药用植物染色体加倍的研究进展
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2007年5月19日
两北植物学报.2005，25(1 2)：2569 257·1 Acta Bot. Borea1.一Occident.Sin.文章编号：1000—4025(2005)12-2569—06 药用植物染色体加倍的研究进展武振华，牛炳韬，王新宇 (兰州大学生命科学学院细胞生物学研究所，兰州730000) 摘要：多倍体药用植物因器官巨大。产量高，具有重要的药用和经济价值而倍受Jt.ffl的关注。本文着重介绍了当前药用植物染色体加倍所采用的方法、诱变剂类型以及其它一些影响植物染色体加倍的因素。此外，还介绍了多倍体药用植物的特征、鉴定方法以及近些年来药用植物染色体加倍所取得的最新成果。关键词：药用植物；多倍体育种；秋水仙素中图分类号：Q943 文献标识码：A Research Progresses in Chromosome Doublings of M edicinal Plants W U Zhen—hua。NIU Bing—tao。W AN G Xin—yu (Institute of Cell Biology，College of 1.ife Sieenee，1.anzhou University，1.anzhou 730000.China) Abstract：Medicinal polyploid plants attract great attention because of their gigantic organs，high yields and im portant medicinal and economic values.The paper mainly deals with the chromosome-doubling method and mutagen types for medicinal plants and other factors affecting chromosome doubling.In addition，it in— troduces the characteristics and identification methods of medicinal plants，and latest achievements obtained in chromosome doubling of medicinal plants in recent years. Key words：medicinal plant；polyploid breeding；colchincine 新药的研究与开发被称作是永不凋谢的“阳光产业”。尽管化学合成药物比天然药物具有更高的疗效和活性，但却具有合成难、副作用大、耗时长、成本高、易产生药源性疾病等缺点。而中草药能促进营养物质的消化和吸收，无残留，无耐药性，能直接杀灭或抑制细菌，增强人体免疫能力，它还具有疗效温和、不良反应少、标本兼治等优点，所以近年来研究者们把目光又转向了天然药物。药用植物是中草药药材的主要组成部分(约占 80 )。多倍体药用植物的根、茎、叶都比较巨大，产量高，尤其近年来生态环境的不断恶化和人类的过度采挖，造成了药用植物资源的严重不足，因而药用植物的多倍体育种在实践中具有重要的意义。本文简要介绍了目前药用植物染色体加倍研究的现状，旨在为我国药用植物的研究尤其是中草药的研究提供基本的信息资料。 1 目前已人工加倍成功的药用植物植物染色体的加倍研究虽然已有较长的历史，但是药用植物染色体加倍的研究近些年来才受到了国内外学者的重视。