NCLs致病相关基因CLN8真核表达载体的构建及检测*
【摘要】 目的 构建真核表达载体,为在哺乳动物细胞内验证NCLs致病相关基因CLN8与ND1是否存在相互作用奠定实验基础。方法 采用PCR 技术扩增CLN8基因, 将其亚克隆到PEF-Flag真核表达载体,在HeLa细胞中表达, 对表达产物进行Western blot鉴定。结果 特异扩增CLN8基因编码序列, 构建了真核表达载体PEF-Flag-CLN8，在HeLa细胞中表达融合蛋白, Western blot实验能够检测到表达的融合蛋白。结论 成功地构建真核表达载体PEF-Flag-CLN8, 融合蛋白在HeLa细胞中有效表达。
【关键词】 CLN8P;真核表达; 检测
Expressing and testing of CLN8P in eukaryocyte
LI Jie, HUANG Chun-Lin,HE Shu-Ya, et al.Center of Medical Engineering Experiment，Nanhua University,Hengyang 421001,China
【Abstract】 Objective To verify the interaction between CLN8 and ND1in mammal cells. Methods The fragment of CLN8 gene was amplified by PCR. The amplified fragment of CLN8 was ligased with the P-Flag vector to construct recombinant plasmid PEF-Flag-CLN8.The recombinant plasmid was transfected into HeLa cell and tested by Western blot. Results The fragments of CLN8 gene was amplified and ligased with PEF-Flag, digested with endonuclease and sequenced,the recombinant plasmid of PEF- Flag- CLN8 was constructed correctly. Experimental result of Western blot suggested that the fusion protein can be expressed in eukaryocyte effectively. Conclusion The recombinant plasmid of PEF-Flag-CLN8 was constructed successfully. The fusion protein can be expressed in HeLa cell effectively.
【Key words】 CLN8P; eukaryocyte expression; tested
神经元蜡样脂褐质沉积症(the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)是一组儿童常见的进行性神经元变性疾病群，多为常染色体隐性遗传。此疾病群的主要临床症状包括快速的视力恶化，癫痫发作，进行性智力障碍，运动失调和行为变化[1]。NCLs主要组织细胞病变特征为溶酶体内脂质沉积，且沉积物中包含的主要蛋白质为线粒体ATP酶亚基C(除NCL1 中SAP A 和D)。目前认为NCLs至少由8种不同的基因发生突变引起(CLN1-8)。分子基因学研究已经鉴定并克隆出此疾病群中与6种类型对应的6个基因(CLN1-3, CLN5-6, CLN8)[2],其中CLN8 位于常染色体8p,包括3个外显子，编码区全长861bp,分为外显子2和3[3]。本课题组以CLN8基因编码区全长为诱饵,采用酵母双杂交技术,选择在人胎脑cDNA文库中筛选CLN8P相互作用蛋白,已获得一靶基因ND1[4]，其编码产物在酵母体内能够与CLN8P相互作用[5]。为了进一步论证在哺乳动物细胞内CLN8P与ND1是否存在相互作用，本实验构建了PEF-Flag-CLN8真核表达载体, 在HeLa细胞中表达,对表达产物进行Western blot鉴定，为今后NCLs发病机理研究奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 CLN8基因由NanbertZhong博士惠赠。PEF-Flag真核表达载体及抗FLAG的单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗由上海睿星生物公司提供。Hela细胞购自中科院细胞生物研究所上海细胞库。无支原体新生牛血清购自杭州四季清生物工程公司。DMEM细胞培养基按《组织培养与分子细胞学技术》配制。ECL蛋白印迹法检测试剂盒购自英国Amersham Biosciences. 其他试剂均购自上海生物工程公司和北京鼎国公司。
1.2 方法
1.2.1 构建真核表达载体P-Flag-CLN8 PCR 扩增CLN8片段, 扩增的产物采用胶回收,以SfiⅠ切下,并回收目的DNA 片段,与同样酶切的PEF-Flag载体连接构建成质粒PEF-Flag-CLN8。重组质粒进行限制性酶切、测序鉴定后,无水乙醇浓缩沉淀,并用紫外分光光度仪定量待转录用。
