通心络胶囊对大鼠缺血脑细胞超微结构及线粒体呼吸功能的保护作用(二)
R3、R4、RCR和P/O的测定
我们采用Clark氧电极法,取1 mg(蛋白含量)线粒体加入到2.5 ml反应体系中[反应介质为225 mmol/L甘露醇、75 mmol/L蔗糖、10 mmol/L氯化钾(KCl)、20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、3 mmol/L磷酸盐缓冲液、0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),以Tris-HCl调至pH 7.4],温度为30℃。孵育1 min后我们加入底物20 μl [氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)链为5 mmol/L谷氨酸+5 mmol/L苹果酸;FAD链为5 mmol/L琥珀酸],再加入45 mmol/L 二磷酸腺苷(ADP)10 μl,测得的氧耗速率为氧化呼吸链呼吸Ⅲ(R3);ADP完全磷酸化后测得的氧耗速率为氧化呼吸链呼吸Ⅳ(R4),呼吸控制率(RCR)=R3/R4,磷氧比(P/O)=ADP量/R3耗氧量。
透射电镜法
, http://www.100md.com
我们将固定后的1 mm3脑组织块取出,并按照常规电镜样品制备程序进行漂洗、脱水、浸透及用环氧树脂包埋;将环氧树脂包埋的脑组织标本进行超薄切片后,将切片捞至载网上,干燥后行铅铀双染;在透射电镜下观察网孔中细胞形态及其超微结构的改变并摄片。
统计学处理
我们的所有研究数据以x±s表示,并采用单因素方差分析统计方法,用SNK-q检验进行组间差别的两两比较。
结 果
通心络对大脑中动脉闭塞大鼠神经元超微结构的影响
我们采用透射电镜检测大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的神经元超微结构(见图,图A~E刊于6月7日A10版)。其结果显示,假手术组(图B)大鼠脑组织神经元细胞结构清晰,胞核中染色质分布均匀,胞浆中粗面内质网、线粒体、核糖体等细胞器结构完整;模型对照组(图A)大鼠脑组织神经元细胞明显水肿,胞核中染色质浓聚,胞浆消失,裸核,部分线粒体皱缩,基质电子密度增加,部分线粒体重度空泡化;通心络1.0 mg/kg(图D)、2.0 mg/kg(图C)组及尼莫地平组(图E)大鼠脑缺血后神经元细胞超微结构的上述改变明显减轻。
, 百拇医药
通心络对大脑中动脉闭塞大鼠线粒体呼吸功能的影响
为了解缺血对脑细胞线粒体呼吸功能的影响,以及通心络干预对其线粒体呼吸功能的保护作用,我们对MCAO大鼠缺血脑细胞线粒体NAD链和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)链进行了研究。我们通过对R3态、R4态、P/O、RCR等指标变化的分析,观察不同浓度通心络的干预效果,并与尼莫地平的干预效果进行比较。研究结果显示,MCAO大鼠模型对照组缺血脑细胞线粒体NAD链(见表1)和FAD链(见表2)的氧化呼吸链R3态、P/O、RCR明显低于假手术组,氧化呼吸链R4态明显高于假手术组;通心络1.0 mg/kg、2.0 mg/kg 组及尼莫地平组药物干预可明显抑制R3、P/O、RCR的降低;通心络1.0 mg/kg、2.0 mg/kg组R4的升高被抑制,与模型对照组比较差异显著;通心络0.5 mg/kg 组以上指标无显著变化(P>0.05)。
讨 论
通心络对线粒体呼吸链具有保护作用
, 百拇医药
细胞线粒体通过呼吸链对糖、脂肪和氨基酸等能源物质进行彻底氧化,将所产生的能量大部分贮存在三磷酸腺苷(ATP)中,以满足机体完成各种生理功能的需要。三羧酸循环和氧化磷酸化是细胞氧化的主要过程。前者在线粒体基质内进行,后者在线粒体内膜上进行,这要求线粒体结构完整和功能正常。RCR反映氧化磷酸化的偶联程度及磷酸化对氧化的调控作用。P/O是脱氢与氧化磷酸化反应的总结果,反映呼吸链各组分及磷酸化反应的完整性。本试验结果显示,模型对照组线粒体两条呼吸链的P/O、RCR明显低于假手术组,表明其呼吸功能明显受损,而通心络组这种损伤减轻,提示通心络对线粒体呼吸链具有保护作用。
通心络通过保护呼吸链减轻缺血脑神经元超微结构的改变
脑缺血时,细胞ATP含量迅速减少,大量Ca2+从细胞外向细胞内转移,细胞内Ca2+和线粒体内Ca2+大量聚积。钙超载使磷脂酶被激活,磷脂分解,造成内膜结构损伤,从而使线粒体氧化磷酸化作用减弱或停止,能量代谢障碍,由此产生一系列级联反应,导致细胞损伤。此外,脑缺血时产生的大量自由基、兴奋性氨基酸,酸中毒等也会损伤线粒体,导致线粒体功能障碍[3]。丧失正常功能的线粒体内储存着大量促凋亡分子,在各种凋亡信号的诱导下,它们可通过多条途径引起细胞凋亡[4]。而且,氧和葡萄糖供给减少引起的能量减少还可直接诱导细胞凋亡,其机制尚不十分清楚。本实验中电镜下可见模型组神经元细胞明显水肿,线粒体皱缩,重度空泡化等现象,通心络组MCAO大鼠脑神经元细胞超微结构的上述改变减轻,推测通心络通过改善细胞线粒体呼吸功能进而减轻恶性循环的程度,这可能是其保护作用的机制之一。