据不完全统计，目前染色体加倍已在多种药用植物中获得成功，这些植物除表1中列举的27种外，张汉明等⋯在一篇综述中提到，在党参、宁夏枸杞、向13葵、三叉蝶豆、杂交碧冬茄、莨收稿日期：2005—06—30；修改稿收到日期；2005—11—14 基金项目：国家自然科学基金资助(30370709) 作者简介：武振华(1974一)，男(汉族)，甘肃通渭人，在读硕士，主要从事遗传转化方面的研究。 *通讯联系人。C0rresp0ndence to：WANG Xin—yu.E—mail：wangxy@lzu.edu.cn 维普资讯 http://www.cqvip.com 西北植物学报 25卷菪、胜红蓟、具苞罂粟、茼蒿、鹰嘴豆、牛膝、飞燕草、菘蓝等药用植物中也都获得成功(详细情况没有提及)。它们主要分布于伞形科，菊科，唇形科，百合科等13个科，20多个属，其中包括芦荟、当归、川贝母、鬼针草、菊花脑、黄芩等珍稀药用植物。采用的加倍试剂主要为秋水仙素，加倍用的器官与组织主要为分生组织、愈伤组织、种子等，绝大多数获得了再生植株，加倍率最高达80% ，获得的多倍体大多数为4倍体，个别为8倍体(当归)。表1 部分人工加倍的药用植物 Table 1 A Part of medicinal plants with their chromosomes doubled 2 染色体加倍诱变剂染色体加倍包括自然突变、物理诱变和化学诱变等多种途径。在自然条件下，由于受射线、温度等条件的影响，植物染色体也会发生变异，产生多倍体，如六倍体小麦和四倍体月见草 等。物理诱变最早是通过打顶来实现的，后来人们相继采用高温、低温、7一射线、 射线、中子、激光等辐射获得了多倍体。近年来，又发明了离心法、振荡法、嫁接法、损伤法和超声波法等，但诱导频率都很低，而且容易产生嵌合体。因此，目前人工诱导染色体加倍仍然以化学诱变为主。在染色体加倍研究中，最早使用的化学诱变剂为秋水仙素(colchicine)|3]，其对植物的种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝都可以产生诱变作用。后来发现吲哚乙酸、萘啶乙烷、芫荽脑、苯及其衍生物、有机砷、有机汞(富民隆)、磺胺剂、藜芦碱及其它植物碱、麻醉剂、生长素等也能诱导染色体加倍 ]。近年来还有报道，萘嵌戊烷和一些除草剂类物质，如二苯基胺 (oryzaline)、磷酰胺(又称胺草磷)(amiprofos— methy，APM)、苯基酰胺(pronamide)及氟乐灵(-- 苯苯胺)等也可使植物的染色体加倍；其中APM 对微管蛋白有很高的亲和力，在较低浓度时，对微管蛋白的解聚能力更强，加倍频率更高，对植物的毒害作用也小。Jakse等[4 用50 ttmol·L 的APM 处理洋葱的磷茎获得36.7 的二倍体植株；另外APM 在维普资讯 http://www.cqvip.com 12期 武振华。等：药用植物染色体加倍的研究进展 2571 甘蓝、甜菜等植物的多倍体诱导中也获得了成功，但在药用植物的多倍体诱导中还未见报道。据统计，尽管目前约有200余种化合物可以诱导植物染色体加倍 ]，但在目前获得的多倍体植物(包括药用植物在内)中。绝大多数仍是用秋水仙素诱导成功的，因此它仍被认为是加倍效果最好、使用最广泛的诱变剂。 3 植物染色体加倍的方法染色体加倍的方法很多，根据诱变处理时所选用植物器官和组织材料的不同，分为原位诱导法和离体诱导法两种。早期研究主要采用原位诱导法 J，近年来随着组织培养技术的不断成熟，植物染色体加倍开始向离体诱导法转变，且取得了重要进展。原位诱导法也叫活体诱导法，即把供试植物的种子、正在生长的幼苗、茎尖等在非离体条件下用不同浓度的诱变剂处理，从而诱导染色体加倍。处理的方法有浸泡法、注射法、脱脂棉浸透法、羊毛脂涂抹法等 用不同浓度的秋水仙素处理牛蒡 ]、菊花脑_7]、芜菁 ]、互叶白干层 等药用植物的种子、芦荟的丛生芽【】。]