1.2.2 重组质粒转染Hela细胞 Hela细胞用DMEM培养基接种于六孔板中培养18～24h；分别取PEF-Flag-CLN8质粒2μg/孔及5μl/孔阳离子脂质体用无血清和抗生素的培养基稀释至100μl；将脂质体稀释液滴加到质粒DNA稀释液中，边加边轻轻混匀，室温静置20min；细胞用无血清和抗生素的培养基洗两次，然后加入无血清和抗生素的培养基0.8ml，轻轻晃动使培养基覆盖全部细胞，每孔200μl加入质粒/脂质体复合物溶液，轻晃混匀；细胞37℃、5%CO2培养18h，每孔加入1ml含正常两倍新生牛血清和抗生素的完全培养基以恢复正常的培养，培养18h后，每孔换上标准培养基2～3ml，继续培养16h。
1.2.3 融合蛋白Western blot鉴定 提取细胞总蛋白, SDS-PAGE凝胶电泳,用抗FLAG的单克隆抗体,HRP标记的羊抗鼠IgG二抗进行Western-blot检测转染细胞中表达的Flag-CLN8融合蛋白。
2 结果
2.1 重组质粒PEF-Flag-CLN8进行限制性酶切鉴定 重组质粒PEF-Flag-CLN8用SfiⅠ酶切后, 0.8%琼脂糖凝胶电泳，得到两个DNA片段, 分别约为6.8kb和900bp,小片段大小与PCR扩增产物一致，大片段大小与PEF-Flag空质粒片段一致，这些均与预期值相符。
2.2 融合蛋白Western blot鉴定 采用Western blot方法对表达产物进行鉴定，结果可见一蛋白质条带。参照PAGE胶的蛋白质Marker，此条带的分子量为31 KD，与PAGE胶的条带在同一位置。Western blot结果表明所表达的蛋白为融合表达的Flag-CLN8。
3 讨论
应用酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白，在筛选过程可出现假阳性。由于酵母的翻译后加工系统与哺乳动物细胞的翻译后加工系统不尽相同,某些哺乳动物细胞的蛋白需经过翻译后加工才能相互作用,对这类蛋白质该系统也不适用[6]。其次,假阳性的发生频率较高。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能,或与其他蛋白形成复合物,引起报告基因表达,使酵母出现相应表型,而产生假阳性结果[7]。
虽然在酵母体内CLN8P与ND1相互作用得到了一对一验证，但是在生理条件下，蛋白质分子间的相互作用是十分复杂的，尤其蛋白质相互作用具有时间和空间特异性[8]，由此可能在操作过程中出现人为的假象。并且，酵母细胞是最简单的真核细胞，其体内蛋白质合成后加工修饰与哺乳动物相比较有明显差别。因此，我们构建了带有Flag标签的真核表达载体PEF-Flag-CLN8。Flag标签有24bp，抗体易购买，方便表达蛋白的鉴定和纯化。实验结果已证实成功构建真核表达载体PEF-Flag-CLN8，并检测到表达的融合蛋白Flag-CLN8P。有效解决了CLN8P单抗未商品化，且单抗制备周期长，费用高的局限性。为在哺乳动物细胞内验证CLN8与ND1是否存在相互作用奠定了实验基础。同时，可以初步了解CLN8的功能，为NCL发病机制提供新的依据。
【参考文献】
1 Zeman W, Alpert M. On the nature of the “stored” lipid substances in juvenile amauroticidiocy (Batten stielmeyer Vogt). Ann Histochem, 1963, 8: 255-257.
2 Wisniewski KE, Kida E, Connell F, et al. New subform of the late infantile form of neuronal ceroid lipofuscinosis. Neuropediatrics, 1993, 24: 155-163.
3 Goebel HH. The neuronal ceroid-lipofuscinoses. Child Neurol, 1995, 10: 424-437.
4 何淑雅，肖卫纯，李洁.酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白. 国际遗传学杂志，2006，29(3)：161-163.
5 肖卫纯，何淑雅，李洁.CLN8与ND1相互作用鉴定. 中华医学研究杂志，2005，5(4)：1415-1416.
6 Allen JB, Walberg MW, Edwards MC, et al. Finding prospective partners in the library: the two2hybrid system andphage display find a match. Trends Biochemci,1995,20(12):511-5161.
7 Gietz RD, Triggs Raine B, Robbins A, et al. Identification of proteins that interact with a protein of interest:applications of the yeast two2hybrid system. Mol Cell Biochem,1997, 172 (122):67-791.
8 Sayeon Cho, Sung Goo Park, Do Hee Lee, and Byoung Chul Park. Protein-protein Interaction Networks: from Interactions to Networks. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2004， 37: 45-52.
