摘要: 目的 构建癌胚抗原(CEA)与热休克蛋白70(HSP70)的真核双表达质粒，并检测其在体外的表达。 方法 从结肠癌及正常肝组织中经RT-PCR扩增获得CEA及HSP70cDNA，并将其定向克隆至真核双表达质粒pIRES中，重组质粒pIRES-CEA及pIRES-CEA-HSP70，经酶切及测序鉴定后，分别转染仓鼠卵巢细胞(CHO);经RT-PCR及ELISA法检测，CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。 结果 真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70构建成功且CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。 结论 真核表达载体pIRES-CEA-HSP70的成功构建为治疗CEA阳性肿瘤提供一定的实验基础。

    关键词: 癌胚抗原;热休克蛋白质类;疫苗，DNA

    肿瘤核酸疫苗是目前研究热点之一。核酸疫苗是将外源基因克隆到真核表达载体上，然后将重组质粒以某种方式导入动物体内，通过外源基因在体内表达产生的抗原，激活机体免疫系统产生免疫保护反应。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一种位于肿瘤细胞膜表面的膜结合蛋白，是许多腺癌表达的肿瘤相关抗原，参与细胞间的识别与反应，是潜在的肿瘤免疫治疗理想的靶抗原，主要不足之处是其诱导的免疫应答强度较弱。如何提高疫苗诱导的免疫反应强度是CEA基因疫苗能否应用于临床的关键。热休克蛋白70(heat shock pro-teins，HSP70)能在核酸疫苗的构建中发挥载体及佐剂作用，HSP70-肿瘤抗原肽复合物进入机体后，HSP70能将肿瘤抗原肽高效呈递给免疫系统，激发机体产生针对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。本研究构建由内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite，IRES)连接的人CEA及HSP70共表达质粒，将其作为DNA疫苗免疫机体后，产生针对CEA阳性肿瘤的特异性免疫 [1] 。

    1 材料和方法

    1.1 材料 大肠杆菌DH5α为本室保存。结肠癌组织取自临床检测CEA阳性结肠癌手术切除标本。正常肝组织取自手术切除标本。pIRES载体(美国Clontech公司)。细胞总RNA抽提试剂Trizol TM (美国Gibco公司)。M-MuLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)。DNA纯化试剂盒及胶回收试剂(美国Promega公司)。LA TaqDNA聚合酶、限制性内切酶XbaI和NotI、Xhol、Mlu、T 4 DNA连接酶、Marker2000及Marker15000(大连TaKaRa生物工程公司) ......