 总离子流图1(b)中峰簇A的保留时间段为20.62~20.77 min，放大为图2 (b)。
图1 药对桃仁红花(a)、桃仁(b)和红花(c)挥发油的总离子流图(略)
Fig.1 TICs of volatile components of herbal pair Semen persicaeFlos carthami(HP SPFC)(a), SP(b) and FC(c)
图1b中的A峰簇看起来像是一个纯色谱峰，若直接从色谱库中进行检索，A峰簇前半部分不同位置质谱变化很大，且检索结果与被测质谱相似程度都很低。其中一个为Bicyclo[3.1.1]heptane6,6dimethyl3methylene，相似度仅为47%；而后半部分不同位置检索结果也不同，有的相似度较高，有的很低。如检索结果为betamyrene的化合物，相似度仅为53%。这样检索的定性结果其可靠程度和准确度都很低，同时由于色谱峰重叠，难以进行定量分析。利用CRM[5～12]分析，A峰簇是一个二组分体系(图2)。根据各组分的纯色谱曲线和质谱，再将它们与NIST标准库进行匹配，可检索到组分1、2分别为Vanillic acid 和Alphabutylbenzeneethanol,，相似度分别为90.26%，93.45%，其相应的质谱图如图3(a~d)。因为得到的是纯组分的质谱，定性结果的准确性和可靠程度大为增加。
图2 经解析后A峰的总离子流图(含组分1和2)(略)
Fig.2 Resolved chromatograms of the A peak cluster (containing component 1 and 2)
与上述解析A峰簇过程相似，对桃仁TIC图中其它保留时间段的组分和桃仁红花、红花TIC图，利用CRM逐步进行分辨，可得到组分的纯质谱，再用质谱库对分辨出的组分进行质谱定性检索，得到组分定性结果如表1。桃仁红花、桃仁和红花挥发油共分别分离出95,43和76个色谱峰，定性鉴定的组分分别为84,27和52个。
图3 A峰经CRM解析所得的质谱图(略)
Fig.3 Mass spectrum of the A peak cluster by chemometric resolution method (CRM)
a. 凡尼酸的标准质谱(sandard mass specrum of vanillic acid)； b. 凡尼酸的解析质谱(resolved mass spectrum of vanillic acid)； c. α丁基苯乙醇的标准质谱(standard mass spectrum of alphabutylbenzeneethanol)； d ......
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