、盾叶薯蓣的种子和试管苗⋯]、生姜的胚芽或生长点n引、杭白芷的花苞 和芫荽的组培丛生芽 都获得了较高频率的四倍体植株。采用改良的琼脂涂抹法(0.2 秋水仙素与0.1 的琼脂混合成半固体)和直接滴渗法处理刺果甘草的幼苗顶芽[1 、鬼针草l】 和黄芪的顶芽 也获得了多倍体植株。尽管以上这些方法都获得了较高频率的多倍体，但仍存在一定的缺陷，主要是秋水仙素长时间的 (数天)浸泡对种子或幼苗茎尖的毒害作用太大，容易烂种；此外，所形成的嵌合体较多，不能稳定遗传，还可能发生回复突变；注射法对组织的机械损伤较大，诱导率也低；涂抹法和包埋法由于药剂和生长点不能充分接触，诱导率相对过低。离体诱导法是在离体水平上诱导细胞内染色体加倍，然后获得再生多倍体植株。选用的诱变材料通常有离体的茎尖、叶片、愈伤组织、胚状体、原生质体、子房等，具有诱导率高、重复性强、实验条件易于控制、获得的多倍体嵌合率低等优势u ，但受植物再生频率低的限制。离体诱导法又可以分为直接诱导法和间接诱导法。直接诱导法是先将要加倍的植物器官或组织接种到含有诱变剂的培养基上培养不同的时间，然后再转移到不含诱变剂的培养基上培养。把川贝母_1 、白术 ]、黄花蒿 ]、黄芩 的愈伤组织和金荞麦的无菌苗与愈伤组织 用添加不同浓度秋水仙素的培养基培养不同的时间，然后再转入不含秋水仙素的分化培养基上培养，都获得了较高频率的多倍体。间接诱导法是先把供试材料接种到不含诱变剂的培养基预培养一段时间，再转入含有不同浓度诱变剂的培养基上培养。如以南丹参叶片为材料，先在分化培养基上预培养1周，然后转入含不同浓度秋水仙素的分化培养基上处理1～2周，再转入分化培养基培养，获得33.3% 的四倍体 。而预培养的时间从0 d延长到10 d，加倍率能提高15 。与直接诱导法相比，间接诱导法可以减少诱变剂对材料的直接毒害，因而提高加倍频率。 4 影响染色体加倍的因素影响染色体加倍的因素很多，除诱变剂的种类、浓度与处理时间外，目前发现下列一些因素和诱变剂联合使用也能提高染色体加倍频率。(1)二甲基亚砜(DMS())：对洋葱的染色体进行加倍时发现，加入 2 DMSO 之后，诱导频率可从9.4%提高到 21.6%【2 。Van Duren等 发现使用30 btmol·L 的oryzalin加2 9，6的DMSO，与5.0 mmol·L 秋水仙素加2%的DMSO相比，染色体加倍率可提高 6 。此外，二甲基亚砜不但能减轻诱变剂对植物组织的毒害作用，而且能降低多倍体的嵌合率 。(2) 外植体的种类与生理状态：在互叶白干层的多倍体诱导中发现，相同浓度的诱变剂处理种子获得了 5.8 的多倍体，而处理茎尖仅获得3.3%的多倍体l7j。此外，还有人提到，组织器官含有生长点且苗龄越小，加倍效果越好。(3)被加倍植物的倍性水平：有研究报道，低倍体植物形成的愈伤组织在用秋水仙素处理时，容易使有丝分裂出现异常，因而更容易产生多倍体。如在相同条件下，2X、5X和8X 3个品系的草莓，加倍效果依次为2X>5X>8X E。 。(4)温度：温度会影响诱变剂的水解速度，所以进而会影响染色体的加倍频率。在大蒜的多倍体诱导中，较高的温度和较短的时间有利于大蒜染色体的加倍口 。但温度过高，会导致诱变剂变性，所以最好缩短处理时间，以提高多倍体的诱导频率。 5 药用多倍体植株的特征与二倍体植株相比，多倍体植株一般具有茎秆粗壮、叶色浓绿、叶脉明显、叶片变宽，花器、果实、花粉粒和气孔增大，花期延长，但生长减慢，花果数目减少，雄性不育等特征n仉 。近几年来还发现，多倍维普资讯 http://www.cqvip.com 2572 西北植物学报 25卷体植株中营养成分如糖类、蛋白质及次生代谢物的含量有明显提高，如甜菊四倍体植株比二倍体植株糖苷含量提高了4.9 ；粗根类丹参多倍体品系产量高于二倍体丹参产量，但活性成分(丹参酮)产量反而减少，而丛根类丹参多倍体品系与二倍体丹参相比，不仅产量增加，丹参酮的含量也能提高 79 】。 