参松养心胶囊对心室肌细胞钾通道的影响(二)
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记录瞬时外向钾电流(Ito)失活后时间依赖性恢复的刺激程序 采用双脉冲刺激,维持电压-90 mV, 继而先后给予两个去极化到60 mV持续200 ms的去极化刺激P1、P2,其时间间隔△t依次增大分别设为1、3、5、7、10、15、20、30、40、60、90、120、150、180、210、250、300(ms),并记录P2对应的峰电流I。以I/Imax对△t做出稳态失活后恢复曲线。
测定延迟整流钾电流(I K)的电压依赖性激活 Vh为-40 mV,从-40 mV 逐渐去极化至+ 60 mV, 跃阶 10 mV , 刺激波宽为 5 s, 回到Vh 持续2.5 s记录尾电流。
测定IK尾电流的时间依赖性激活Vh为-40 mV,去极化至+ 50 mV 后回至Vh,连续10 个脉冲, 每个脉冲刺激波宽分别为500~5000 ms 不等, 以500 ms 幅度逐渐递增。
4. 数据分析与统计
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原始电流数据采用Clampfit 10.0(美国Axon公司)进行测量采集,使用Origin 6.0数据处理软件(美国Microcal Software公司)对采集后数据进行分析、拟合和作图。实验数据以均数±标准差(x±s)表示,给药前后采用配对t检验,P<0.05为有显著性差异。
结果
参松养心胶囊对大鼠心肌细胞膜IKI的作用
维持电位(Vh)-40 mV,指令电位-120 mV~0 mV, 跃阶10 mV, 钳制时间400 ms, 刺激频率0.2 Hz,在大鼠单个心室肌细胞上能记录到一个快速激活的内向电流,在400 ms内无明显失活(图2 A)。该电流能被1 mmol/L BaCl2完全阻断,表明该电流为IKI。IKI电流内向成分随去极化而减小,反转电位约-40 mV, 具有内向整流特性。用钾外液溶解参松养心胶囊提取干粉配制成的0.5 %溶液,对IKI有抑制作用(图2 B)。-100 mV时用药前平均峰值电流密度为(-10.78 ±1.80 )pA/pF,用药后平均峰值电流密度为(-7.18 ±2.05 )pA/pF,平均抑制率为(33.1±16.85) %(n=11,P<0.05)。以各脉冲下电流密度幅值对相应膜电位制图获得I-V曲线。药物在每一指令电压水平上都减小IKI电流密度,但基本不改变反转电位和曲线的形状(图2 C)。
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参松养心胶囊对大鼠心肌细胞膜Ito的作用
1. 参松养心胶囊对Ito电流-电压(I-V) 曲线的影响
使用记录细胞钾通道内外液, 维持电位(Vh)-90 mV,先给予-40 mV 20 ms的前刺激,再给予-40 mV~+60 mV的去极化刺激, 跃阶10 mV, 钳制时间400 ms, 刺激频率0.2 Hz。在大鼠心室肌细胞记录到外向钾电流包括两种成分。一种成分是快速激活和灭活的瞬时电流(Ito),电流呈“A”型, 峰形尖锐,从0 mV开始激活,电流在10 ms左右达高峰,之后迅速失活,在200 ms内基本达稳态。其激活和失活过程均呈电压和时间依赖性。该电流能被2 mM的4-AP完全阻断,表明该电流为Ito。另一种成分为维持电流(Imaintained),从-10 mV开始激活,在-10 mV~60 mV范围内,随电压增大而增大(图 3A、3C)。以各脉冲下电流密度幅值对相应膜电位制图获得I-V 曲线。以峰值电流幅值减去维持电流得到瞬时电流,即Ito。0.5 %的参松养心胶囊溶液对Ito电流有抑制作用(图3B ),在0~60 mV测试电压下表现为峰值电流的下降,I-V 曲线下移。在电压为60 mV的平均电流密度从(-19.82 ±7.10) pA/pF降至(-10.02 ±3.93) pA/pF时,平均抑制率为(50.60 ± 10.77 )%(n=6,P<0.05)(图 3D)。
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对Ito电流的失活部分用单指数方程进行拟合,可得到时间依赖性失活的时间常数(τ)。参松养心胶囊可以加速电流的失活(图4),用药前后的τ值分别为29.06±4.66和 21.4 4±3.12 (n=6, P < 0. 05)。
2. 参松养心胶囊对Ito稳态失活曲线的影响
记录Ito稳态失活的刺激方案:维持电压-90 mV, 给予400 ms从-120 mV~60 mV跃阶10 mV的前刺激,然后钳制在60 mV 300 ms记录Ito电流,并比较用药前后的变化(图5A、5B)。从引出的电流图中可以看到外向电流的失活分为两个过程,首先是维持电流的失活,失活电压较低,继而是峰电流的失活,失活电压要高于前者。Ito的幅值由峰电流与测试脉冲末端测量的维持电流间的差值决定(图5C)。标准化各电流幅值,以相对电流对各膜电位制图获得稳态失活曲线,并用Boltzmann 方程I/ Imax = 1/{1+exp〔(Vm-V1/2) /k〕}拟合求出半失活电压( V1/2) 及失活曲线斜率因子(k) (图5D) 。0.5 %的参松养心胶囊干粉提取溶液可使得Ito稳态失活曲线左移,斜率增大。用药前后的V1/2分别为(-15.67±2.52) mV和(-26.45±3.88) mV,k值从3.41± 0.67变为6.38±2.02 (n=7, P < 0. 05)(图5)。, 百拇医药