, 百拇医药
通心络通过改善线粒体呼吸功能增强细胞抵抗缺血损伤的能力
本研究还证实,通心络能降低脑组织及线粒体中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,抑制脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等自由基清除酶的降低(将另文发表)。其进一步说明通心络能改善线粒体呼吸功能,从而增强细胞抵抗缺血损伤的能力。
参考文献
[1] 顿 文,杨立志,周尔风.复方水蛭胶囊药理作用初探.山西医药杂志,1995,24(3):168-169.
[2] Longa EZ, Weinstein PR, Carison S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.
, 百拇医药
[3] Neumar RW. Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury.Ann Emerg Med, 2000,36(5):483-506.
[4] Green DR, Reed JC.Mitochondria and apoptosis. Science, 1998,281(5381):1309-1312.
表 1 通心络对脑缺血大鼠线粒体NAD链呼吸功能的影响(n=10, x±s)
组别 R3(nmol·min·-1mg-1)R4(nmol·min-1·mg-1)RCR(%) P/O
假手术组 21.81±1.213.91±0.255.58±0.313.98±0.41
模型对照组15.42±0.95**4.92±0.50*3.13±0.51**2.04±0.30**
, 百拇医药
尼莫地平组18.52±0.80ΔΔ4.01±0.544.62±0.24ΔΔ3.04±0.34ΔΔ
通心络
0.5 mg/kg 组16.54±0.924.90±0.383.38±0.142.20±0.17
通心络
1.0 mg/kg 组18.43±1.10ΔΔ4.22±0.27Δ4.37±0.73Δ3.14±0.44ΔΔ
通心络
2.0 mg/kg 组20.59±1.01ΔΔ3.80±0.29ΔΔ5.42±0.26ΔΔ3.59±0.42ΔΔ
NAD为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸, R3为氧化呼吸链呼吸Ⅲ态, R4为氧化呼吸链呼吸Ⅳ态,RCR为呼吸控制率,P/O为磷氧比。与假手术组比较**P<0.01, *P<0.05;与模型对照组比较ΔΔP<0.01, ΔP<0.05。
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表 2 通心络对脑缺血大鼠线粒体FAD链呼吸功能的影响(n=10, x±s)
组别 R3(nmol·min·-1mg-1)R4(nmol·min-1·mg-1)RCR(%)P/O
假手术组 25.94±1.545.02±0.615.17±0.434.79±0.60
模型对照组19.42±1.05**6.14±0.49*3.16±0.38**3.69±0.31*
尼莫地平组22.37±1.25Δ5.72±0.253.91±0.29Δ4.56±0.47Δ
通心络组
0.5 mg/kg 19.40±0.956.04±0.483.21±0.323.75±0.28
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通心络组
1.0 mg/kg 23.15±0.86ΔΔ5.40±0.27Δ4.06±0.41Δ4.47±0.61Δ
通心络组
2.0 mg/kg 24.47±1.01ΔΔ5.26±0.42Δ4.65±0.71Δ4.75±0.26Δ
FAD为黄素腺嘌呤二核苷酸,R3为氧化呼吸链呼吸Ⅲ态, R4为氧化呼吸链呼吸Ⅳ态,RCR为呼吸控制率,P/O为磷氧比。与假手术组比较**P<0.01, 与模型对照组比较*P<0.05, ΔΔP<0.01, ΔP<0.05。, 百拇医药
