基因；_细菌噬菌体P1；_发光蛋白质类；_重组酶类；

EGFPCre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达

http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 2007年第2期

基因；,细菌噬菌体P1；,发光蛋白质类；,重组酶类；,克隆,分子,,基因；,细菌噬菌体P1；,发光蛋白质类；,重组酶类；,克隆,分子,1材料与方法,2结果,3讨论,参考文献：

     摘要: 目的构建噬菌体P1 Cre重组酶真核表达重组质粒,检测其在体外的表达情况和生物学活性。方法利用分子克隆技术,将cre编码序列克隆到真核表达质粒pIRES2EGFP上,构建为重组质粒pCMVCreEGFP。行菌液PCR、BamHⅠ酶切及测序鉴定,用FuGENE 6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre重组酶的表达和重组效应。结果经菌液PCR、酶切及测序等鉴定分析,证实已将目的片段cre插入pIRES2EGFP的多克隆位点上;建立Cre(+)组(pCMVCreEGFP和含LoxpCMVRFPLoxp的pCSilencer质粒)和Cre(-)组(pIRES2EGFP和pCSilencer),转染293T细胞,48 h后荧光显微镜下可见2组均表达绿色荧光和红色荧光,Cre(+)组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,统计学分析显示2组细胞的红色荧光蛋白表达率存在显著性差异(P<0.01)。结论成功构建噬菌体P1Cre重组酶表达重组质粒,并能在体外表达具有活性的Cre重组酶。

    关键词: 基因；细菌噬菌体P1；发光蛋白质类；重组酶类；克隆,分子

    Cre/LoxP系统是基因工程中常用的条件性重组系统,目前已广泛应用于转基因动物、基因敲除动物和基因的RNAi等研究。利用Cre/LoxP系统,可以在特定的时间或空间(器官、组织)实现基因组的突变,所以,构建Cre的真核表达重组质粒,成为基因功能研究的重要步骤之一。笔者构建含有报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的Cre真核表达载体pCMVCreEGFP,并与含有2个LoxP靶位点的质粒pCSilencer共转染细胞,检测Cre重组酶在体外的表达情况和生物学活性,为进一步制备Cre转基因动物及Cre/Loxp条件性基因突变动物研究奠定基础。

     1 材料与方法

    1.1 构件设计策略应用分子克隆技术将pBS185中的cre转移到pIRES2EGFP的多克隆位点(MCS)中,形成一个新的、能同时表达Cre重组酶和EGFP的重组质粒——pCMVCreEGFP。pCMVCreEGFP构建完成后,与含有LoxPCMVRFPLoxP构件的红荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)表达载体——pCSilencer共转染细胞。通过对2组细胞的荧光表达表达率进行比较,鉴定Cre在细胞内的表达情况 ......

百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2007/04/28/43/07/63.htm

您现在查看是摘要页，全文长 11168 字符。