*基金项目:湖南省教育厅资助项目(编号:04c543)
作者单位： 1 421001 湖南衡阳，南华大学医学院机能学实验中心
2 421001 湖南衡阳，南华大学生物化学与分子生物学教研室(△通讯作者)
3 NY10314 美国纽约，纽约州立基础研究所人类遗传研究室
(编辑：黄 杰), http://www.100md.com(李洁，黄春林，何淑雅，肖卫纯，李斌元，NanbertZhong)
【关键词】 CLN8P;真核表达; 检测
Expressing and testing of CLN8P in eukaryocyte
LI Jie, HUANG Chun-Lin,HE Shu-Ya, et al.Center of Medical Engineering Experiment，Nanhua University,Hengyang 421001,China
【Abstract】 Objective To verify the interaction between CLN8 and ND1in mammal cells. Methods The fragment of CLN8 gene was amplified by PCR. The amplified fragment of CLN8 was ligased with the P-Flag vector to construct recombinant plasmid PEF-Flag-CLN8.The recombinant plasmid was transfected into HeLa cell and tested by Western blot. Results The fragments of CLN8 gene was amplified and ligased with PEF-Flag, digested with endonuclease and sequenced,the recombinant plasmid of PEF- Flag- CLN8 was constructed correctly. Experimental result of Western blot suggested that the fusion protein can be expressed in eukaryocyte effectively. Conclusion The recombinant plasmid of PEF-Flag-CLN8 was constructed successfully. The fusion protein can be expressed in HeLa cell effectively.
【Key words】 CLN8P; eukaryocyte expression; tested
神经元蜡样脂褐质沉积症(the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)是一组儿童常见的进行性神经元变性疾病群，多为常染色体隐性遗传。此疾病群的主要临床症状包括快速的视力恶化，癫痫发作，进行性智力障碍，运动失调和行为变化[1]。NCLs主要组织细胞病变特征为溶酶体内脂质沉积，且沉积物中包含的主要蛋白质为线粒体ATP酶亚基C(除NCL1 中SAP A 和D)。目前认为NCLs至少由8种不同的基因发生突变引起(CLN1-8)。分子基因学研究已经鉴定并克隆出此疾病群中与6种类型对应的6个基因(CLN1-3, CLN5-6, CLN8)[2],其中CLN8 位于常染色体8p,包括3个外显子，编码区全长861bp,分为外显子2和3[3]。本课题组以CLN8基因编码区全长为诱饵,采用酵母双杂交技术,选择在人胎脑cDNA文库中筛选CLN8P相互作用蛋白,已获得一靶基因ND1[4]，其编码产物在酵母体内能够与CLN8P相互作用[5]。为了进一步论证在哺乳动物细胞内CLN8P与ND1是否存在相互作用，本实验构建了PEF-Flag-CLN8真核表达载体, 在HeLa细胞中表达,对表达产物进行Western blot鉴定，为今后NCLs发病机理研究奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 CLN8基因由NanbertZhong博士惠赠。PEF-Flag真核表达载体及抗FLAG的单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗由上海睿星生物公司提供。Hela细胞购自中科院细胞生物研究所上海细胞库。无支原体新生牛血清购自杭州四季清生物工程公司。DMEM细胞培养基按《组织培养与分子细胞学技术》配制。ECL蛋白印迹法检测试剂盒购自英国Amersham Biosciences. 其他试剂均购自上海生物工程公司和北京鼎国公司。
1.2 方法
1.2.1 构建真核表达载体P-Flag-CLN8 PCR 扩增CLN8片段, 扩增的产物采用胶回收,以SfiⅠ切下,并回收目的DNA 片段,与同样酶切的PEF-Flag载体连接构建成质粒PEF-Flag-CLN8。重组质粒进行限制性酶切、测序鉴定后,无水乙醇浓缩沉淀,并用紫外分光光度仪定量待转录用。
1.2.2 重组质粒转染Hela细胞 Hela细胞用DMEM培养基接种于六孔板中培养18～24h；分别取PEF-Flag-CLN8质粒2μg/孔及5μl/孔阳离子脂质体用无血清和抗生素的培养基稀释至100μl；将脂质体稀释液滴加到质粒DNA稀释液中，边加边轻轻混匀，室温静置20min；细胞用无血清和抗生素的培养基洗两次，然后加入无血清和抗生素的培养基0.8ml，轻轻晃动使培养基覆盖全部细胞，每孔200μl加入质粒/脂质体复合物溶液，轻晃混匀；细胞37℃、5%CO2培养18h，每孔加入1ml含正常两倍新生牛血清和抗生素的完全培养基以恢复正常的培养，培养18h后，每孔换上标准培养基2～3ml，继续培养16h。