我们采用Clark氧电极法,取1 mg(蛋白含量)线粒体加入到2.5 ml反应体系中[反应介质为225 mmol/L甘露醇、75 mmol/L蔗糖、10 mmol/L氯化钾(KCl)、20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、3 mmol/L磷酸盐缓冲液、0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),以Tris-HCl调至pH 7.4],温度为30℃。孵育1 min后我们加入底物20 μl [氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)链为5 mmol/L谷氨酸+5 mmol/L苹果酸;FAD链为5 mmol/L琥珀酸],再加入45 mmol/L 二磷酸腺苷(ADP)10 μl,测得的氧耗速率为氧化呼吸链呼吸Ⅲ(R3);ADP完全磷酸化后测得的氧耗速率为氧化呼吸链呼吸Ⅳ(R4),呼吸控制率(RCR)=R3/R4,磷氧比(P/O)=ADP量/R3耗氧量。
透射电镜法
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我们将固定后的1 mm3脑组织块取出,并按照常规电镜样品制备程序进行漂洗、脱水、浸透及用环氧树脂包埋;将环氧树脂包埋的脑组织标本进行超薄切片后,将切片捞至载网上,干燥后行铅铀双染;在透射电镜下观察网孔中细胞形态及其超微结构的改变并摄片。
统计学处理
我们的所有研究数据以x±s表示,并采用单因素方差分析统计方法,用SNK-q检验进行组间差别的两两比较。
结 果
通心络对大脑中动脉闭塞大鼠神经元超微结构的影响
我们采用透射电镜检测大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的神经元超微结构(见图,图A~E刊于6月7日A10版)。其结果显示,假手术组(图B)大鼠脑组织神经元细胞结构清晰,胞核中染色质分布均匀,胞浆中粗面内质网、线粒体、核糖体等细胞器结构完整;模型对照组(图A)大鼠脑组织神经元细胞明显水肿,胞核中染色质浓聚,胞浆消失,裸核,部分线粒体皱缩,基质电子密度增加,部分线粒体重度空泡化;通心络1.0 mg/kg(图D)、2.0 mg/kg(图C)组及尼莫地平组(图E)大鼠脑缺血后神经元细胞超微结构的上述改变明显减轻。
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通心络对大脑中动脉闭塞大鼠线粒体呼吸功能的影响
为了解缺血对脑细胞线粒体呼吸功能的影响,以及通心络干预对其线粒体呼吸功能的保护作用,我们对MCAO大鼠缺血脑细胞线粒体NAD链和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)链进行了研究。我们通过对R3态、R4态、P/O、RCR等指标变化的分析,观察不同浓度通心络的干预效果,并与尼莫地平的干预效果进行比较。研究结果显示,MCAO大鼠模型对照组缺血脑细胞线粒体NAD链(见表1)和FAD链(见表2)的氧化呼吸链R3态、P/O、RCR明显低于假手术组,氧化呼吸链R4态明显高于假手术组;通心络1.0 mg/kg、2.0 mg/kg 组及尼莫地平组药物干预可明显抑制R3、P/O、RCR的降低;通心络1.0 mg/kg、2.0 mg/kg组R4的升高被抑制,与模型对照组比较差异显著;通心络0.5 mg/kg 组以上指标无显著变化(P>0.05)。
讨 论
通心络对线粒体呼吸链具有保护作用
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细胞线粒体通过呼吸链对糖、脂肪和氨基酸等能源物质进行彻底氧化,将所产生的能量大部分贮存在三磷酸腺苷(ATP)中,以满足机体完成各种生理功能的需要。三羧酸循环和氧化磷酸化是细胞氧化的主要过程。前者在线粒体基质内进行,后者在线粒体内膜上进行,这要求线粒体结构完整和功能正常。RCR反映氧化磷酸化的偶联程度及磷酸化对氧化的调控作用。P/O是脱氢与氧化磷酸化反应的总结果,反映呼吸链各组分及磷酸化反应的完整性。本试验结果显示,模型对照组线粒体两条呼吸链的P/O、RCR明显低于假手术组,表明其呼吸功能明显受损,而通心络组这种损伤减轻,提示通心络对线粒体呼吸链具有保护作用。
通心络通过保护呼吸链减轻缺血脑神经元超微结构的改变
脑缺血时,细胞ATP含量迅速减少,大量Ca2+从细胞外向细胞内转移,细胞内Ca2+和线粒体内Ca2+大量聚积。钙超载使磷脂酶被激活,磷脂分解,造成内膜结构损伤,从而使线粒体氧化磷酸化作用减弱或停止,能量代谢障碍,由此产生一系列级联反应,导致细胞损伤。此外,脑缺血时产生的大量自由基、兴奋性氨基酸,酸中毒等也会损伤线粒体,导致线粒体功能障碍[3]。丧失正常功能的线粒体内储存着大量促凋亡分子,在各种凋亡信号的诱导下,它们可通过多条途径引起细胞凋亡[4]。而且,氧和葡萄糖供给减少引起的能量减少还可直接诱导细胞凋亡,其机制尚不十分清楚。本实验中电镜下可见模型组神经元细胞明显水肿,线粒体皱缩,重度空泡化等现象,通心络组MCAO大鼠脑神经元细胞超微结构的上述改变减轻,推测通心络通过改善细胞线粒体呼吸功能进而减轻恶性循环的程度,这可能是其保护作用的机制之一。