裴新膨等 引还报道，多倍体植物对外界环境的适应性较强，表现出较强的抗寒、抗旱、抗病等抗逆性，因为多倍体植株中基因序列的增加提高了基因功能的保险性，为逆境条件下的生存与竞争提供了稳定的遗传基础。与二倍体植株相比，多倍体植株的气孔在长度和宽度上都变大，保卫细胞的叶绿体数目也增加。在西瓜和甜瓜的四倍体植株中发现，保卫细胞的叶绿体数目和二倍体植株相比明显增加[3 。多倍体植株还能合成一些新的药效成分，如福禄考的四倍体中含有二倍体植株不含有的酮类成分。 6 药用植物多倍体的鉴定药用植物多倍体的鉴定有多种方法，除传统的形态学、气孔观察、染色体核型分析方法外，还有近年来发展的流式细胞仪分析法和组培芽鉴定法。但一般而言，多倍体的鉴定都是以形态学为基础，组织化学、叶绿体计数为辅助，通过细胞学观察染色体数来界定。流式细胞仪分析法是一种较为有效而准确地染色体鉴定方法，其原理是先用染色剂对细胞进行染色，然后检测样品的荧光密度值，因为荧光密度与 DNA含量成正比，所以DNA含量的柱形图就可直观地反映出染色体的倍性水平。该方法虽然可以快速而准确地鉴定出染色体的倍性，但测定成本较高。组培芽材料丰富，取材方便，染色体很少变异，故用组培芽进行染色体鉴定是一种快速而有效的方法 。该方法从小染色体型的甜瓜属到大染色体型的百合和马铃薯都已获得了鉴定成功的报道。此外，用流式细胞仪(Flow cytometry)先测出单个细胞的DNA含量，再比较DNA 的含量可以推断出细胞染色体的倍性水平[3 ；此外，通过增殖系数法、高温胁迫法和低温胁迫法检测植株的倍性水平，平均符合度分别达88 、90 和80%口 。原位杂交技术的日益成熟为多倍体的鉴定提供了全新思路，GlSH、FlSH 的应用不仅能鉴定细胞的倍性水平，还能鉴定出亲本来源；RAPD和RFI P技术的成熟也为在分子水平上研究多倍体提供了新思路。 7 问题与前景近几十年来，随着国内外学者对多倍体研究的深入，不仅为进化提供了大量证据，而且在生产和育种等实践中产生了巨大的效益。然而，药用植物的多倍体研究和应用还存在许多问题。第一，药用植物多数为多年生木本或草本，花期过长，使获得的多倍体培育起来繁琐而耗时；第二，多倍体的诱导技术和鉴定技术尚需进一步完善，尤其分子水平上的研究更待深入；第三，诱变剂对植物材料的毒害作用过大，使诱变频率过低，所以寻找一种诱变频率高、对植物材料毒害作用小的诱变剂是一项迫在眉睫的工作；第四，嵌合体现象严重，真正同一倍性水平的多倍体频率过低，“混倍体”给以后的培育工作留下了难题，故如何降低嵌合率尚待研究；第五，获得的多倍体育性低，稳定耗时长，育种成本高，这虽然对全草类、根茎类、叶类、花类药用植物来说影响不大，但对以收获种子为目的的药用植物来说却是个致命的缺点。由于多倍体植物染色体数目增加，基因重新组合，并通过酶的作用影响到一系列蛋白质的合成和其它性状，从而能使一些次生代谢物和药用成分(对药用植物而言)的含量提高。所以，尽管药用植物在染色体加倍方面存在以上诸多问题，但它却更有着广阔的应用前景。当然，这项技术的成熟和完善尚需国内外研究者的共同努力。参考文献： [1] ZHANG H M(张汉明)，XU T F(许铁峰)，GUO M I (郭美丽)，et a1.Polyploid breeding of medicinal plant[J].Chinese 7’raditional and Herbal Drugs(中草药)，2002，33(7)：1—3(in Chinese). 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