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体外培养的神经干细胞的端粒和端粒酶活性

http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 2006年第3期

干细胞;,端粒,末端转移酶;,细胞,培养的;,神经系统,,干细胞;,端粒,末端转移酶;,细胞,培养的;,神经系统,1材料与方法,2结果,3讨论,参考文献:

     摘要: 目的了解体外培养的神经干细胞端粒酶活性,观察培养不同时间神经干细胞的端粒酶活性、端粒长度的情况。方法采用无血清培养法从新生大鼠脑皮质分离培养神经干细胞,通过免疫荧光细胞染色鉴定神经干细胞;TRAPELISA法测定培养4~12周的神经干细胞的端粒酶活性;Southernblot法测定培养第1代、第10代时神经干细胞的端粒长度。结果从新生大鼠脑皮质分离培养的神经干细胞具有端粒酶活性;体外培养12周内神经干细胞的端粒酶活性未见变化;神经干细胞具有较长的端粒(23.8~24.3 kb),且不随细胞传代而变化。结论大鼠脑神经干细胞具有端粒酶活性,在体外培养过程中,未见活性变化并能维持端粒的长度。

    关键词: 干细胞; 端粒,末端转移酶; 细胞,培养的; 神经系统

    神经干细胞(NSC)是一类存在于神经系统中能够增殖、自我更新,具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化潜能的细胞[12]。它们不仅是神经系统发育和再生机制的研究对象,而且成为修复神经组织损伤和治疗神经系统疾病的理想的细胞类型,甚至可作为基因治疗的细胞载体。端粒是存在于真核生物染色体上的一个特殊结构,端粒长度可随着细胞染色体DNA复制的重复进行而缩短,当其缩短至一关键长度时,将导致细胞出现衰老及至死亡。在大多数情况下,正常细胞寿命有限,遵循“Hayflick极限”的规律[3]。端粒酶可通过维持端粒长度,使细胞免于衰老并永生化。神经干细胞在生物体内具有终生自我更新能力,在体外培养系统中存在有丝分裂原的情况下,能够长期培养传代和增殖,它们的自我更新能力与端粒酶以及端粒长度可能存在一定的关系。Villa等报道一个永生化的人神经干细胞系存在端粒酶活性,推测其永生能力可能与端粒酶有关[4]。Bai等将端粒酶催化亚单位基因转入人神经前体细胞后,能够增加细胞在体外存活和传代时间[5]。笔者拟探讨体外培养传代不同时间的神经干细胞的端粒酶活性和端粒长度是否发生变化,为神经干细胞特性的研究和安全应用提供依据。

     1 材料与方法

    1.1 主要材料

    1.1.1 动物出生2~3 d的SpragueDawley大鼠[福建医科大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(闽)20040002]。

    1.1.2 细胞人胚肾细胞系HEK293(美国ATCC),人纤维细胞系WI38(中科院上海细胞生物学研究所)。

    1.1.3 试剂 DMEM/F12培养基、DMEM培养基、MEM培养基、无血清培养添加剂B27、非必需氨基酸(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Hyclone公司),碱性成纤维生长因子(bFGF,美国Pepro Tech公司),小鼠抗巢蛋白(Nestin)单克隆抗体(美国BD PharMingen公司),5溴尿嘧啶(BrdU)、小鼠抗BrdU单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),小鼠抗环核苷酸磷酸二脂酶(CNP)单克隆抗体(美国Neomarker公司),兔抗Ⅲ型β微管蛋白(βtubulin Ⅲ)抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、FITC标记二抗、Rh标记二抗(美国Chemicon公司),胰蛋白酶、牛血清白蛋白(上海生工生物工程技术服务有限公司),Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS试剂盒、Telo TAGGG Telomere Length Assay试剂盒(德国Roche公司),DNAzol Reagent(美国Invitrogen公司),其他试剂均为美国Sigma公司产品 ......

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