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通心络通过改善线粒体呼吸功能增强细胞抵抗缺血损伤的能力
本研究还证实,通心络能降低脑组织及线粒体中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,抑制脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等自由基清除酶的降低(将另文发表)。其进一步说明通心络能改善线粒体呼吸功能,从而增强细胞抵抗缺血损伤的能力。
参考文献
[1] 顿 文,杨立志,周尔风.复方水蛭胶囊药理作用初探.山西医药杂志,1995,24(3):168-169.
[2] Longa EZ, Weinstein PR, Carison S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.
, 百拇医药
[3] Neumar RW. Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury.Ann Emerg Med, 2000,36(5):483-506.
[4] Green DR, Reed JC.Mitochondria and apoptosis. Science, 1998,281(5381):1309-1312.
表 1 通心络对脑缺血大鼠线粒体NAD链呼吸功能的影响(n=10, x±s)
组别 R3(nmol·min·-1mg-1)R4(nmol·min-1·mg-1)RCR(%) P/O
假手术组 21.81±1.213.91±0.255.58±0.313.98±0.41
模型对照组15.42±0.95**4.92±0.50*3.13±0.51**2.04±0.30**
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尼莫地平组18.52±0.80ΔΔ4.01±0.544.62±0.24ΔΔ3.04±0.34ΔΔ
通心络
0.5 mg/kg 组16.54±0.924.90±0.383.38±0.142.20±0.17
通心络
1.0 mg/kg 组18.43±1.10ΔΔ4.22±0.27Δ4.37±0.73Δ3.14±0.44ΔΔ
通心络
2.0 mg/kg 组20.59±1.01ΔΔ3.80±0.29ΔΔ5.42±0.26ΔΔ3.59±0.42ΔΔ
NAD为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸, R3为氧化呼吸链呼吸Ⅲ态, R4为氧化呼吸链呼吸Ⅳ态,RCR为呼吸控制率,P/O为磷氧比。与假手术组比较**P<0.01, *P<0.05;与模型对照组比较ΔΔP<0.01, ΔP<0.05。
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表 2 通心络对脑缺血大鼠线粒体FAD链呼吸功能的影响(n=10, x±s)
组别 R3(nmol·min·-1mg-1)R4(nmol·min-1·mg-1)RCR(%)P/O
假手术组 25.94±1.545.02±0.615.17±0.434.79±0.60
模型对照组19.42±1.05**6.14±0.49*3.16±0.38**3.69±0.31*
尼莫地平组22.37±1.25Δ5.72±0.253.91±0.29Δ4.56±0.47Δ
通心络组
0.5 mg/kg 19.40±0.956.04±0.483.21±0.323.75±0.28
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通心络组
1.0 mg/kg 23.15±0.86ΔΔ5.40±0.27Δ4.06±0.41Δ4.47±0.61Δ
通心络组
2.0 mg/kg 24.47±1.01ΔΔ5.26±0.42Δ4.65±0.71Δ4.75±0.26Δ
FAD为黄素腺嘌呤二核苷酸,R3为氧化呼吸链呼吸Ⅲ态, R4为氧化呼吸链呼吸Ⅳ态,RCR为呼吸控制率,P/O为磷氧比。与假手术组比较**P<0.01, 与模型对照组比较*P<0.05, ΔΔP<0.01, ΔP<0.05。, 百拇医药