1.2.3 融合蛋白Western blot鉴定 提取细胞总蛋白, SDS-PAGE凝胶电泳,用抗FLAG的单克隆抗体,HRP标记的羊抗鼠IgG二抗进行Western-blot检测转染细胞中表达的Flag-CLN8融合蛋白。
2 结果
2.1 重组质粒PEF-Flag-CLN8进行限制性酶切鉴定 重组质粒PEF-Flag-CLN8用SfiⅠ酶切后, 0.8%琼脂糖凝胶电泳，得到两个DNA片段, 分别约为6.8kb和900bp,小片段大小与PCR扩增产物一致，大片段大小与PEF-Flag空质粒片段一致，这些均与预期值相符。
2.2 融合蛋白Western blot鉴定 采用Western blot方法对表达产物进行鉴定，结果可见一蛋白质条带。参照PAGE胶的蛋白质Marker，此条带的分子量为31 KD，与PAGE胶的条带在同一位置。Western blot结果表明所表达的蛋白为融合表达的Flag-CLN8。
3 讨论
应用酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白，在筛选过程可出现假阳性。由于酵母的翻译后加工系统与哺乳动物细胞的翻译后加工系统不尽相同,某些哺乳动物细胞的蛋白需经过翻译后加工才能相互作用,对这类蛋白质该系统也不适用[6]。其次,假阳性的发生频率较高。由于某些蛋白质本身具有激活转录功能,或与其他蛋白形成复合物,引起报告基因表达,使酵母出现相应表型,而产生假阳性结果[7]。
虽然在酵母体内CLN8P与ND1相互作用得到了一对一验证，但是在生理条件下，蛋白质分子间的相互作用是十分复杂的，尤其蛋白质相互作用具有时间和空间特异性[8]，由此可能在操作过程中出现人为的假象。并且，酵母细胞是最简单的真核细胞，其体内蛋白质合成后加工修饰与哺乳动物相比较有明显差别。因此，我们构建了带有Flag标签的真核表达载体PEF-Flag-CLN8。Flag标签有24bp，抗体易购买，方便表达蛋白的鉴定和纯化。实验结果已证实成功构建真核表达载体PEF-Flag-CLN8，并检测到表达的融合蛋白Flag-CLN8P。有效解决了CLN8P单抗未商品化，且单抗制备周期长，费用高的局限性。为在哺乳动物细胞内验证CLN8与ND1是否存在相互作用奠定了实验基础。同时，可以初步了解CLN8的功能，为NCL发病机制提供新的依据。
【参考文献】
1 Zeman W, Alpert M. On the nature of the “stored” lipid substances in juvenile amauroticidiocy (Batten stielmeyer Vogt). Ann Histochem, 1963, 8: 255-257.
2 Wisniewski KE, Kida E, Connell F, et al. New subform of the late infantile form of neuronal ceroid lipofuscinosis. Neuropediatrics, 1993, 24: 155-163.
3 Goebel HH. The neuronal ceroid-lipofuscinoses. Child Neurol, 1995, 10: 424-437.
4 何淑雅，肖卫纯，李洁.酵母双杂交系统筛选CLN8P相互作用蛋白. 国际遗传学杂志，2006，29(3)：161-163.
5 肖卫纯，何淑雅，李洁.CLN8与ND1相互作用鉴定. 中华医学研究杂志，2005，5(4)：1415-1416.
6 Allen JB, Walberg MW, Edwards MC, et al. Finding prospective partners in the library: the two2hybrid system andphage display find a match. Trends Biochemci,1995,20(12):511-5161.
7 Gietz RD, Triggs Raine B, Robbins A, et al. Identification of proteins that interact with a protein of interest:applications of the yeast two2hybrid system. Mol Cell Biochem,1997, 172 (122):67-791.
8 Sayeon Cho, Sung Goo Park, Do Hee Lee, and Byoung Chul Park. Protein-protein Interaction Networks: from Interactions to Networks. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2004， 37: 45-52.
*基金项目:湖南省教育厅资助项目(编号:04c543)
作者单位： 1 421001 湖南衡阳，南华大学医学院机能学实验中心
2 421001 湖南衡阳，南华大学生物化学与分子生物学教研室(△通讯作者)
3 NY10314 美国纽约，纽约州立基础研究所人类遗传研究室
(编辑：黄 杰), http://www.100md.com(李洁，黄春林，何淑雅，肖卫纯，李斌元，NanbertZhong)